Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Подходы к описанию равновесного связывания лигандов с нуклеиновыми кислотами 19
Глава 2. Функция распределения, описывающая связывание лигандов. Шум генетической экспрессии. Давление решеточного газа. Связывание хитозана с ДНК 60
Глава 3. Кооперативные взаимодействия между адсорбированными лигандами. Асимптотический метод анализа кривых связывания 117
Глава 4. Контактные взаимодействия между адсорбированными лигандами 148
Глава 5. Анализ распределения лигандов, связанных на матрицах специфично и неспецифично 173
Глава 6. Термодинамические модели, описывающие образование «мостиков» между молекулами нуклеиновых кислот в жидких кристаллах 203
Глава 7. Классификация моделей адсорбции, описывающих связывание лигандов с нуклеиновыми кислотами 224
Заключение 242
Выводы 246
Литература 248
- Подходы к описанию равновесного связывания лигандов с нуклеиновыми кислотами
- Функция распределения, описывающая связывание лигандов. Шум генетической экспрессии. Давление решеточного газа. Связывание хитозана с ДНК
- Кооперативные взаимодействия между адсорбированными лигандами. Асимптотический метод анализа кривых связывания
- Контактные взаимодействия между адсорбированными лигандами
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность. Изучение регуляции экспрессии генов является одной из центральных задач молекулярной биологии. Существует несколько механизмов регуляции экспрессии генов, в которых регуляция осуществляется посредством обратимого связывания белков с ДНК или РНК. Такое связывание может быть описано в рамках представлений о физической адсорбции лигандов на матрицах нуклеиновых кислот. Матрицы нуклеиновых кислот (НК) в этом случае рассматриваются как адсорбенты, несущие решетки реакционных центров, на которых обратимым образом связываются молекулы лигандов. Адсорбция происходит посредством многоточечного связывания лигандов с реакционными центрами матриц. Сейчас можно считать установленным, что подобным образом с НК связывается целый ряд лигандов, в том числе олигонуклеотиды, антибиотики и биологически активные соединения различного происхождения. Однако многие характеристики такого связывания до сих пор неясны. В ряде случаев между лигандами существуют кооперативные взаимодействия, более того, показано, что в модельных системах связывание лигандов может влиять на конформационное состояние матриц НК и влияние это распространяется на участки матриц, отстоящие от места связывания (аллостерический эффект).
Процессы регуляции экспрессии генов включают в себя координированное связывание разных лигандов. В живой клетке ДНК покрыта лигандами разных типов, и связывание одних лигандов может влиять на связывание других (например, при связывании один лиганд может закрывать целый участок матрицы, делая его недоступным для других молекул лиганда). Все эти свойства связывания необходимо моделировать: в экспериментах используются модельные системы, которые позволяют выяснить определенные свойства изучаемых объектов, и в теории необходимо сформулировать ряд моделей, которые могли бы описать связывание нескольких лигандов, позволили бы рассмотреть влияние адсорбции лигандов на состояние матрицы и другие явления, наблюдаемые в молекулярной биологии. Изучение таких моделей позволит анализировать изотермы адсорбции, диаграммы фут-принтинга и другие количественные характеристики, которые могут быть получены при исследованиях молекулярно-биологических систем.
До настоящего времени применение теории адсорбции к связыванию лигандов с НК было эпизодическим. Изучая связывание разных лигандов с матрицами НК, исследователи чаще всего пользовались одной моделью, в которой учитываются контактные кооперативные взаимодействия между ближайшими соседними адсорбированными лигандами, изредка предлагались новые модели, но ни систематического описания разных моделей адсорбции, ни сравнительного изучения их свойств до последнего времени в литературе не существовало. По мере рассмотрения все более сложных систем возникали более сложные модели адсорбции, но не существовало описания разных моделей с единой точки зрения. Между тем, без такого описания трудно надеяться на то, что выбранная исследователем модель будет единственно возможной. Исследователей интересует, как правило, не получение уравнений связывания и расчет изотерм адсорбции в рамках той или иной модели, а решение "обратной" задачи: выбор модели адсорбции на основании количественных данных. Однако решение этой задачи до настоящего времени было затруднено из-за отсутствия классификации моделей адсорбции.
Цель работы и задачи исследования. Целью работы является развитие теории адсорбции лигандов на матрицах НК и применение ее для анализа молекулярно-биологических систем. Для достижения этой цели необходимо формирование научного аппарата теории адсорбции, включающего "инвентаризацию" методов статистической механики и математических подходов, используемых в данной области, описание терминологии и введение в рассмотрение широкого набора моделей адсорбции. Задачами исследования являются:
1) Описание адсорбции лигандов на матрицах НК с единой точки зрения. Разработка методов анализа изотерм адсорбции.
2) Рассмотрение изотерм адсорбции разных видов. Анализ моделей адсорбции с дальними кооперативными взаимодействиями между лигандами.
3) Анализ моделей, в которых на матрицах связываются два разных лиганда и между лигандами существуют кооперативные взаимодействия.
4) Изучение специфического и неспецифического связывания лигандов на фрагментах ДНК.
5) Анализ явления, которое получило название «шум генетической экспрессии» (речь идет об экспериментах по изучению связывания lac-репрессора в клетке E.coli).
6) Разработка методов, позволяющих рассчитывать диаграммы фут-принтинга. Исследование связывания бис-нетропсина с фрагментом ДНК.
7) Изучение связывания с ДНК молекул, нейтрализующих заряды ДНК (на примере хитозана, связывание которого приводит к формированию жидкокристаллических дисперсий ДНК).
8) Моделирование явления координированной адсорбции (на примере образования наномостиков при связывании лигандов с матрицами ДНК в составе жидкокристаллической дисперсии).
9) Проведение классификации описанных нами и известных в литературе моделей адсорбции.
Научная новизна. В работе впервые введен в рассмотрение целый ряд новых моделей адсорбции. Впервые разработан метод, позволяющий анализировать изотермы адсорбции для широкого класса кооперативных систем. Применение этого метода позволило установить соответствие между формой изотермы адсорбции и моделью адсорбции. Показано, что этот метод позволяет различить модели, в которых взаимодействие между лигандами приводит к образованию ассоциатов произвольного размера и модели, в которых образуются димеры из связанных на матрице молекул лиганда. Продемонстрирована возможность восстановления потенциала кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами.
Рассмотрен ряд моделей, позволяющих описывать S-образный вид кривых связывания. Впервые проведена классификация моделей адсорбции, выделены разные типы кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами и описаны модели, учитывающие влияние связывания лигандов на матрицы НК.
Построены алгоритмы, позволяющие рассчитывать вероятности специфичного связывания лиганда на разных местах молекулы ДНК с известной последовательностью пар оснований и сравнивать рассчитанные профили распределения лиганда с экспериментальными диаграммами фут-принтинга.
Получены уравнения, описывающие связывание лигандов с матрицами НК для широкого класса моделей адсорбции. Описаны и реализованы алгоритмы, позволяющие анализировать экспериментальные кривые связывания и оценивать геометрические и энергетические параметры модели адсорбции.
При анализе адсорбционных систем мы рассчитывали не только средние значения числа адсорбированных на матрице лигандов, но и стандартные отклонения от средних значений. Функция распределения дает более полную информацию о равновесном связывании лигандов с матрицами НК и позволяет более детально описать связывание. Дисперсия среднего числа адсорбированных лигандов позволяет оценить «шум» процесса адсорбции. Практическая ценность работы состоит в том, что на основании разработанных подходов удается получить информацию о характере кооперативных эффектов в адсорбционной системе. Такие эффекты наблюдаются при связывании с ДНК как белковых факторов, регулирующих экспрессию генов, так и разного рода низкомолекулярных лигандов, в том числе лекарственных соединений. В работе развиты представления, позволяющие проводить анализ как модельных экспериментальных систем, так и реальных биологических систем. В работе продемонстрировано несколько примеров такого анализа. Показано, что шум генетической экспрессии, измеренный in vivo для E.coli, может быть обусловлен шумом процесса адсорбции.
Полученные в работе уравнения, описывающие кооперативное связывание двух разных лигандов с матрицами НК, применяются для описания адсорбции лигандов в модельных системах.
Проведен анализ расположения нуклеосом на фрагменте ДНК, показано, что такое расположение характеризуется определенной дисперсией.
На примере лекарственного соединения бис-нетропсина продемонстрирован расчет диаграммы фут-принтинга. Такой анализ может быть применен и к другим биологически активным соединениям: компьютерный фут-принтинг позволяет также предсказывать вероятности связывания лигандов, имеющих повышенное сродство к определенным последовательностям пар нуклеотидов на заданных фрагментах ДНК.
Изучено связывание молекул антибиотика дауномицина и ионов меди с матрицами НК в составе частиц жидкокристаллической дисперсии (ЖКД). В работах Ю.М. Евдокимова и соавторов показано, что в результате такого связывания образуются наномостики между молекулами ДНК, сближенными в составе ЖКД. Нам удалось описать образование таких мостиков в рамках модели координированной адсорбции. Анализ экспериментальных данных позволил оценить параметры образования наномостиков. Практическая ценность этих результатов значительна: в последнее время молекулярные конструкции широко используются в создании биосенсоров, и количественное описание формирования таких структур открывает путь к конструированию биосенсоров.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Биофизика нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов» (Таллинн, 1981), 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Конгрессе европейских биохимических сообществ (Прага, 1984), Международном симпозиуме по физикохимии ДНК и функционированию генома (Тбилиси, 1987), Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1992), Симпозиуме «Математические теории биологических процессов» (Калининград, 1993), Совещании «Геном человека» (Черноголовка 1993), Международной конференции «Молекулярная биология на границе XXI века» (Москва 1994), Международных конференциях по биомолекулярной структуре и динамике (Албани, 2001, 2003), П Всероссийском съезде биофизиков (Воронеж, 2004), 22-ом Международном биофизическом симпозиуме (Святой Стефан - Белград, 2004), Международной конференции «Гидратация и термодинамика молекулярного узнавания» (Цахкадзор, 2005) и других конференциях.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 47 печатных работ в ведущих международных и отечественных научных журналах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав и заключения. Диссертация изложена на 260 страницах, содержит 60 рисунков и три таблицы.
Благодарности. Автор считает приятным долгом поблагодарить своего научного консультанта Г.В. Гурского, а также А.С.Заседателева, Ю.М.Евдокимова, Н.Г.Есипову, А.С. Крылова, С.А.Стрельцова, Бошко Йовановича, Александра Вольфа и всех соавторов, студентов и аспирантов МГУ и МФТИ, за полезные обсуждения и помощь в работе.
Подходы к описанию равновесного связывания лигандов с нуклеиновыми кислотами
В рамках решеточной модели адсорбции реальная молекула НК представляется в наиболее общем виде - как одномерная матрица, или линейная решетка центров связывания. Эти центры связывания называются "реакционными центрами" [3,4,22]. Молекула лиганда также представляется в общем виде, как структура, которая несет одну или несколько групп атомов, способных вступать во взаимодействие с центрами связывания матрицы. Эти группы атомов в рамках решеточной модели связывания называются "реакционными центрами" лиганда. Обычно считается, что лиганд может образовывать комплекс с рядом расположенных подряд центров связывания матрицы, которые называются "связывающим местом" (см. Рис. 2 а).
Следует заметить, что реальные взаимодействия лигандов с ДНК могут развиваться по разным сценариям, в зависимости от размера участка ДНК, вовлеченного во взаимодействие с лигандом, молекулярной массы молекулы лиганда и молекулярной массы самой молекулы ДНК. Если в качестве лигандов выступают низкомолекулярные соединения, то естественно предположить, что адсорбция лиганда не искажает (или незначительно искажает) молекулу ДНК, выступающую в роли матрицы: таким образом, сама "базовая структура" модели, а именно регулярная решетка центров связывания, не разрушается при адсорбции. Другая ситуация может возникнуть, если в качестве лиганда выступает макромолекула белка или даже несколько белков (например, комплекс белков, входящих в состав ДНК-полимеразы).
Возможно притяжение или отталкивание между ближайшими соседними на матрице лигандами. решетка реакционных центров не разрушается при адсорбции лигандов на матрице. В зависимости от соотношения размеров матрицы ДНК и молекулы лиганда, а также в зависимости от природы взаимодействий ДНК-лиганд в качестве реакционных центров матрицы могут выступать не только отдельные атомы пар оснований, но и целые участки ДНК, включающие группы атомов сахарофосфатного остова. Так как речь идет о физической адсорбции, то взаимодействие между центрами связывания матрицы и реакционными центрами лиганда имеет обратимый характер. Обычно это вандерваальсовы или диполь-дипольные взаимодействия (впрочем, для описания связывания лигандов природа взаимодействий не имеет значения: важно, чтобы они были обратимыми). Энергия таких взаимодействий составляет, как правило, несколько кТ. Модель адсорбции предполагает описание взаимодействий между адсорбированными лигандами. Характер таких взаимодействий определяет специфику модели адсорбции (Рис. 2 б). С точки зрения статистической механики поведение адсорбированных лигандов на матрице во многом аналогично поведению одномерного решеточного газа частиц с взаимодействием. Такие взаимодействия могут включать как стерическое отталкивание между молекулами лигандов, конкурирующими за одни и те же центры связывания на ДНК (в этом случае принято говорить об "исключенном объеме" молекул решеточного газа), так и электростатические взаимодействия между атомами ближайших соседних молекул лиганда, сближенными на матрице. Заметим, что терминологическое словосочетание "реакционный центр", которое используется в литературе для обозначения одного центра связывания лиганда на матрице [3, 4, 22], может ввести в заблуждение: с понятием реакции обычно связывают в химии ряд процессов, имеющих необратимый характер, в то время как процесс физической адсорбции является обратимым. Здесь мы будем использовать наряду с термином "реакционный центр", как эквивалентный, термин "центр связывания". С другой стороны, существует устойчивое сочетание слов "реакционный центр" фермента. Такой центр включает в себя место связывания лиганда. Если рассматривать адсорбцию на ДНК лиганда, размер которого меньше радиуса молекулы ДНК, то понятие реакционного центра матрицы будет в чем-то аналогично понятию "реакционный центр фермента": связывание лиганда здесь происходит так же многоточечным образом. Однако связывание лиганда в реакционном центре фермента является первым актом в серии процессов, которые приводят к химической трансформации лиганда, в то время как связывание лиганда с ДНК не приводит к изменению его структуры.
Действительно, рассмотрим пример связывания молекулы дистамицина А с ДНК. В соответствии с молекулярной моделью комплекса, предложенной Заседателевым и соавт. [25, 26], дистамицин А погружен в малую бороздку ДНК таким образом, что NH группы лиганда выступают в качестве доноров водородных связей, а акцепторами служат N3 атомы аденина и 02 атомы тимина (Рис.3). Кроме того, концевая положительно заряженная NH3 группа лиганда располагается глубоко в узкой бороздке, в области максимальной плотности отрицательного электростатического потенциала. Рентгеноструктурный анализ в целом подтвердил эту модель, добавив лишь факт наличия бифуркационных водородных связей: одна NH группа лиганда может образовать одновременно сразу две водородные связи Рис. 3. Схематическое изображение модели комплекса дистамицина А с участком ДНК (по Заседателеву [25,26]). NH группы антибиотика образуют водородные связи с акцепторами водородных связей - азотами и кислородами расположенных подряд четырех AT пар ДНК. с N3 атомом аденина и 02 атомом тимина [27]. Одна химическая группа лиганда взаимодействует сразу с двумя разными химическими группами матрицы. Целый ряд атомов матрицы формируют один центр связывания для одной группы лиганда. С другой стороны, можно представить себе ситуацию, когда белок-лиганд намного больше размера участка ДНК-матрицы, с которым он взаимодействует. В этом случае целый виток ДНК может рассматриваться в качестве одного реакционного центра матрицы. Предсказанная на основании анализа первичных экспериментальных данных по адсорбции молекулярная модель комплекса нетропсина на ДНК стала сейчас общепринятой, что можно рассматривать как одно из самых значительных достижений применения теории физической адсорбции к анализу взаимодействий лигандов с ДНК.
Функция распределения, описывающая связывание лигандов. Шум генетической экспрессии. Давление решеточного газа. Связывание хитозана с ДНК
Пусть в растворе при постоянной температуре Т и постоянном давлении/? находятся молекулы лиганда и молекулы матрицы, на которой может адсорбироваться лиганд. Рассмотрим случай, когда полимер представляет собой линейную цепочку из N связывающих центров, и лиганд при связывании покрывает L центров, расположенных подряд. Эти L центров мы будем называть связывающим местом лиганда .
Взаимодействие одной молекулы лиганда с одним связывающим местом на матрице, если рассматривать этот процесс изолировано от прочих процессов адсорбции и десорбции лигандов, характеризуется константой К. Эту константу в англоязычной научной литературе называют "intrinsic binding constant", мы будем назвать ее константой связывания, вкладывая в это наименование тот смысл, что изменение свободной энергии AG при связывании лиганда в этом случае рассматривается отдельно от других процессов в системе (т.е. не учитывается ни изменение числа размещений лигандов на матрице, ни взаимодействие с другими адсорбированными лигандами). Изменение свободной энергии адсорбционной системы при связывании q лигандов на матрице длиной N мы обозначаем вслед за Скетчардом посредством &F(q, N) (смотри (1)). В случае химического равновесия адсорбция лиганда (как переход лиганда из свободного состояния в связанное, то есть из одной фазы в другую), не изменяет свободную энергию системы: AF(q, N) = 0.
В качестве подсистемы описанной выше системы рассмотрим одну матрицу с адсорбированными лигандами. Свойства такой подсистемы определяются наличием неопределенности, обусловленной статистической энтропией. Действительно, если известно, что на одной матрице связано q лигандов, существует неопределенность: какие именно из 7V реакционных центров заняты лигандами, а какие свободны? Мерой такой неопределенности служит статистическая (или конфигурационная) энтропия матрицы с адсорбированными лигандами. Эта часть энтропии обусловлена числом размещений в линейной последовательности q связывающих мест, покрытых адсорбированными лигандами nN - q L реакционных центров, не взаимодействующих с лигандами (мы их будем называть «свободными»).
Представим следующую ситуацию: среди всех матриц в растворе мы наугад выбираем одну.Функция распределения не зависит от концентрации матриц в растворе, но имеет явственную зависимость от длины полимера N, что же касается зависимости от концентрации свободных молекул лиганда т, то область значений концентрации, при которых происходят значимые изменения в функции распределения, определяется величиной константы равновесия К. Действительно, P(q) зависит от произведения Km.
При связывании q лигандов возникает та неопределенность, которую нельзя разрешить с помощью измерения общих физико-химических характеристик системы в растворе. Действительно, предположим, что мы можем измерить концентрацию фракции тех матриц в растворе, на которых связано q молекул лиганда. По-видимому, это наиболее детальная информация о системе, которую можно получить. В принципе, возможно отобрать фракцию матриц с определенным числом адсорбированных лигандов. Однако мы не сможем определить, как именно расположены лиганды на одной матрице в какой-то момент времени (то есть не сможем сделать «мгновенное фото» матрицы, из которого было бы ясно, какие реакционные центры закрыты лигандом, а какие свободны).
Представим на простейшем примере, как может выглядеть наиболее полная информация о взаимодействии лиганда с ДНК в случае физико-химического эксперимента в растворе. 2.2.а Связывание лиганда, который занимает один реакционный центр матрицы
Предположим, что лиганд несет положительно заряженную группу атомов, которая нейтрализует заряды сахаро-фосфатного остова ДНК, соответствующие одной паре оснований. Матрицы ДНК с разным числом зарядов будут по-разному двигаться в геле под воздействием электрического поля - и при помощи гель-электрофореза или подобной техники мы можем измерить концентрацию матриц, на которых связано q молекул лиганда.
Рассмотрим систему, состоящую из одной матрицы. Эта система может находиться в N + 1 состоянии: матрица может быть пуста, может содержать один, два, ... Nлигандов. Вероятность того, что матрица будет находиться в определенном состоянии, экспоненциально зависит от свободной энергии, соответствующей этому состоянию. Эта вероятность определяет число матриц в растворе, на которых связано q лигандов.
Кооперативные взаимодействия между адсорбированными лигандами. Асимптотический метод анализа кривых связывания
Рассмотрим связывание протяженного лиганда на матрице в рамках модели, описанной выше (см. раздел 2.1). Если на матрице длиной N адсорбировано q молекул лиганда и эти лиганды не могут «свешиваться» с концов матрицы, то матрицу с адсорбированными лигандами можно представить как последовательность из элементов двух типов: свободных центров и связывающих мест, покрытых лигандами. Зададимся вопросом: сколько раз в этой последовательности будет встречаться участок из L свободных реакционных центров, расположенных подряд? Иными словами, сколько будет в такой последовательности свободных связывающих мест, на которых может адсорбироваться лиганд из раствора?
В случае, когда общее число элементов обоего типа в последовательности - свободных центров и покрытых лигандом связывающих мест равно N- q L + q , число связывающих мест, не покрытых адсорбированными лигандами (потенциальных мест для связывания), можно определить следующим образом. Представим, что последовательность свободных центров и покрытых мест связывания является результатом проведения испытаний по схеме Бернулли с двумя исходами.
Это свойство изотерм адсорбции в представлении Скетчарда оказывается общим, ниже мы покажем, что оно определяется базовыми свойствами модели адсорбции, которая описывает связывание протяженного лиганда и является общим для широкого класса моделей, в том числе и для моделей, которые учитывают кооперативные взаимодействия между адсорбированными лигандами.
В более или менее широкой области заполнений г rmax = 1/1 изотерма адсорбции, соответствующая кооперативному связыванию лиганда, будет подобна изотерме, соответствующей некооперативному связыванию лиганда той же длины L. Коэффициент этого подобия и размер области, где такое подобие сохраняется, несут информацию о кооперативных взаимодействиях между адсорбированными лигандами.
Рассмотрим изотерму адсорбции в представлении Скетчарда в случае, когда между адсорбированными лигандами существуют кооперативные взаимодействия. В общем виде такая изотерма представляет собой зависимость г/т =у(г). Константу связывания лиганда с изолированным связывающим местом на полимере К и размер лиганда L можно определить по пересечению такой кривой с осью ординат и по максимально возможному заполнению rmax= VL , соответственно (см. [3]). При помощи (52) и (54) в этом случае можно рассчитать изотерму, соответствующую некооперативному связыванию лиганда, которое характеризуется теми же параметрами (К, L). Эту изотерму мы будем называть опорной.
Известны данные о существовании неконтактных кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами (см., например, [87, 113,117]). Такие взаимодействия могут возникать, в частности, в случае, когда ДНК образует различные третичные структуры, так, что удаленные в линейной последовательности адсорбированные молекулы лиганда оказываются пространственно сближенными. На некоторые расстояния вдоль матрицы могут распространяться взаимодействия, обусловленные искажениями конформации ДНК в месте связывания лиганда, локальными изменениями сольватации ДНК и т.п. Все взаимодействия такого рода мы будем называть неконтактными взаимодействиями, в отличие от контактных взаимодействий, которые возникают только в том случае, когда концы двух ближайших соседних лигандов занимают два последовательных реакционных центра матрицы.
Система уравнений адсорбции в случае, когда между адсорбированными лигандами существуют неконтактные взаимодействия, была получена впервые Заседателевым и соавт. [3]. Здесь мы построим решение этой системы и покажем, как можно рассчитывать и анализировать изотермы адсорбции, соответствующие неконтактным взаимодействиям.
Заполнение матрицы лигандом г является интегральной характеристикой адсорбции. Для того, чтобы более детально описать расположение лигандов, введем в рассмотрение у(ї) - число пар лигандов, адсорбированных на расстоянии / свободных центров матрицы друг от друга. Величины y(i) нормированы на один реакционный центр матрицы.
Определенному расположению лигандов на полимере будет соответствовать определенная зависимость y(z ). Зависимость такого типа была введена для одномерных систем в работе Клейна и Пригожина [114], в применении к задачам адсорбции значения y(z) рассматривались в работе Заседателева и соавт. [3]. Зависимость у(г ) является важной характеристикой адсорбции, позволяющей установить связь между формой изотермы адсорбции и характером расположения лигандов на матрице.
При любых значениях заполнения г эта. зависимость в случае некооперативного связывания монотонно убывает. Пусть между адсорбированными лигандами существуют кооперативные взаимодействия. Обозначим через Д/(/) свободную энергию взаимодействия между двумя адсорбированными молекулами лиганда, ближние концы которых разделяют і свободных центров матрицы. Если все АД/) равны нулю, то характер расположения лигандов на матрице определяется соотношением (63).
В ситуации, когда между адсорбированными лигандами существуют кооперативные взаимодействия, все различные расположения лигандов на матрице уже не будут равновероятны и, чтобы найти выражение для Р, и получить уравнения адсорбции, необходимо немного изменить математическую модель, находящуюся в основании нашего подхода.
Контактные взаимодействия между адсорбированными лигандами
Пусть в растворе находятся в равновесии матрицы ДНК с адсорбированными лигандами двух типов и свободные молекулы лигандов. ДНК представляет собой матрицу из ^эквивалентных центров (пар оснований). Связываясь, лиганд типа а (а =1, 2) закрывает подряд La мономерных центров матрицы так, что ни одно звено матрицы не может быть занято двумя молекулами лиганда. Эти La центров мы будем называть связывающим местом лиганда а на матрице. Обозначим через та концентрацию свободного лиганда а в растворе, га - заполнение матрицы лигандом а (число адсорбированных лигандов в расчете на одно звено матрицы). Если N » L\, L2 (приближение бесконечной матрицы), уравнения адсорбции не будут зависеть от 7V. Все величины, характеризующие матрицу с адсорбированными лигандами, удобно нормировать в этом случае на одно звено матрицы. Например, число адсорбированных лигандов на матрице г- r\ + r2, число центров матрицы, не накрытых адсорбированными лигандами (1 - r{L{ - r2L2).
Пусть Ка - константа связывания лиганда а с изолированным связывающим местом, при связывании на котором не образуется контактов с другими адсорбированными лигандами (Рис. 31 а). Если центр матрицы, граничащий справа со связывающим местом лиганда а, занят левым концом лиганда /? (/? = 1, 2), то при связывании лиганда а образуется контакт между правым концом лиганда а и левым концом лиганда /? (Рис. 31 б). Константа связывания лиганда а на таком месте равна Касоар. Множитель шармы будем называть параметром кооперативных взаимодействий между лигандами (а, /?), находящимися в контакте.
Имеется всего четыре параметра со а р, описывающих контактные кооперативные взаимодействия между адсорбированными лигандами: соц, (У 12, &>2i и ^22 Если при связывании лиганда а образуется два контакта - с адсорбированным слева лигандом /? и адсорбированным справа лигандом v (v =1, 2), то константа связывания равна щaКасоа v.
Обозначим через ура число пар лигандов (/?, а), в которых правый конец лиганда |3 контактирует с левым концом лиганда а. Число лигандов а, левый конец которых не контактирует с другими лигандами, равно га-уіа-у2а (напомним, что га и у р a нормированы на одно звено матрицы).
Чтобы найти уравнение адсорбции, запишем условие химического равновесия для связывания лиганда с изолированным связывающим местом. Число лигандов типа а, адсорбированных на таких местах, задается при помощи (91). Число изолированных связывающих мест, остающихся свободными при некотором заполнении матрицы лигандами, найдем следующим образом. Представим матрицу с адсорбированными лигандами как последовательность элементов двух типов: свободных центров матрицы и групп лигандов. Группой лигандов мы будем называть один лиганд, адсорбированный на изолированном связывающем месте или несколько лигандов, адсорбированных так, что все ближайшие соседние лиганды находятся в контакте.
Каждая группа отделена от соседней по крайней мере одним центром матрицы. Учтем этот факт при помощи специального приема: будем считать центр матрицы со следующей за ним группой элементом одного класса, а свободный центр матрицы, не предшествующей группе лигандов - элементом другого класса.
Введем в рассмотрение у„в (0 — число пар лигандов (а, (3) таких, что лиганды а и |3 разделяют / свободных звеньев полимера. Тогда уар(0)= уар. Зависимости Уар (0 детально характеризуют расположение лигандов на полимере.
Многие лиганды при связывании с ДНК образуют два различных типа комплексов. Если эти комплексы имеют различную длину Ь\Ф L2, то при заполнениях ДНК лигандом, близких к насыщающему значению гмакс, комплексы, имеющие большую длину, будут вытесняться. Это вытекает из того факта, что заполнение ДНК комплексом типа а соответствует ra~ PL. Если га —> гмакс, то Р —» 0 и Г[ » г2 при Lx Если L\ = L2, при га —> гмакс на матрице сосуществуют оба типа комплекса. Случай L\ = L2 представляет особый интерес, потому что двойная спираль ДНК имеет ось симметрии второго порядка и два типа комплексов лиганда с ДНК могут быть обусловлены связыванием лиганда на матрице ДНК в двух альтернативных ориентациях. В этом случае возможны два способа упорядоченного расположения лигандов на ДНК, соответствующие двум различным типам кооперативных взаимодействий между адсорбированными лигандами.Похожие диссертации на Статистическая термодинамика связывания лигандов с ДНК и РНК
