Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Механизмы первичных процессов фотосинтеза в хлоропластах и их математические модели . 9
1.1. Конкуренция процессов захвата и потерь световой энергии в антеннах фотосистем 10
1.1.1. Миграция энергии в антенных комплексах и фотохимический захват в РЦ фотосистем 1,2 10
1.1.2. Флуоресценция в антенных комплексах фотосистем 1 и 2. Индукция флуоресценции 12
1.1.3. Концепция энергетических пулов Ватлера 17
1.2. Стабилизация разделения зарядов в РЦ фотосистемы 2 17
1.2.1. Модель обратимой радикальной пары (ОРП) Шатца 17
1.2.2. О применимости термодинамических представлений в модели ОРП 19
1.2.3. Учет воздействия электрического поля в модели ОРП 21
1.2.4. Результаты применения модели ОРП 24
1.2.5. Область применения модели ОРП 25
1.2.6. Значение модели ОРП и выводы 26
1.3. Акцепторная и донорная сторона ФС2 27
1.3.1. Энергетика переноса электронов 27
1.3.2. Экспериментальное определение редокс-потенцналов первичных акцепторов ФС 2 28
1.3.2.1. Физиологическое значение различий редокс-форм акцепторов электронов 29
1.3.2.2. Достоверность численных опенок редокс- потенциалов. 29
1.3.3. Вторичный акцептор электронов ФС2 30
1.3.4. Особенности переноса электронов з ФС 2 31
1.3.5. Модель двухэлектронных ворот ФС2. Объединение с моделью ОРП 32
1.3.6. Математические модели донорных и акцепторных процессов ФС2 34
1.3.6.1. Модель, учитывающая процессы КВК 34
1.3.6.2. Модель, учитывающая изменение выхода рекомбинации радикальной пары в закрытых РЦ 35
1.3.6.3. Модель, учитывающая процессы КВК и рекомбинации радикальной пары в закрытых РІ1, 36
1.3.7. Выводы о результатах моделирования процессов ФС 2 36
1.4. Молекулярные комплекты тилакоидпой мембраны - b^f комплекс и фотосистема 1 (ФС 1) 36
1.4.1 .Механизмы переноса электронов и модели цитохромного 6/комплекса 36
1.4.2. Модели фотосистемы 1 (ФС1) и подвижные переносчики электронов. Циклический транспорт электронов 38
1.5. Модели процессов в компартмеитах тилакоида 39
1.5.1. Модель, связывающая световые и темновые процессы фотосинтеза 39
1.5.2. Модель, учитывающая протонный транспорт в тилакоидах 40 1.5.4. Выводы к пунктам 1.4. и 1.5 40
1.6. Электрохимический потенциал мембраны тилакоида 41
1.6.1. Электрический потенциал мембраны тилакоида и потоки ионов. 41
1.6.2. Модель потоков ионов через тилакоидпую мембрану Ван Кутена 42
1.6.3. рН и буферные системы стромы и люмена 43
1.6.4. Составляющие электрохимического потенциала 45
1.6.5. F(1F| АТФ синтаза тилакоидной мембраны 46
1.6.6. Вывод к пункту 1.6 49
1.7. Вывод ко всему лит обзору 49
1.8. Постановка задачи создания обобщенной модели
первичных процессов фотосинтеза 50
Глава 2- Общие теоретические принципы создания модели первичных процессов фотосинтеза 52
2.1. Компартментальная схема тилакоида 52
2.2. Кинетические механизмы функционирования первичных процессов фотосинтеза 54
2.2.1 Описание функционирования мультиферменгного комплекса. 54
2.2.2. Описание функционирования подвижных переносчиков 56
2.2.3. Баланс зарядов и электрохимический потенциал в модели тилакоида 56
2.3. Способы задания скоростей реакций 58
2.3.1.Константы скоростей и константы равновесия реакции, 58
2.3.2. Применимость термодинамических представлений в кинетической модели 59
2.3.3. Зависимость параметров реакций переноса заряда через мембрану тилакоида от потенциала 60
2.3.4. Оценка эффективного сечения поглощения антенных комплексов 62
2.4. Модель тилакоида, принципы формирования и отладка блоков модели 63
2.4.1. Выбор экспериментальных результатов для отладки модели тилакоида 65
2.4.2. Проблемы компьютерной обработки модели тилакоида 66
Глава 3. Модель изолированной фотосистемы 2 (ФС2) 67
3.1. Экспериментальное обоснование структуры модели 67
3.1.1. Кинетические и термодинамические характеристики ФС2 67
3.1.2. Постановка задачи моделирования ФС2 69
3.2. Формулировка модели. (Полная схема и система уравнений) 71
3.2.1 Набор состояний переносчиков ФС2 71
3.2.2. Последовательность процессов ФС2 73
3.2.3. Математическое описание процессов ФС2 75
3.2.4. Учет воздействия потенциала при формировании констант реакций трансмембранного переноса электрона в модели ФС2 75
3.2.5. Пулы состояний переносчиков ФС2 76
3.2.6. Особенности компьютерного эксперимента для модели ФС 2. 77
3.3. Результаты расчетов в модели изолированной ФС2. Процессы на донорной и акцепторной сторонах ФС2 79
3.3.1. Влияние интенсивности света па быструю фазу ИФ 79
3.3.1.1. Изменения выхода флуоресценции 79
3.3.1.2. Величина выхода флуоресценции на стадиях ИФ при увеличении интенсивности света 80
3.3.1.3. Постановка задач для анализа результатов моделирования 81
3.3.1.4. Изменение во времени концентраций редокс- форм и степени восстановленное первичного хинонного акцептора 83
3.3.2. Моделирование влияния реагентов на донорной и акцепторной сторонах ФС2 86
3.3.2.1. Действие диурона на быструю фазу ИФ 86
3.3.2.2. Влияние параметров пула подвижных хинонов на быструю фазу ИФ 89
3.3.2.3. Моделирование воздействия на КВК. Гидроксиламин. Ограничение допирования электрона от КВК в ФС2. 92
3.3.2.4. Влияние рН стромы и люмена на быструю фазу ИФ 95
3.4. Результаты расчетов в модели изолированной ФС2. Моделирование влияния электрического потенциала на процессы ФС2. 97
3.4.1. Быстрая фазаИФ при изменении потенциала 97
3.4.1.1. J-1-уровни ИФ при увеличении потенциала. Сравнение с экспериментом. 97
3.4.1.2. Воздействие потенциала на кинетику редокс-компонент на J-I-уровнях быстрой ИФ в модели ФС2 98
3.4.2. Моделирование влияния потенциала на стационарные значения флуоресценции ФС2. Сравнение с экспериментом 99
3.4.2.1. Влияние потенциала в условиях средней степени восстановленное РІД ФС2 101
3.4.2.2. Влияние потенциала в условиях высокой и низкой степени восстановленное РЦ 103
3.4.3. Воздействие потенциала на стационарные величины концентраций редокс- состояний в модели ФС2 !05
3.4.4. Воздействие потенциала на пул рекомбиниругощей радикальной пары (РРП) 106
3.4.5. Воздействие потенциала на потоки электронов в ФС2 109
Глава 4. Модель первичных процессов фотосинтеза в хлоропластах (модель тилакоида) 112
4.0. Постановка задачи разработки обобщенной модели тилакоида 112
4.1. Переход от модели ФС2 к модели тилакоида 113
4.1.1. Светоиндуцированный потенциал в модели ФС2 113
4.1.2. Результаты моделирования процессов ФС2 с учетом потоков ионов 115
4.1.3. Моделирование процессов переноса электронов в цитохромном be f комплексе 118
4.1.3.1. Экспериментальное обоснование структуры модели b<; f комплекса 118
4.1.3.2. Формулировка модели b6 f комплекса 119
4.1.3.3. Цели моделирования процессов в
цитохромном ЬЙ f комплексе 123
4.1.4. Кинетические вклады блоков модели ФС2+потенциал+(АТФ-аза)
+( Ьб f комплекс) в энергизациго тилакоидной мембраны. 123
4.1.4.1. Электрический потенциал 123
4.1.4.2. Электрохимический потенциал протонов 126
4.1.4.3. Вклады процессов переноса зарядов в формирование Д//^ і 127
4.1.5. Моделирование процессов ФС1 130
4.1.6. Модель потоковых процессов в тилакоидс в темноте 131
4.1.7. Выводы о результатах моделирования первичных процессов в блоках мультифермептных комплексов 132
4.2. Моделирование первичных процессов фотосинтеза в обобщенной модели тилакоида 133
4.2.1. Формулировка модели тилакоида 133
4.2.2. Моделирование индукции флуоресценции в модели тилакоида. 134
4.2.3. ИФ и концентрации редокс- форм, рассчитанные в обобщенной модели при различных интенсивности света. 137
4.2.3.1 Динамика заполнения редокс- состояний компонент ЭТИ, при низких световгэтх интенсив но стях 138
4.2.3.2 Динамика заполнения редокс- состояний компонент ЭТЦ при высоких световых интенсивностих 140
4.2.3.3 Кинетические компоненты ИФ при увеличении интенсивности освещения 142
4.2.4. Моделирование электрохимического потенциала гилакоидной мембраны в модели тилакоида 145
4.2.4.1 Светойндуцированный электрический потенциал 145
4.2.4.2 Моделирование светоиндуїшрованного А]йи+ 148
Заключение и общие выводы. 150
Приложение I
- Стабилизация разделения зарядов в РЦ фотосистемы
- Модели процессов в компартмеитах тилакоида
- Кинетические механизмы функционирования первичных процессов фотосинтеза
- Моделирование первичных процессов фотосинтеза в обобщенной модели тилакоида
Введение к работе
Актуальность. Первичные процессы фотосинтеза включают сопряженные стадии преобразования энергии, протекающие в компартментах, которые образованы тилакоидными мембранами хлоропластов. Механизмы отдельных стадий достаточно подробно изучены экспериментально и теоретически. Вместе с тем, существует проблема регуляции целостной системы первичных процессов фотосинтеза, решение которой должно быть основано на совокупности данных о механизмах отдельных стадий процессов, протекающих в системе.
При изучении фот осині езирующих объектов имеется возможность количественно регистрировать светоиндуцированные кинетические зависимости, характеризующие перенос электронов и выражающиеся r явлениях индукции флуоресценции (ИФ), генерации Д/Ї//+-. Известно, что возбужденные состояния хлорофилла фотосистемы 2 (ФС2) вносят основной вклад в регистрируемую флуоресценцию. Особенности процессов ИФ, генерации Д/v^i обусловлены совокупным взаимодействием всех стадий переноса электронов в ФС2, ФС1, цитохромном b$f комплексе, и сопряженными процессами переноса протонов и других ионов в компартментах тилакоида. Для теоретического анализа результата взаимодействия этих процессов и их влияния на форму кривой ИФ, регистрируемой в эксперименте, используются методы математического моделирования.
Большинство имеющихся в литературе моделей, описывающих быструю фазу ИФ (подъем от начального до максимального уровня), подробно рассматривают процессы в фотосистеме 2. Тем не менее, эти модели способны описать только некоторые особенности изменения флуоресценции, регистрируемые в эксперименте при действии диурона (T'rissJ. сі. at. 1993), при высокой (Stirbet el ul. 1998), при низкой (Baake, Shloeder 1992) световых интенеивностях на интервале времени от 0 до 0.5 с. Модели, которые можно назвать обобщенными, не детализируют процессы в пределах одного комплекса, а рассматривают перенос электрона между ФС2 и ФС1. Это позволяет описать кинетику ИФ, а также анализировать влияние цикла Кальвина на ход индукции флуоресценции на временах больше секунды (Караваев, Кукушкин 1993), Известны также работы по моделированию светоиндуцированных потоков протонов и ионов, позволяющие описать
кинетику формирования А (Van Koolen et al. 1986), либо ApH (Вершубский и др. 2003) либо Afi/r (Cruz ei' al. 2001).
В настоящей работе мы исходили из того, что полное кинетическое описание начальных стадий фотосинтеза возможно лишь в рамках единой модели, описывающей перенос электронов, процессы трансмембранного переноса ионов и генерацию светоипдуцированного А/лн+
Цели и задачи исследования. Основная цель работы - разработать комплексную модель кинетики первичных процессов фотосинтеза для описания индукционных явлений флуоресценции и генерации Аін+, наблюдаемых экспериментально. Для достижения этой цели решались задачи:
1)Дать полное описание процессов переноса электрона в ФС2, ФС1. цитохромном bbf комплексе и процессов сопряженного трансмембранного переноса прогонов и противоионов, синтеза-гидролиза АТФ в комплексе АТФ синтазы с учетом буферных свойств люмена и стромы. Проверить адекватность полной модели по ее соответствию кинетическому ходу экспериментальных кривых ИФ как на малых, (микросекунды), гак и па более длительных (секунды) временах при различных световых интенсивностях.
В рамках единой модели учесть процессы ИФ, формирования AJIH<-, включив в модель в явном виде генерацию ДЧ? и АрВ и их влияние на реакции переноса заряда.
Дать описание полного цикла функционирования ФС2, рассмотрев процессы разделения зарядов, стабилизации электрона и переноса его в пул хинонов. Определить временную область и диапазон световых интенсивмостей, в которых применима модель изолированной ФС2.
Научная новизна. На основе детального рассмотрения механизмов первичных процессов, протекающих в компартмептах хлоролластов и участвующих в создании AfiN- , разработана обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза. Дано количественное описание семейства кривых индукции флуоресценции и процессов генерации Apir, наблюдаемых при действии света от низких до высоких иптепсивпостей. Найдены значения констант переноса зарядов, которые не могут быть определены в прямых экспериментальных измерениях. Результаты расчетов в модели выявляют вклады отдельных стадий в ИФ при разных интенсивностях света, роль ФС2
при высоких интенсивностях, цитохромною комплекса, ФСК A4J и переноса ионов при низких. Определены количественные параметры влияния ДЧ^на кинетику ИФ. Путем анализа модели характерным стадиям кинетических кривых ИФ удастся сопоставить соответствующие кинетики редокс-состояний в процессе переноса электрона, генерации трансмембранных потоков ионов, образования ДЧ7 и АрН.
Практическая значимость. Результаты анализа обобщенной модели позволяют проводить определение констант отдельных стадий переноса электронов и ионов, протекающих в конкретных экспериментальных условиях при воздействии света различной интенсивности и иод влиянием ингибиторов. Модель позволяет выявить отдельные стадии фотосинтетических процессов, которые чувствительны к модификациям условий среды (интенсивное освещение, голодание, вредные экологические воздействия). Модель тилакоида может быть использована для преподавания по курсам «Фотосинтез» и «Математическое моделирование в биологии».
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы представлены на IV Съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999); на 2-м Съезде биофизиков России (Москва, 1999); на 3-м Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); на 8-10 конференциях «Математика. Компьютер. Образование.» (Пущино, 2001,2003, Дубна 2002); на конференции «Первичные процессы фотосинтеза» (Пущино, 2003). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания модели, глав 3, 4 - описания и обсуждения результатов моделирования, выводов, приложений 1 и 2, списка литературы.
Стабилизация разделения зарядов в РЦ фотосистемы
Данные измерений (пикосекундного) поглощения и флуоресценции на изолированных кислородовыделяющих частицах ФС2 термофильных циан о бактерий Synechococcus sp. были интерпретированы (Schatz et al. 1988) в детальной кинетической модели, описывающей процессы захвата экситона, разделения, рекомбинации и стабилизации заряда в ФС2. В модели принимается предположении, что равЕїовесное возбужденное состояние Chi и Pfisi устанавливается в процессе переноса возбуждения за время, сравнимое или меньше, чем временное разрешение эксперимента (пикосекунды): Перенос до состояния Е рассматривали с целью наблюдения процесса повторного восстановления Pmi , Константы скоростей, вычисленные по результатам пикосекундных измерений для открытых (в состоянии F0) и закрытых (в состоянии FM) РЦ частиц ФС2 Synechococcus sp., содержащих -80 Chi I Pout), показывают ряд интересных особенностей. Так, константа скорости кА изменяется в незначительной степени при восстановлении QA: /гА=0.9нс" (открытые РЦ), 1.1нс"1 (закрытые РЦ). Следовательно, восстановление Q4 не влияет на процессы дезактивации в антенном Chi . Перенос электрона с феофитмна на Q4 имеет характерное время 500 не в открытых РЦ, процесс этот прекращается в Am закрытых РЦ. Константа скорости разделения зарядов к] (к] ) уменьшается в 6 раз в закрытых РЦ (&[-!.5 пс" ) по сравнению с открытыми (А=9.3 не"1). При переходе от открытых к закрытым РЦ отношение к /кл падает в 7.5 раз ( от 4.6 до 0.6), что указывает на сдвиг равновесия стадии п сторону возбужденного состояния антенного хлорофилла.
Для Аг одинаковых хлорофиллов антенны, сопряженных с Peso- кажущаяся константа скорости разделения зарядов {к(п1) связана с внутренней (к" ) через константы скорости попадания в ловушку и ухода из нее в реакции (1.6) : Равновесное состояние пигментов антенны и РЦ описывают распределением Больцмана: Принимая максимальные длины волн поглощения хлорофилла антенны и РЦ равными Лсы-613 им. Я/ =68() им , и TV =80, для полученной величины &, 9.3 fie (107.5 пс) вычислили к і "-93 не -80- !/2s370 не"1, что соответствует-характерному времени -2.7 пс . Такое значение очень близко к величине 2.8 пс, измеренной па препаратах реакционных центров ФС2 (Wasielewski et at. 1989) 1.2.2. О применимости термодинамических представлений в модели ОРП. Как отмечено и (Schatz et а!.. 1988). теоретические (Пирлстейн 1987; van Grondelle і985) и экспериментальные (Owens et ей. 1989) результаты приводят к оценкам, определяющим лимитированный захватом характер случайных блужданий возбуждения в антенне. Время элементарного скачка возбуждения составляет 50- 200 фс (энергия межмолекулярного сопряжения молекул хлорофилла в антенне порядка 100 см" ), и количество посещений РЦ зависит от времени жизни возбуждения в антенне (г//№), пропорционального количеству пигментов її ней (формулы (1.2), {1.3)). Поскольку тепловое равновесие между возбужденными состояниями Chi и Peso и решеткой (антенной) наступает через 5 пс (энергия тепловой релаксации молекул хлорофилла порядка 1 см"1), то для достаточно большого количества пигментов в антенне за время т;//. »5 пс достижимо тепловое равновесие и и антенной системе и в реакционном центре. Следовательно, согласно термодинамическим соотношениям, разность стандартной свободной энергии между состоянием радикальной пары Р о е и возбужденным состоянием антенны может быть вычислена по формуле: где кв - константа Больцмана, Т - абсолютная температура. Переход от наблюдаемой константы к внутренней, согласно (1.7) и (1.8) принимает вид: где Ne/ -N! си - эффективное число хлорофиллов, на которых уравновешивается возбуждение (если вес пигменты изоэнергитичны. то bf равно реальному размеру антенны). Тогда можно записать уменьшение стандартной свободной энергии антенны относительно состояния радикальной пары по сравнению со стандартной свободной энергией хлорофилла РЦ: Согласно экспериментальным данным ( Scharz at al. 1988 ) для ФС2 частиц с 80-ю хлорофиллами, открытые Р1 (,: к] " / кл - 4.6. Тогда при температуре 7-288К: Таким образом:, модель (Schatz el al. 1988) подчеркивает роль антенных структур в стабилизации захвата энергии за счет количества пигментов. Большая антенна ССК: (а) увеличивает сечение поглощения фотонов; (б) способствует согласованию быстрой и обратимой стадии разделения зарядов с более медленной последующей стадией стабилизации заряда; (в) приводит к разделению зарядов при низких промежуточных концентрациях P6sn Phe, уменьшая изменение свободной энергии, связанное с разделением зарядов.
Светоиндуцированные реакции (Dau 1994а) переноса электрона между донором и акцептором в РЦ приводят к появлению радикалов катионов и анионов, фиксированных в относительно жестком с низкой диэлектрической проницаемостью белковом матриксс, который также разделяет ионы-радикалы от свободных ионов водных фаз. Позі ому реакции фотоеинтстического разделения зарядов связаны с возникновением значительных электростатических сил. Разность свободной энергии реакции переноса электрона внутри протеина определяется не только редокс потенциалами донора и акцептора электрона, но и разницей электростатической потенциальной энергии между начальными и конечными состояниями радикальной пары. На пикосекундной шкале времени происходит светоиндуцированный перенос заряда поперек тилакоидной мембраны: разделение заряда от Peso к Phe .. затем стабилизация от Phe к Q4 . Эти электрогенные, то есть, создающие мембранный потенциал, стадии конкурируют с обратным переносом энергии возбуждения в антенну с последующим высвечиванием флуоресценции. В работе (Schatz с /. at. 1988} авторы предложили гипотезу, что локальные электрические поля могут быть ответственны за нарастание флуоресценции, наблюдаемое при восстановлении QA , то есть за так называемую переменную ї-флуоресценцию. Оценка увеличения электрической энергии диполя Peso Phe при учете отрицательного заряда QA в данной работе составила ДДС70=120 мэВ . Как указано в (Dau 1994а), реальные величины могут быть ниже по причине экранирования отрицательного заряда на QA ионами окружающей фазы и иротонированными аминокислотными остатками. В работе (Leibl et al. 1989) исследованы пикосекундные электрогенные, то есть. создающие мембранный потенциал (фотонапряжеггае) стадии. Обработанные трипсином, мембраны (BBY-membranes), содержащие кислородо выдедяющис частицы ФС2 гороха, облучали импульсами длительностью 30 пс или 12 пс. Показано, что свойства фаз распада флуоресценции и фотонапряжения хорошо объяснимы в рамках обратимой модели ОРП для гомогенной популяции ФС2. Найдено, что при восстановлении QA происходит уменьшение константы скорости захвата {кь рис.1.2) таким образом, что к/ОЛ /k/ibU 3.2. Изменение свободной энергии при разделении зарядов, вычисленное в (Leibl et al. 1989), составило Л С 0Тф Рц= -39мэВ и Л О :,;1Кр. рц= 38мэВ.
Следовательно, восстановление Q4 поднимает энергию состояния с радикальной парой на «77мЭв. Такой сдвиг отличается от найденного в работе (Schatz et al. 1988). Проверено предположение, что на величины констант скоростей обратимой схемы ( к] и к2) влияет мембранный потенциал, изменяемый независимо от электрогенного переноса. Точную величину локальных полей в тилакоидной мембране оценить трудно. Кроме гого. трансмембраиный потенциал на больших временных интервалах (миллисекунды, секунды) определяется процессами транспорта протонов, сопряженного с переносом электронов не только в ФС2, но и в других комплексах тилакоидной мембраны, а также процессами ионного транспорта. В эксперименте (Dau, Saner 1991b) исследовали воздействие произвольного трансмембранного потенциала на величину флуоресценции. Использовали метод «солевого удара» (salt jump), полагая, что при высокой начальной концентрации калия и высокой калиевой проводимости после перемешивания препарата тилакоидных мембран (листья шпината) в растворе с определенной концентрацией хлорида калия, величина созданного диффузионного потенциала на тилакоидной мембране определяется уравнением Нернста : V= 59mV \og(\K+fM/[K+}Q), (1.1 2) іде \iC\-, - начальная концентрация калия. X+]0ul - результирующая концентрация калия в среде после смешивания. Получена линейная зависимость относительного изменения флуоресценции от потенциала на тилакоидной мембране в диапазоне значений от -70мВ до +50мВ с нарастанием от 7% до 11% на каждые КЮмВ напряжения на мембране тилакоида. Однако, анализ стационарной флуоресценции не может ответить па вопрос, как влияет электрическое поле па кинетику реакции разделения заряда ФС2. Пикосекундные измерения флуоресценции тилакоидов шпината получены (Dau, Saner 1992) после воздействия лазерных импульсов низкой интенсивности ( 50 Вт/м") для нулевого значения потенциала и положительного
Модели процессов в компартмеитах тилакоида
Наиболее полная модель первичных стадий фотосинтеза, исходящая из Z-схемы фотосинтеза высших растений и водорослей, предложена и исследована Кукушкиным А.К. с соавторами (Кукушкин и др. 1975 ; Кукушкин, Тихонов 1988). В дальнейшем, модель (Караваев, Кукушкин 1993), объединила как первичные процессы фотосинтеза (Кукушкин, Тихонов 1988) тилакоида, так и темповые стадии фотосинтеза стромалы-юй фазы (Караваев 1988). Для описания электронного переноса использованы уравнения действую;цих масс. С ее помощью удалось получить теоретическое описание колебаний интенсивности флуоресценции и выделения кислорода в листьях высших растений. возникающие за счет влияния метаболитов цикла Кальвина па скорость электронного переноса с акцепторной стороны ФС 1. В работах (Кузнецова 2000; Караваев, Кукушкин 1993) модель использована для исследования влияния спектрального состава освещенности на индукционную кинетику медленной флуоресценции. Посредством имитации импульсного светового возбуждения в модели проведено исследование проблем определения коэффициентов фотохимического и нефотохимического тушения. С помощью расширенно)"о варианта модели и с применением метода контроля метаболизма (теории метаболического управления) исследуется метаболизм неорганического фосфата п связи с проблемой возникновения колебательной индукционной кинетики . В работах (Дубинский, Тихонов 1994; Дубинский 1995; Дубинский 2000) построена математическая модель переноса электронов, сопряженного с трансмембранным переносом протонов в хлоропласте.
Модель описывает функционирование реакционных центров, первичных и вторичных акцепторов комплексов ФС1 и 2, /комплекса, и пластохинолового пула. С учетом иерархии скоростей элементарных стадий проводится редукция системы кинетических уравнений методом квазистационарных состояний. Для описания диффузии протонов через мембрану используется аналитическое выражение в форме уравнения Фика; учитывается обмен протонами с внутритилакоидными кислотными группами, т. е., буферные свойства люмена. Результаты численных расчетов согласуются с экспериментальными данными по кинетике окислительно- восстановительных превращений реакционного центра Р700 и поглощения протонов тилакоидами. Учет электронного потока 66/комплекса по механизму О - цикла Митчелла позволил моделировать зависимости соотношений потоков протонов и электронов от рН компартментов тилакоида при слабой либо нысокой интенсивности света. Авторы отмечают достоинство кинетического подхода, дающего возможность исследовать систему независимо от степени удаленности се от состояния равновесия. J. В моделях. описывающих наборы состояний мультиферментных комплексов, проведено фиттирование и идентификация параметров (Ризниченко 1991; Норее/й/. 1992). 2. Сопряжение процессов переноса между мультиферментньши комплексами происходит посредством подвижных переносчиков. что приводит к необходимости описания в моделях механизмов диффузионных стадий переноса. 3. Разработаны модели, описывающие стадии с разветвлением путей переноса электрона (Дубинский 1995; Berry, Rumberg2000),
Биоэнергетические процессы в хлоропластах могут быть изучены не только с помощью флуоресценции, но и электрофизиологическими методами. Быстрые электрогеиные стадии, связанные с переносом электрона, исследованы методом фотонапряжения для препаратов ФС2 (стабилизация на Q за время -500 пс) в работах (Leibl et al. 1989; Gibasiewicz ел al. 2001). либо для препаратов ФСІ (перенос на компоненту F,, за время 30 jue). например, в (Hecks. Wulf 1994). Медленное развитие электр о генных событий (3- 20 мс) характерно для цитохромного b f комплекса, и позволяет иепользоиать для его изучения электрохромный ответ. В цикле работ (Maniedov ел а!.. 2001; Scmenov et al. 2003) прямые электрометрические методы были использованы для определения относительных, вкладов реакций переноса электронов в цитохромном комплексе, пластоцианином, ФСК ферредоксином в общий элсктрогенный перенос зарядов, связанный с комплексом ФС1 цианобактерий. Векторный перенос электронов через мембрану сопряжен с процессами вброса протонов в люмен в КВК (среднее время -0.5 цс) и в цитохромном b f комплексе (миллисекунды) и вычерпыванием протонов из етромы в ( -сайте ФС2, г-сайте bfj комплекса и в комплексе ЛГуШЯ-дегидрогсиазы (Jones, W і (.marsh 1.988; Schinkarevt /o/. 1993). Результирующий светоиндуцированный перенос протонов создает суммарный уровень мембранного электрического потенциала (ЛУ) между фазами стромы и люмена, с более отрицательным потенциалом на внешней стороне тилакоидной мембраны, который может быть измерен в эксперименте.
Полученная микроэлектродпыми измерениями максимальная величина АЧ1 составила 1.20 мВ, при разрешении 0.1 мс, достигнутом в Patch clamp-модификации метода (Bulychev, Vredcnberg 1999). Метод встраивания мембранных фрагментов в модельные мембранные системы позволил разрешить стадии формирования МП в бактериальных РЦ (Drachev et al. 1990 ; Mamedov et al. 1994). Для электрогенных систем хлоропласта метод был применен в работе (SigFridsson е? al. 1995) для ФСК Как отмечено в обзоре (Bulychev, Vredenberg 1999), ДТ связан с одной стороны, с частотой разделения заряда в электрогенных комплексах, с другой стороны - с проницаемостью тилакоидной мембраны для ионов. Справедливо и обратное, светоиндуцированные изменения А1Р влияют іга скорость электронного транспорта и нп активность ферментов прямо или косвенно, вызывая перераспределение ионов между тилакоидами и стромой. В состоянии темповой адаптации тилакоидная мембрана проявляет преимущественно К проводимость, что частично связано с высокой концентрацией К в интактных хлоропластах (-100 мМ), более высокой, чем для любых других ионов. Это подтверждается данными о существовании калиевых каналов во фрагментах тилакоидной мембраны (стромальные ламедлы шпината), встроенных в липидные бислои (Tester, Dlatt 1989) или в разбухших тилакоидах (Potossin, Schonknecht 1996). Проводимость Са, Mg -каналов значительно меньше, чем у К — каналов (Біт/ et al 1993). Тилакоидные мембраны также содержат СГ - каналы (Schonkneht et al. 1988), однако роль СГ проводимости в интактных хлоропластах представляется меньшей, чем в разбухших тилакоидах в связи с более низкой концентрацией С1 (] т-4 мМ). Реакции светоиндуцированного переноса электронов вызывают активное накопление протонов внутри тилакоида, однако, в стационарном состоянии разность электрического потенциала на тилакоидной мембране мала. Предположение (Bulychev, Vredenberg 1976) о том, что пассивный транспорт
Кинетические механизмы функционирования первичных процессов фотосинтеза
Структурной единицей переноса электронов п компартменте тилакоидной мембраны являются определенным образом организованные электронно транспортные комплексы ЭТЦ. Используемые нами математические представления о работе пигмент-белкового комплекса были впервые предложены для описания переноса электронов между энергетическими состояниями ФС2 R работах (Malkin 1971; Сорокин 1971). Детально математическое описание процессов переноса электрона в молекулярном комплексе было разработано в (Рубин, Шинкарев 1984). В работах (Ризниченко, Воробьева 1986; Храброва и др. 1989; Ризниченко 1991) это математическое описание было использовано для моделирования процессов переноса электронов в комплексах РЦ ФС1. ФС2 и бактериальных РЦ, Вероятностный подход рассматривает мультиферментный. комплекс ЭТИ, как совокупность взаимодействующих центров, каждый из которых может находиться в конечном числе состояний, тем самым формируя состояния комплекса как целого на пространстве элементарных событий. Комплекс ЭТЦ содержит п компонентов {С\Сі.-..Сп\. В модели для электронного переносчика С), включенного в комплекс рассмотрены следующие состояния: с возбужденной электронной оболочкой, восстановленное, окисленное, протонированная форма, незанятый или занятый сайт. Каждому состоянию комплекса соответствует вероятность заселенности (/?,), зависящая от времени. Поведение комплекса описывается марковским случайным процессом с дискретным числом состояний и с непрерывным временем. Согласно формулам Колмогорова-Чегшена (Рубин, Шинкарев 1984), переходы между состояниями комплекса ЭТЦ описываются обычными дифференциальными уравнениями, линейными относительно вероятностей соответствующих состояний : где kjj - константа скорости перехода от г—того к /-тому состоянию комплекса.
Начальные вероятности состояний компонент задаются в виде : р,(0)=Л,-, i-1,...1. (2.2) Л вероятность нахождения электронного переносчика номер q в состоянии G может быть определена при решении системы (2.1.): причем суммирование происходит по всем состояниям, где компонент q находится в состоянии G. Для большого числа одинаковых невзаимодействующих (независимых) комплексов вероятности состояний комплексов равны долям (концентрациям) комплексов, находящихся в соответствующих состояниях. В том числе суммирование по всем состояниям комплекса с возбужденной электронной оболочкой даст вероятность нахождения комплекса во флуоресцирующем состоянии. at Здесь [D ], [D ] являются концентрациями подвижного носителя в окисленной и восстановленной формах. [С. + ], [С ],[С +],[С ] - это концентрации компонентов комплекса, взаимодействующего с подвижным носителем в окисленной и восстановленной формах, каждая из которых может быть відчислена согласно (2.1-2.3). к, — бимолекулярная константа скорости соответствующей реакции. Захват или освобождение протонов в стромальном и лгомепальном сайтах ФС2 и цитохромного b6f комплекса, сопряженные со светоиндуцированным переносом электронов, приводят к перераспределению зарядов в стромс и люмене.
Создаваемый электрический потенциал (AVF) тилакоидной мембраны вызывает пассивные потоки ионов через тилакоидную мембрану. Продолжающийся светоиндуцированний перенос протонов приводит к насыщению буферных систем люмена и стромы и к нарастанию протонного градиента (Ар//) на тилакоидной мембране. При некотором пороговом значении электрохимического потенциала (А/Ін ) инициируется работа АТФ еинтазы. Вследствие этого происходит активное потребление Д/ї/-/- . В модели учитывается как генерация электрохимического потенциала в тилакоиде (А///-/- генераторы это комплексы ФС2, b6f, ФС1), так и процессы потребляющие ДТ и Ар И (к потребителям Лй относятся синтез АТФ, утечки ионов: Н ,К , С1). Пассивные процессы потребления электрохимического градиента протонов обусловлены наличием утечек тилакоидной мембраны для различных ионов. Описание зависимости утечки протонов от потенциала предложено в работах (Холодешш 1988; Nicholls 1974) в рамках эйриптовского подхода, рассматривающего транспорт ионов через канал для трехбарверного механизма. Такой же механизм применен (Demin et а!.. 1998) для описания электрогенного переноса калия и хлора в виде : (2.5). Механизмы АТФ-синтазной реакции в хлоропластах были предметом многочисленных исследований (Воуег !993), в том числе, по экспериментальным результатам проведено моделирование (Rumberg. Panke 1998) с введением параметров, учитывающих поворотные механизмы субъединиц АТФ синтаза f{ff\ типа. Однако, для наших целей тгеобходимо было использовать выражение для скорости АТФ-синтазной реакции, учитывающее воздействие не только градиента транстилакоидного рН, но и электрического потенциала, полученное в работах (Холоденко 1988; Boork 1984) и приведенное далее в главе 4.. Общее изменение количества (баланс) зарядов в люмене и строме при трансмембранном переносе, определяет значение потенциала в модели как неременной величині.] п любой момент времени в предположении, что мембрана ведет себя как простой конденсатор (КтаЬ el ей. 1 985).
Моделирование первичных процессов фотосинтеза в обобщенной модели тилакоида
Объединим изученные нами блоки ФС2, потоки ионов, АТФ-аза, hbf комплекс, ФС1 в рамках единой обобщенной модели первичных процессов фотосинтеза (модель тилакоида). Тем самым, рассмотрим взаимосвязанные процессы, протекающие в компартментах хлоропласта: в строме, в люмене, в тилакоидных мембранах (Беляева Н.Е. и др. 2001; Лебедева Г.В. и др. 2002). Формализация процессов обобщенной модели тилакоида проведена посредством задания матрицы скоростей 71 перехода между состояниями полной модели. Выражения, определяющие вес типы скоростей приведены в таблицах (Приложение 2) 5.1 (процессы ФС2) и 5.6 (процессы, дополняющие ФС2 до полной модели) Для 67 переменных модели тилакоида записывается система дифференциальных уравнений вида (2.15), представленная в таблицах (Приложение 2) - 5.2 (ФС2) и 5.7 (доплонение до полной модели тилакоида). Расчеты как в отдельных блоках, так и в полной модели тилакоида проводили в предположении начального темпового состояния объекта. Моделирование процессов, идущих в мембране тилакоида в темноте, позволило получить стационарное решение, имитирующее состояние тем новой адаптации тилакоида (см. пункт 4,1.6). Один из полученных наборов значений переменных (условия с высокой ионной силой) использовался в качестве начальных значений (таблица 5,4 приложения) для моделирования изменения состояния фотосинтетической системы при включении освещения. Приведенные в таблице 5.4 (см. приложение) данные были получены для среднего объема хлоропласта 40 им", содержания Р700 равного 2 ммоль на 1 моль хлорофилла, и соотношения объемов стромы хлоропласта, люмена тилакоида и тилакоидной мембраны 10:1:1.
Соотношение содержания комплексов ФС II, bft ФС I, молекул пластохинона PQ и пластоциапина Рс в мембране тилакоида предполагалось равным 1:1:1:6:2 соответственно. В таблице 5.5 (см. приложение) приведены значения параметров реакций, объединенных в обобщенной модели тилакоида. Большинство значений констант равновесия и констант скорости рассмотренных в модели реакций оценивались в соответствии с известными экспериментальными данными, причем при наличии противоречивых свидетельств бралась их средняя оценка. Вместе с тем, некоторые параметры модели подбирались так, чтобы достичь оптимального соответствия теоретических результатов и экспериментальных данных. Константі.], характеризующие разделение зарядов в комплексах ФС1 и ФС2, можно оценить довольно точно, поскольку в этой области накоплен обширный экспериментальный материал. Другие процессы являются менее изученными, и о параметрах их протекания в литературе имеются противоречивые данные. В особенности это касается более медленных процессов диффузии молекул пластохинона в фазе тилакоидной мембраны, а также процессов, связанных с трас мембранным переносом ионов и с буферными свойствами люмена и стромы, В работе (Neubauer, Schreiber 1987) экспериментально показано принципиально различное кинетическое поведение быстрой (до I секунды) ИФ в зависимости от воздействующей на интактные хлоропласти шпината интенсивности освещения, изменявшейся от 12 Вт/м до 5200 Вт/м". Для образцов листьев или хлоропластов темновая адаптация составляла 2 часа. Отмечено, что при нарастании интенсивности света ход ИФ не только ускоряется, но и происходят значительные изменения в характеристиках кривой (появляются дополнительные фазы). При очень высоких интенсивное ІЯХ наблюдается характерный ход ИФ, скорее всего, выявляющий основные свойства ФС2, так как такой ход ИФ регистрируется одинаково хорошо как в хлоропластах, так и в интактных листьях для разнообразных растительных образцов. Используя накопление данных для временных интервалов, отличающихся несколькими порядками величины, (Strasser et al. 1995) получили на логарифмической шкале времени полную полифазную кинетику флуоресценции для разнообразных оксигенных растений и цианобактерий при различных интенсивпостях света. Полифазные изменения флуоресценции, регистрируемые во временном диапазоне от 40//сек до 120сек для иптактных листьев зрелого гороха {Pisum sativum) после темновой адаптация ЗОсек, представлены на рис.4.1 ОЙ (флуоресцентный сигнал для 40,«сек рассматривался как FQ ). С возрастанием интенсивности света при физиологических условиях подъем флуоресценции Хл а меняется от кинетики с характерными 0-1-Р-уровнями (интенсивность света 6 Вт/м ) до кривых с двумя промежуточными уровнями -0-J-I-P- паттерн (интенсивность света 600 Вт/м ), Время (тс) Разработанная обобщенная модель первичных процессов фотосинтеза в тилакоидной мембране хлороп ластов была применена для расчета теоретических кривых ИФ хлорофилла при различных уровнях освещенности (Беляева Н.Е. и др. 2001; Лебедева Г.В, и др. 2002). Интенсивность света задавали значениями световой константы (k.L=k, , і = 1, 5. 8,1.2,1.5,19,28,32,68, рис.3.2), величину которой выбирали как описано в разделах 2.3,4 и 3.3.1. Как видно из рис.4.10 , модель демонстрирует хорошее соответствие теоретических кривых имеющимся экспериментальным данным (рис.4.10«) по регистрации ИФ при различных условиях освещения объекта.
При малых значениях световых констант, соответствующих низкой интенсивности света (1%), выход флуоресценции достигает своего максимума за времена порядка 1-2 с, при этом кинетика нарастания флуоресценции характеризуется наличием одной промежуточной фазы («плечо») / на временах порядка 200 мс. Увеличение световой константы в 10 раз, что соответствует средней освещенности объекта (10%), приводит к возрастанию амплитуды сигнала, сдвигу максимума флуоресценции по шкале времени влево (времена порядка 500 мс). В кинетике нарастания флуоресценции также наблюдается промежуточная фаза, однако она не столь явно выражена. При больших значениях световой константы (высокая интенсивность света) пик флуоресценции достигается за время порядка 100-200 мс и кинетика нарастания флуоресценции характеризуется наличием двух промежуточных фаз (J- около 2 мс, и /- около 20 мс). Экспериментально на интактных хлоропластах шпината (Neubauer, Schreiber 1987) показано, что величина интенсивности флуоресценции, достигаемая на каждом из У-/-Р-уровней характеризуется (рис.4.11 a, Fjs F}, FP) собственной завис VIM остью от интенсивности света,
При этом, выход па максимально возможную «амплитуду уровня» происходит при интенсивностях света, которые называют насыщающими. Семейство кривых, полученное в обобщенной модели тилакоида при интенсивностях света, задаваемых в диапазоне от fcL 3 с до -і Зависимость величины интенсивности флуоресценции, достигаемой на О-J-/ P y ровнях ИФ, от интенсивности света., которую получили в обобщенной модели тилакоида, приведена па рис.4.116 (кривые Fj, F,, FP). Сравнение качественно совпадающих теоретических и экспериментальных кривых «насыщения», позволяет отметить, что: (1) Наибольшее совпадение дают кривые для Р -уровня (Fr). (2) Насыщение стадий (плеч) У-ІнР-уровней в модели тилакоида происходит на тех же интенсивностях света . что и в эксперименте. Неполное соответствие теоретического хода насыщения эксперименту указывает на возможный вклад механизмов, неучтенных в разработанной версии модели тилакоида, а именно:. (1)В модель не включены процессы диссипации энергии возбуждения, например, безизлучателыгой рекомбинации закрытых РЦ ФС2. Частично диссипацию энергии возбуждения при высоких интенсивностях света можно было бы учесть в модели ФС2 как переходы из 7-х в 5-е состояния, показанные пунктирными стрелками на схеме ФС2 (рис.3.2). (2) Несовпадение теоретической кривой на стадии У-уровня с экспериментальной может быть связано с отсутствием в модели детализации описания функционирования КВК. (3) Для четкого сопоставления с экспериментальными данными (рис.4.11«) теоретические кривые насыщения необходимо получить, моделируя нулевой уровень флуоресценции Fo
