Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
Глава 2.1. Строение молекулы иммуноглобулина
I. Роль иммуноглобулинов и в иммунном ответе. Подклассы
2. Первичная структура молекулы. Дисульфидные связи 9
3. Домены и организация фрагментов. Размеры молекулы
4. Миеломные иммуноглобулины - объект, с помощью которого была выяснена структура молекулы иммуноглобулина
Глава 2.2. Сравнительная характеристика свойств нормальных и миеломных иммуноглобулинов 16
I. Общие закономерности, наблюдаемые в строении нормальных и миеломных иммуноглобулинов
2. О некоторых отличиях свойств миеломных иммуноглобулинов от нормальных, обнаруживаемых различными методами 17
3. Две точки зрения на природу миеломных иммуноглобулинов и их экспериментальное
обоснование 18
4. Предполагаемый характер различий между нормальными и миеломными иммуноглобули -
нами & и возможность экспериментального изучения этих различий. 23
Глава 2.3. Применение метода монослоев к изучению белков 25
I. Сущность метода монослоев
2. Характер информации, получаемой при изучении монослоев белков ЗГ
3. Монослои иммуноглобулинов.. ЭД
4. Монослои белков как модель для изучения их поведения на биологических мембранах. Иммуноглобулиновые рецепторы лимфоцитов.
5. Монослои белков на границе вода-масло... 44 б. Цели и задачи данного исследования... 47
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 50
Глава 3.1. Материалы и методы
I. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. Измерение поверхностного потенциала 54
3. Препараты 58
4. Методика нанесения монослоя. Определение конформации и ориентации молекул из $-А
зависимостей 59
Глава 3.2. Результаты и обсуждение 60
I. Определение изо электрической точки белка в монослое на границе вода-воздух. Зависимость конформационной стабильности JuG" от ОН водной фазы
2. Сравнительная характеристика поведения в монослоях поликлональных 3fl& нормальной сыворотки и более гомогенных противо-гаптенных Ja(j антител 69
3. Конформационная стабильность и ориентация в монослоях на границе вода-воздух миеломных За& человека 75
4. Изучение монослоев Зш на границе вода~масло 89
5. Индивидуальные различия менаду миеломными белками, обнаруживаемые в монослоях
на границе вода-масло 99
4. ВЫВОДЫ 108
5. СПИО0К ЛИТЕРАТУРЫ НО
- Роль иммуноглобулинов и в иммунном ответе. Подклассы
- Первичная структура молекулы. Дисульфидные связи
- Измерение поверхностного потенциала
Роль иммуноглобулинов и в иммунном ответе. Подклассы
Иммуноглобулины & (Зо&у - наиболее подробно изученный класс иммуноглобулинов. Это объясняется двумя причинами. Во-первых, JflG составляют основную массу иммуноглобулинов сыворотки (70-60$ от общего количества Ж /15,16,52/) и поэтому представляют собой наиболее доступный объект для изучения. Во-вторых, что особенно следует подчеркнуть, они выполняют в иммунном ответе две важные функции. Являясь рецепторными белками лимфоцитов иммунологической памяти, они включают клетку в процесс клональной пролиферации /17,64, 130/. Механизм включения клетки в процесс пролиферации неизвестен, но установлено, что первичным актом является взаимодействие рецепторных иммуноглобулинов с гомологичными антигенами. Конечным итогом клональной пролиферации лимфоцитов является синтез антител против данного антигена, молекулы антител ответственны за гуморальный иммунный ответ, то есть за иммобилизацию антигена, его разрушение и вывод из организма. Большая часть антител относится к классу ]ш /11,15,16,17,52,133/.
Почти у всех подробно изученных видов животных имеется несколько подклассов дйи , обозначаемых обычно буквами "tt"» "6" и "С" /16/. У человека найдено четыре подкласса Ц6 . Из них белков подкласса trl содержится больше всего - 70р от общего количества иммуноглобулинов. Белки подклассов (j 2, &3 и &4 составляют 18,8 и 3$ соответственно. Молекулы разных подклассов обладают несколько отличающимися друг от друга биологическими свойствами. Например, Зо&4 не связывает комплемент, а 3Q&2 не фиксируется на коже /67/.
Функции и биологическая активность антител тесно связаны с их строением. Изучение строения молекул иммуноглобулинов позволило установить причину их высокой специфичности по отношению к соответствующим антигенам. Выяснение генетической основы разнообразия антител /20/ имеет огромное значение не только для иммунологии, но и для биологии.
Если структурные основы высокой специфичности антител изучены достаточно полно и подробно, то связь конформации молекул о выполняемыми ими эффекторными функциями окончательно не выяснена. Установлена локализация участков молекулы, отвечающих за те или иные эффекторные функции. Неясным остается конкретный механизм конформационных перестроек молекул, происходящих после взаимодействия с антигеном и приводящих к активации центров, связывающих комплемент,или к передаче сигнала о начале клеточной пролиферации от мем -бранных Jtt к внутриклеточным органеллам.
Первичная структура молекулы. Дисульфидные связи
Как и все иммуноглооулины, «Щ& является гликопротеи-дом; содержание углеводов в нем составляет около % /16,1$, 52,57/.
Молекулярный вес иммуноглобулинов & различных видов животных равен 140-150 тыс/16,18,52,57,126,133/. Молекула построена из двух идентичных тяжелых (Н) полипептидных цепей (примерно 450 аминокислотных остатков, молекулярный вес 50-55 тыс.,) и двух идентичных легких ( L ) цепей (примерно 210 аминокислотных остатков, молекулярный вес 20-25 тыс.) /18,52,57,101/.
Анализ первичной структуры тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов показывает наличие двух резко отличающихся друг от друга областей - вариабельной, или изменчивой (V ), и постоянной ( С ) (рис.1;. Различия между классами (подклассами) иммуноглобулинов обусловлены строением С-областей тяжелых цепей. Аминокислотные последовательности С областей легких цепей обусловливают различия между двумя типами легких цепей - каппа (ЭС) и лямбда (А). Молекулы иммуноглобулинов определенного класса (подкласса) и типа отличаются друг от друга только по аминокислотной последовательности V-областей, зависящей от специфичности антител, тогда как L-области у них идентичны, за исключением небольших отличий, обусловливающих аллотипические вариации /11,126/, Различия между аминокислотными последовательностями v -областей в большинстве своем сгруппированы в нескольких определенных участках - гипервариабельных участках. Эти участки, очевидно, играют главную роль в формировании активного центра антител /11,18/.
Вариабельные и константные области легких цепей приблизительно равны по длине. Так у каппа цепей человека V-облас-ти строятся из I07-II3 аминокислотных остатков (начиная с J\l - конца), а на С-область приходятся остальные 107 остатков. У тяжелых гамма-цепей длина V-области примерно такая же, а I-область состоит из трех линейно расположенных
Измерение поверхностного потенциала
Разработано два метода измерения поверхностного потенциала: метод вибрирующего электрода и метод радиоактивного зонда. Теория метода радиоактивного зонда разработана меньше, чем теория вибрирующего электрода. Метод радиоактивного зонда и метод вибрирующего электрода дают для границы вода-воздух идентичные результаты /2,70/.
В нашей работе для измерения поверхностного потенциала применялся метод радиоактивного зонда. В этом методе используется металлический зонд, покрытый оС-излучателем, напри-мер, ги или МгП (рисунок 5). В результате ионизации под действием излучения воздух в зазоре мевду зондом и поверхностью жидкости становится достаточно проводящим, что позволяет непосредственно определить разность потенциалов между зондом и поверхностью. Измерения проводят с помощью чувствительного гальванометра, служащего нуль-индикатором в цепи стандартного потенциометра. В качестве второго электрода Е можно использовать хлор-серебряный электрод /2,70/. Так как поверхностным потенциалом называют изменение контактной разности потенциалов под влиянием нерастворимого моно слоя, то необходимо сравнивать потенциал поверхности, покрытой пленкой, с потенциалом чистой поверхности. Описаны методики последовательного и одновременного определения этих потенциалов /41/.
Во избежание внешних электростатических влияний, кювета, воздушный электрод и гальванометр должны быть заключены в заземленную металлическую сетку, а вся установка должна быть расположена как можно дальше от проводов высокого напряжения и других источников электрического влияния.
Кроме нуль-метода для измерения /yj можно пользоваться высокоумным вольтметром. Эквивалентные схемы этих двух методов представлены на рисунке 6. Адам /I/ указал на то, что устройство с радиоактивным зондом представляет собой сложную батарею с двумя электролитами (жидкость и ионизированный воздух) и тремя поверхностями. В работе /41/ было показано, что результаты по измерению Д\/ с помощью вольтметра с высоким входным сопротивлением С 10 ом) и нуль-методом совпадают.
При количественной интерпретации результатов по измерению Av с помощью радиоактивного зонда следует также помнить, что радиоактивное излучение оказывает влияние на белковые монослои, в результате которого с увеличением времени облучения монослоя AV несколько уменьшается /48/.
