Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Структурно-функциональная организация фотосинтетического ппарата 10
1.2. Применение флуоресцентных методов для изучения фотосинтетических реакций у растительных организмов 23
1.3. Фотоиндуцированное выделение водорода микроводорослями 33
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объект исследования 45
2.2. Условия культивирования микроводорослей 45
2.3. Отмывание культуры от серы 47
2.4. РАМ-флуорометрия 48
2.5. РЕА-флуорометрия 50
2.6. Лазерная пико-наносекундная флуорометрия 52
2.7. Спектральный анализ 53
2.8. Регистрация окислительно-восстановительных изменений пигмента РЦ ФС1 (Р700) 53
2.9. Определение содержания хлорофилла и клеток в суспензии микроводорослей 54
2.10. Определение каротиноидов 55
2.11. Определение белка 55
2.12. Определение крахмала 55
2.13. Измерение скорости выделения кислорода и дыхания 56
2.14. Газовая хроматография 56
2.15. Цитологический анализ 57
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Влияние серного голодания на первичные процессы у С. reinhardtii фотосинтеза в аэробных условиях
3.1.1. Характеристика культуры 58
3.1.2. Исследование состояния фотосинтетического аппарата с использованием модулированной флуорометрии (РАМ) 63
3.1.3. Нефотохимическое тушение флуоресценции 68
3.1.4. Обратимые переходы светособирающих комплексов междуФС2иФС1 72
3.1.5. Индукционные кривые флуоресценции при высокой освещенности 76
3.1.6. Пико-наносекундная флуорометрия процессов преобразования энергии света в ФС2 в голодающей по сере культуре С. reinhardtii 83
3.2. Влияние отсутствия серы в среде на первичные процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное выделение Н2 культурой С. reinhardtii в замкнутом биореакторе 92
3.2.1. Исследование флуоресценции ХЛ а у голодающей по сере культуры С. reinhardtii в замкнутом биореакторе в пико-наносекундном временном диапазоне 100
3.3. Влияние активности ФС2 на выделение водорода на примере мутантов С. reinhardtii с нарушениями в Dl-белке 104
3.4. Влияние добавления серы на параметры флуоресценции и выделение Н2 голодающей культурой С. reinhardtii в замкнутом биореакторе 113
Заключение и выводы 119
Список литературы 124
- Применение флуоресцентных методов для изучения фотосинтетических реакций у растительных организмов
- Фотоиндуцированное выделение водорода микроводорослями
- Регистрация окислительно-восстановительных изменений пигмента РЦ ФС1 (Р700)
- Влияние отсутствия серы в среде на первичные процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное выделение Н2 культурой С. reinhardtii в замкнутом биореакторе
Введение к работе
В настоящее время в связи с уменьшением мировых запасов естественных энергоресурсов большое значение приобретают поиски замены их искусственными. В качестве наиболее перспективного экологически чистого топлива можно рассматривать водород (Н2), единственным продуктом горения которого является вода, и который может использоваться в топливных элементах. Но остается проблема его дешевого производства в достаточных количествах, хранения и транспортировки (см. обзоры Melis, Норре, 2004; Kruse et al., 2005а).
Известны несколько путей получения Н2. Так например, в современной промышленности Н2 получают паровой конверсией метана, каталитической конверсией углеводородов и электролизом воды. Но наиболее перспективным и технологически чистым является получение Н2 биологическим путем. Этот метод основан на использовании субклеточных биологических структур, либо на применении биологических систем (микроводоросли, фототропные бактерии). Микроводоросли легко культивируются, быстро увеличивают массу, за 24 ч их концентрация увеличивается вдвое (Ben-Amotz, Avron, 1990). Наибольший интерес представляют фотосинтезирующие зеленые и сине-зеленые микроводоросли. Гаффрон и Рубин более 60 лет назад показали, что микроводоросль Scenedesmus obliquus способна к светозависимому выделению Н2, однако для индукции этого процесса требуются анаэробные условия, которые создавались после периода темновой адаптации (Gaffron, Rubin, 1942). Позднее было найдено, что к этому процессу способны многие, но далеко не все фототрофные организмы. Так, фотообразования Н2 никогда не наблюдали у нитчатых водорослей или содержащих гидрогеназу (фермент катализирующий образование Н2) одноклеточных водорослей таких как Porphyridium, Euglena и Dunaliella (см. обзор Boichenco et al., 2004).
В настоящее время показано, что способность зеленых микроводорослей (Chlamydomonas, Chlorella, Scenedesmus) к фотоиндуцированному выделению Н2 связана с активностью гидрогеназ, синтезирующих Н2 с использованием протонов и электронов. Это большая группа ферментов, катализирующих реакцию обратимой активации молекул водорода, отличающаяся большим
структурным и функциональным разнообразием (см. обзор Цыганков, 2007). В клетках зеленых водорослей содержатся гидрогеназы, содержащие ионы железа в активном центре.
Фотоиндуцированное выделение Нг тесно связано с первичными процессами фотосинтеза, поскольку непосредственным донором электронов для гидрогеназной реакции у зеленых водорослей является ферредоксин, восстановленный фотосинтетической электронтранспортной цепью (ЭТЦ). Сочетание фотосинтетического фотолиза Н20 и гидрогеназной реакции позволяет микроводорослям синтезировать Нг с использованием неисчерпаемых природных ресурсов - солнечного света и воды (см. обзор Цыганков, 2007). Fe-содержащие гидрогеназы чрезвычайно чувствительны к кислороду, присутствие даже следов которого приводит к ингибированию как каталитической активности фермента (Ghirardi et al., 1997; 2000) так и подавлению экспрессии ее генов (Нарре, Kaminski, 2002), что приходится учитывать при разработке технологических приемов.
При росте клеток в темновых анаэробных условиях основным типом питания микроводорослей является брожение за счет разложения накопленных полимеров, в частности крахмала (хемогетеротрофное анаэробное питание). Известно, что при росте в этих условиях происходит индукция синтеза и активация гидрогеназы. Освещение таких клеток приводит к быстрому накоплению восстановительных эквивалентов за счет функционирования фотосинтетической ЭТЦ. Однако, фиксация углекислоты, требующая большого количества восстановителей и АТФ, начинается не сразу. Поэтому в первый момент (до нескольких минут) после начала освещения может происходить накопление избытка восстановительных эквивалентов внутри клеток, что в ряде случаев разрушительно для клеток. В этот переходный период сброс избытка восстановителя путем образования водорода с помощью активной гидрогеназы позволяет поддерживать концентрацию восстановителей на не токсичном для микроводоросли уровне. Образование Н2 играет важную физиологическую роль, поскольку снижает избыток восстановителя, образующегося в клетках микроводорослей в анаэробных условиях и таким образом защищает клетку от фотоингибирования (см обзоры Melis, Нарре, 2001; Нарре et al., 2002). Когда
метаболизм клеток перестраивается с анаэробного хемогетеротрофного типа питания на фотоавтотрофный, накопление в среде кислорода, инактивирующего гидрогеназу, приводит к выключению процесса фотообразования водорода. Таким образом, возникает проблема разделения стадий активного фотосинтеза (аэробной) и образования Н2 (анаэробной). Эта проблема была решена при культивировании зеленых водорослей (С. reinhardtii) на постоянном свету в замкнутом культиваторе в условиях голодания по сере (Ghirardi et al., 2000, Melis et al., 2000).
Сера - один из обязательных элементов, имеющих высокую физиологическую значимость для развития живых организмов. Она необходима для синтеза многих белков, а также вторичных метаболитов, таких как, например, сульфолипиды, входящие в состав мембран тилакоидов. В ее отсутствие прекращается деление клеток С. reinhardtii, разрушаются некоторые энзимы и полипептиды, нарушается эффективность использования поглощенной световой энергии в процессе фотосинтза (см. обзор Esper et al., 2006). В ее отсутствие резко снижается содержание белка Рубиско, который является ключевым ферментом в цикле Кальвина (Zang et al., 2002), наблюдается деградация D1 белка ФС2 и основного гетеродимера ФС1, снижение содержания цитохрома / (Melis et al., 2000). Кроме того, серное голодание, как и любые стрессовые воздействия, нарушает определенный баланс между процессами поглощения и утилизации световой энергии, что приводит к перевосстановлению электрон-транспортной цепи и развитию в ФС2 фотодеструктивных процессов разной степени в зависимости от интенсивности света и эффективности функционирования фотозащитных процессов, регулирующих поглощение света и тепловую диссипацию энергии в ФС2 (Antal et al., 2003; см обзоры Finazzi, 2005; Kruse et al., 2005a).
При выращивании С. reinhardtii в замкнутом культиваторе в условиях серного голодания аэробные условия самопроизвольно сменяются анаэробными. Это обусловлено, главным образом, падением скорости фотоокисления воды и, соответственно, образования 02, в результате постепенной инактивации ФС2, которая происходит в результате развития деструктивных процессов, а также снижения скорости ресинтеза белка D1
(Wykoff et al., 1998). Когда скорость образования кислорода становится ниже скорости дыхания, культура переходит в анаэробные условия что приводит к экспрессии генов, ответственных за синтез гидрогеназы (Zang et al., 2002).
Включение гидрогеназной реакции приводит к увеличению оттока части электронов из фотосинтетической ЭТЦ, что снижает степень восстановленности пула хинонов и реактивирует часть центров ФС2 (Антал и др., 2001). В экспериментах с ингибиторами было показано, что добавление диурона, блокирующего электронный транспорт между первичными хинонными акцепторами QA и QB, снижает скорость выделения водорода на 80% (Ghirardi et al., 2000; Antal et al., 2003). Таким образом было показано, что и в анаэробных условиях ФС2 сохраняет некоторую активность и донирует электроны в фотосинтетическую цепь и далее на ферредоксин и гидрогеназу, участвуя таким образом в фотообразовании Н2. Остальные 20% электронов поступают, скорее всего, от продуктов цикла брожения, в частности от крахмала (Posewitz et al., 2004), который накапливается в большом количестве в голодающих по сере клетках в начале аэробной фазы. Для накопления крахмала ФС2 также важна, так как линейный поток электронов через обе фотосистемы необходим для обеспечения восстановительными эквивалентами темновых реакций фотосинтеза (Fouchard et al., 2005). Таким образом, ФС2 участвует на всех этапах роста культуры микроводорослей в условиях серного голодания -аэробной фазе, анаэробной и фазе выделения Н2.
Несмотря на то, что изучение механизмов процесса выделения Н2 на свету и поиск возможностей управлять им приобретают все больший интерес в последние годы, и были достигнуты значительные успехи в изучении разных аспектов этого процесса (см. обзоры Biochenko et al., 2004; Цыганков, 2007), в понимании молекулярных механизмов и принципов регуляции еще много белых пятен. Исследование функции ФС2 при серном голодании может обеспечить дополнительные сведения об изменениях механизмов первичных процессов фотосинтеза и роли ФС2 в регулировании выделения Н2.
Прежде чем изучать процессы, происходящие в клетках в культиваторе, надо понять, что происходит с голодающей по сере культурой в аэробных условиях, когда гидрогеназа неактивна. Одним из источников информации о
функциональном состоянии первичных процессов фотосинтеза (ППФ) и
активности ФС2 в частности, является флуоресценция хлорофилла а (ФХ),
которая может характеризовать первичные процессы фотосинтеза, протекающие
в диапазоне от пикосекунд до минут (Karapetyan et al., 1990; Krause, Weiss,
1991; Strasser, Strasser, 1995; Shatz et al., 1998; Lazar, 2006).
Цели и задачи работы. Цель настоящей диссертационной работы состояла в
исследовании влияния серного голодания на функциональную организацию
первичных процессов фотосинтеза и изучение роли ФС2 в процессах, ведущих к
фотообразованию Нг клетками С. reinhardtii.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить особенности первичных процессов фотосинтеза у голодающей по сере микроводоросли С. reinhardtii в аэробных условиях, когда гидрогеназа неактивна.
Провести анализ первичных процессов фотосинтеза культуры С. reinhardtii в замкнутом культиваторе на всех стадиях, предшествующих выделению водорода (аэробную, переход в анаэробиоз, анаэробную), и на стадии выделения водорода.
Используя сайт-специфичные мутанты С. reinhardtii D1-R323, исследовать влияние приводящих к уменьшению кислород-выделяющей активности повреждений ЭТЦ на донорной стороне ФС2 на светозависимое выделение Н2 в культиваторе.
Применение флуоресцентных методов для изучения фотосинтетических реакций у растительных организмов
Оценка эффективности первичных процессов фотосинтеза является одним из важнейших показателей физиологического состояния растений. Значение этого показателя определяется как важностью фотосинтетической функции в жизни растения, так и высокой чувствительностью фотосинтетического аппарата к повреждающим воздействиям. Характер изменения первичных стадий фотосинтеза непосредственно отражается в изменении флуоресценции хлорофилла. Феномен индукции флуоресценции хлорофилла впервые был открыт в 1931г. группой исследователей, которые показали, что интактные растения излучают слабую красную люминесценцию при возбуждении видимым светом (Kautsky, Hirsch, 1931). Подавляющая часть флуоресценции, наблюдаемой при изучении листьев высших растений и суспензий микроводорослей, генерируется почти исключительно ХЛ а ФС2 (Рубин, 2000).
Как известно, доставка энергии электронного возбуждения к РЦ осуществляется за счет миграции энергии в светособирающей антенне. В состав ССК входит около половины всего хлорофилла, находящегося в клетке. При поглощении кванта света молекулой ХЛ один из электронов, находящийся на нижнем энергетическом уровне, переходит на верхний энергетический уровень с более высокой энергией, переводя тем самым молекулу из основного (S0) в возбужденное состояние. Известны два основных типа возбужденных состояний - синглетные (Sb S2...Sn) и триплетные (Т( или Т2). При переходе электрона на один из возбужденных синглетных уровней повышается запас внутренней колебательной и потенциальной электронной энергии. Этот избыточный запас колебательной энергии диссипирует в виде тепла (в течение 10"2с) и электрон опускается на нижний колебательный уровень Sb где может находиться в течение 10"9с. В состоянии S] может произойти изменение ориентации спина электрона и переход в триплетное состояние Ть энергия которого ниже S]. Триплетная молекула обладает двумя неспаренными электронами и проявляет свойства анион-радикала на время существования возбуждения. Вероятность перехода из триплетного состояния Т— So мала, так как требует переориентации спина. Поэтому время жизни триплетного состояния больше S0 состояния и составляет 10"6-10 2с и больше (Рубин, 2000).
Переход из возбужденного состояния S\ в основное состояние So может происходить различными путями: фотохимическим, излучательным и безызлучательным. Все три процесса являются конкурентными, вследствие чего изменение эффективности одного из них ведет к противоположно направленному изменению двух других. При фотохимической дезактивации энергия электронного возбуждения, мигрируя по светособирающей матрице (антенна), захватывается фотоактивным пигментом (Р680) РІД ФС2. На втором этапе, уже непосредственно в РЦ, энергия возбужденного состояния используется на разделение зарядов между возбужденным Р680 и первичным акцептором электрона Фео. В результате образуется первичная радикальная пара Р680+Фео\ Далее происходит перенос электрона от Фео" на QA. В результате данного процесса происходит восстановление QA и образуется сильный окислитель Р680+. Он акцептирует электроны от тирозина Z, который в свою очередь получает электроны от КВК. Эффективность отрыва электрона от Р680 и перенос его на QA зависит от состояния ЭТЦ. Если РЦ по каким либо причинам не может передавать электроны в цепь фотосинтеза, неиспользованная энергия возбуждения возвращается в антенну и высвечивается в виде флуоресценции (излучательный путь дезактивации энергии). Безызлучательная дезактивация энергии представляет собой тепловую диссипацию энергии возбужденных молекул ХЛ. Вследствие высокой эффективности дезактивации возбужденного состояния Р680 и разделения зарядов в РЦ, флуоресценция ФС2 характеризуется низкими значениями квантового выхода (1-3%) и времени затухания (100-500 пс). Однако по изменению этих величин можно судить об эффективности фотосинтетического запасания энергии электронного возбуждения Р680 в различных условиях (см. обзор Krause, Weis, 1991; Govindjee, 1995).
Измерение флуоресценции ХЛ а является информативным, высокочувствительным, быстрым и относительно недорогим методом изучения реакций фотосинтеза. Высокая информативность этого метода связана с тем, что изменения состояния фотосинтетического аппарата сопровождаются измене- ниями вероятности тушения энергии электронного возбуждения молекул ХЛ, что проявляется в изменении квантового выхода флуоресценции ХЛ под действием света (эффект Каутского) (Van Kooten, Snel, 1990; Корнеев, 2002; см. обзор Lazar, 2006). К настоящему времени разработан ряд флуорометров для измерения флуоресценции ХЛ in vivo. В данной главе будут рассмотрены принципы действия импульсно-модулированного, однолучевого и пико-секундного лазерного флуорометров. РАМ флуорометры (Pulse Amplitude Modulated) с модулированным сигналом имеют отдельные источники измеряющего и действующего света. В основе действия этих приборов лежит так называемый принцип импульсного модулирования, что позволяет отделить импульсы флуоресценции возбуждаемой измеряющим светом от сигнала флуоресценции, возбуждаемого действующим светом (см. обзор Lazar, 2006).
Исходный уровень флуоресценции (Fo) определяется флуоресценцией ХЛ в условиях, когда фотосинтетический аппарат адаптирован к темноте (рис. 1.4). В этих условиях все РЦ находятся в так называемом «открытом» состоянии с окисленным QA, когда эффективность фотохимического преобразования энергии в РЦ максимальна. При освещении насыщающей вспышкой света QA восстанавливаются (РЦ переходят в закрытое состояние). В этом состоянии первичное разделение зарядов становится невозможным вследствие электростатического отталкивания между Фео" и QA . В этих условиях неиспользованная энергия электронного возбуждения диссипирует в виде тепла и флуоресценции, поэтому выход флуоресценции достигает максимального значения Fm. В темноте Fm быстро релаксирует до исходного уровня. Разница между Fm и Fo называется переменной флуоресценцией (Fv = Fm-Fo). Величина Fv соответствует той части световой энергии, которая используется в первичных реакциях фотосинтеза в условиях, когда РЦ открыты. На постоянном свету с интенсивностью ниже насыщающей центры ФС2 переходят в «закрытое» состояние по мере восстановления QA, что сопровождается ростом флуоресценции Fo до величины Ft. Освещение образца на этом фоне насыщающей фотосинтез вспышкой света увеличивает уровень флуоресценции до величины Fm , которое обычно ниже уровня Fm, так как на постоянном свету развивается нефотохимическое тушение флуоресценции (NPQ), обусловленное тепловой диссипацией энергии возбуждения в фотосинтетической антенне ФС2 (Shraiber et al., 1986). Как известно NPQ обусловлено по крайней мере тремя процессами (механизмы которых описаны в главе 1): АрН зависимым ростом тепловой диссипации энергии (qE), связанным с работой виолаксантинового цикла, перераспределением ССК между фотосистемами (qT) и фотоингибированием (ql) (см. обзоры Krause, Weis, 1991; Lazar, 1999; Maxwell, Johnson, 2000).
Фотоиндуцированное выделение водорода микроводорослями
Потребление энергии человечеством с каждым годом все возрастает. Современная энергетика более чем на 90% базируется на использовании химического топлива на основе природных горючих ископаемых: нефти, газа, угля (и продуктов их переработки), запасы которых на планете ограничены и будут в конце концов истощены. Это определяет, с одной стороны, необходимость энергосбережения и разработку высокоэффективных методов добычи и переработки всех доступных видов ископаемого топлива, а с другой -поиск новых источников энергии. Более того, при сжигании природных ископаемых образуется большое число разнообразных вредных веществ, в первую очередь огромных количеств двуокиси углерода, что, как считают многие экологи, является первейшей причиной глобального потепления климата Земли. Этот факт определяет принципиальное ограничение дальнейшего развития энергетики на основе природных источников энергии и стимулирует поиск новых (см. обзоры Melis, Норре, 2004; Kruse et al., 2005а, Кузык и др., 2005).
Одним из наиболее перспективных видов топлива является водород. Среди его достоинств можно выделить высокую энергоемкость и возможность использования в топливных элементах. Единственным продуктом его горения является вода, поэтому водород представляет собой самое экологически чистое топливо. Кроме того, Нг является ценным сырьем для химической промышленности. В связи с этим в последние годы весьма интенсивно развиваются методы для его получения. Наибольший интерес представляют биологические методы получения Н2. Известно, что микроорганизмы разных таксономических групп способны к образованию Н2 (Biochenko et al., 2004; Цыганков, 2007). Вследствие различия источников энергии, доноров электронов, а так же водородактивирующих ферментов, пути метаболизма, приводящие к образованию Н2 в различных микроорганизмах, существенно различаются. Процессы образования Н2 в различных биологических объектах можно подразделить на темновое (например, осуществляемое анаэробными ферментативными бактериями) и светозависимое выделение водорода микроводорослями (см. обзоры Prince, Kheshgi, 2005; Kapdan, Kargi, 2006; Цыганков, 2007). В данной главе будет рассмотрено светозависимое образование Н2 зелеными микроводорослями. Это направление является весьма перспективным, поскольку микроводоросли осуществляют этот процесс, используя неисчерпаемые ресурсы - воду и солнечную энергию.
Впервые образование Н2 фотосинтезирующими микроводорослями было открыто более 60 лет назад. Гаффрон заметил, что зеленая микроводоросль Scenedesmus obliquus в анаэробных условиях способна использовать Н2 как донор электронов в процессе фиксации С02 в темноте (Gaffron 1942, 1944) или выделять Н2 на свету (Gaffron, Rubin, 1942). В последующие годы были проведены исследования, направленные на изучение процесса образования Н2. Используя различные ингибиторы ЭТЦ, Гаффрон с сотрудниками показал, что образование Н2 на свету связано с ППФ (Stuart, Gaffron, 1972). Позднее было показано, что выделение Н2 усиливается в условиях отсутствия С02. Это позволило предположить, что пути фиксации С02 и образования Н2 являются конкурентными процессами (Kessler, 1973, 1974). Кроме того, было показано, что к образованию Н2 способны многие зеленые и сине-зеленые микроводоросли: Chlorella, Chlamydomonas, Anabaena, Scenedesmus и др. (см. обзор Kessler, 1974). В настоящее время показано, что образование Н2 микроводорослями катализируется ферментом гидрогеназой, осуществляющей простую обратимую химическую реакцию - восстановление протонов (Н+) до молекулярного Н2(см. обзор Das et al., 2006):
Непосредственным донором электронов в гидрогеназной реакции у зеленых микроводорослей является Фд, восстановленный фотосинтетической электронтранспортной цепью. Одновременно с водородом у этих объектов происходит выделение 02, что позволяет назвать этот процесс биофотолизом воды (Benemann, 1996). Поскольку кислород даже в очень низких концентрациях инактивирует как активность гидрогеназы (Ghirardi, et al., 1997, 2000), так и экспрессию ее генов (Нарре, Kaminski, 2002), фотоиндуцированное выделение Н2 микроводорослями предварительно инкубированными в темноте для установления анаэробиоза, длилось всего несколько минут (см. обзор Biochenko, Hoffmann, 1994). Стало очевидным, что необходимо найти способ разделить стадии выделения кислорода и водорода. Были предприняты попытки удалить 02 из среды, продувая культуру инертными газами (аргон или азот) или используя ингибиторы фотосинтеза, однако это не привело к желаемому результату (Benemann, 2000). Пытались также повысить устойчивость гидрогеназ к 02 используя случайный мутагенез и отбор полезных мутантов (Flynn et al., 2002). Было показано, что водород может диффундировать к активному центру гидрогеназы через большое количество полостей в молекуле фермента, тогда как 02 проникает к активному центру гидрогеназы только по двум «каналам». На основе этого, путем сайт-направленного мутагенеза, методами молекулярной биологии и генной инженерии предлаглось уменьшить размер «каналов», по которым 02 поступает в активный центр (Cohen et al., 2005). Это позволило бы сделать гидрогеназы менее зависимыми от внешнего 02. Работы в этом направлении активно ведутся, хотя к данному моменту еще не завершены. Наиболее успешным на данный момент оказался метод, разработанный несколько лет назад двумя группами ученых из Национальной лаборатории возобновляемых источников энергии, Колорадо, США и Калифорнийского университета (Ghirardi et al., 2000, Melis et al., 2000). Этот способ основан на культивировании зеленых микроводорослей {Clamydomonas reinhardtii) в герметично закрытом культиваторе на постоянном свету в условиях серного голодания.
Как известно, сера - один из обязательных физиологически значимых элементов, необходимый для нормального роста и развития всех организмов. Она входит в состав основных аминокислот, таких как цистеин и метионин, и других важных клеточных компонентов, например сульфолипидов (см. обзоры Leustek et al., 2000; Grossman, Takahashi, 2001; Kopriva, 2006). Известно, что недостаток серы приводит к изменению как морфологических, так и физиологических характеристик микроводорослей. Так у голодающей по сере культуры С. reinhardtii клетки увеличиваются в размере, а их форма изменяется с эллипсоидной на сферическую (Grossman, 2000; Zang et al., 2002), что связано с остановкой процесса деления. Так, по некоторым данным, концентрация голодающих по сере клеток к 96 ч эксперимента уменьшается на 20% по сравнению с контролем (Wikoff et al., 1998).
Регистрация окислительно-восстановительных изменений пигмента РЦ ФС1 (Р700)
Изменения абсорбции окисленной формы пигмента РЦ ФС (Р700+) измеряли по разности оптического пропускания препаратов на длинах волн 810 нм и 870 нм с помощью флуориметра РАМ-101 (Walz, Effeltrich, Германия) и эмиттер-детекторного блока ED-P700DW (Walz). Дифференциальный двухволновыи режим измерений, предусмотренный в эмиттерно-детекторнои системе ED-P700DW, устраняет мешающее влияние абсорбционных изменений пластоцианина и других переносчиков, что позволяет регистрировать сигнал, обусловленный только изменениями абсорбции окисленной формы Р700+ (Schreiber et al., 1988). Действующий белый свет (2000 мкЕ м с ) получали от источника KL-1500 (Schott, Germany). Для подведения измерительного и действующего света к объекту, а также для отведения пропущенного ИК света на детектор использовали разветвленный оптоволоконный кабель. Сигнал с выхода усилителя РАМ-101 записывали на быстродействующем самопишущем потенциометре. Записи сигналов сделаны на скорости развертки ленты 5 мм/с.
Концентрация клеток, используемая в экспериментах, составляла 300-Ю6 кл/мл. Перед измерением клетки обрабатывались 15 мМ DCMU. В ходе измерений суспензию водорослей помещали в кювету с толщиной оптического пути 1мм.
Для определения концентрации хлорофилла 2 мл суспензии клеток осаждали центрифугированием (8000 об./мин, 5 мин). Полученный осадок доводили до 2 мл 95% этанолом и оставляли на 1 ч. Выпавший осадок центрифугировали (8000 об./мин, 5 мин), супернатант сливали и определяли в нем содержание хлорофиллов спектрофотометрически (Lichtenthaler, 1987.). Содержание пигментов рассчитывали по формулам: Са = 13,36 А664,2- 5,19 Состав каратиноидов определяли методом жидкостной хроматографии (HPLC), описанным (Solovchenko et al., 2001), с некоторыми изменениями. Экстракцию производили 90% ацетоном с водой в течение часа. Полученный центрифугированием (8000 об/мин, 10 мин.) супернатант выпаривали на роторном испарителе. Высушенный экстракт растворяли в 300 мкл чистого ацетона. HPLC был выполнен на Knauer К-501 (Германия), снабженный детектором К-2501 (Германия).
Для определения белка 2 мл суспензии клеток осаждали центрифугированием (8000 об./мин, 5 мин). Осадок хранили при -79С. Размороженный осадок суспендировали в 0.2 мл среды, озвучивали ультразвуковым дезинтегратором УЗДН-1 (22 кГц, 4С) 2 раза по 1 мин и заливали 0.8 мл чистого ацетона, доводили до 2 мл 80%» ацетоном и оставляли на 1 ч. Выпавший осадок осаждали центрифугированием (8000 об./мин, 5 мин), супернатант сливали и определяли в нем содержание хлорофиллов спектрофотометрически (Lichtenthaler, 1987). Высушенный осадок суспендировали в 1 мл 1% додецилсульфата натрия (SDS) в физиологическом растворе (580 мг NaCl в 100 мл) и оставляли на ночь. Нерастворившийся осадок отделяли центрифугированием, в супернатанте определяли содержание белка по Лоури (Lowry et al., 1951).
Крахмал определяли по методу, описанному в (Gfeller, Gibbs, 1984) с некоторыми изменениями: 2 мл суспензии клеток осаждали центрифугированием (8000 об./мин, 5 мин). Осадок хранили при -79С. Размороженный осадок взбалтывали в 1 мл этанола, оставляли на 10 мин. Центрифугировали (8000 об./мин, 5 мин), осадок снова заливали 1 мл этанола, тщательно суспендировали. После центрифугирования осадок отмывали от следов спирта 1 мл 100 мМ ацетата натрия (доведенного до рН 4,5 ледяной уксусной кислотой). Обработку осадка ацетатом повторяли 2 раза. Полученный осадок суспендировали в 1 мл ацетата, переносили в стеклянные пробирки с крышками из фольги и автоклавировали 10 мин при 1 атмосфере. Охлажденные суспензии переносили в центрифужные пробирки и в каждую добавляли 2 единицы амилоглюкозидазы (раствор в ацетате натрия). Оставляли на ночь в термостате при 55С. Утром доводили уровень жидкости тем же ацетатом до 2 мл и центрифугировали. В супернатанте определяли содержание глюкозы с использованием реагента глюкозооксидаза-пероксидаза (Barham, Trinder, 1972.).
Скорости фотосинтетического выделения кислорода и темнового дыхания измеряли с помощью полярографической ячейки и электрода Кларка при температуре 25С. Пробу культуры объемом 2 мл помещали в ячейку, оборудованную магнитной мешалкой. Перемешиваемую пробу выдерживали в течение нескольких минут в затемненной ячейке для достижения концентрации кислорода в пробе равной концентрации кислорода в атмосфере, затем проводили измерение скорости дыхания. Далее в пробу добавляли 5 мМ NaHC03 и включали источник насыщающего фотосинтез света ( 1000 мкЕ м с"), чтобы инициировать процесс образования кислорода, и проводили измерение скорости его выделения, делали поправку на скорость дыхания.
Влияние отсутствия серы в среде на первичные процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное выделение Н2 культурой С. reinhardtii в замкнутом биореакторе
В замкнутом биореакторе при постоянном освещении голодающая по сере культура С. reinhardtii проходит 5 последовательных фаз: аэробную, стадию поглощения кислорода, анаэробиоз, выделение Н2 и стадию деградации клеток (Kosourov et al., 2002). Клетки С. reinhardtii начинают выделять Н2 после 16-40 ч серного голодания в зависимости от условий эксперимента (Kosourov et al., 2002; Zhang et al., 2002; Antal et al., 2003). Выделение H2 при серном голодании длится около 60-80 ч и зависит от многих факторов, например от уровня сульфата (Kosourov et al., 2005), плотности клеток (Kosourov et al., 2002), синхронизации деления (Tsygankov et al., 2002) и pH среды (Kosourov et al., 2003). Как видно из рисунка 3.13 А, в наших экспериментах, фаза выделения 02 длилась около 10 ч. В это время в культиваторе содержание 02 повышалось за счет выделения его ФС2. Уменьшение скорости фотосинтеза и увеличение дыхания при серном голодании является причиной снижения концентрации 02 в культиваторе и перехода культуры в анаэробиоз. Скорость выделения 02, измеренная с помощью электрода Кларка, за первые 24 ч голодания по сере уменьшалась вдвое (с 185 до 91,8 мкмоль/мг хл ч). Уменьшение скорости фотосинтетического выделения 02 вызывается переходом СЬ-восстанавливающих центров ФС2 в С?в-невосста-навливающие и фотодеструкцией части белка D1. QB-невосстанавливающие центры резистентны к фотоингибированию и могут служить пулом центров ФС2 для последующего восстановления кислород-выделяющей активности после удаления стресса (Wykoff et al., 1998). В то же время скорость дыхания в наших экспериментах увеличивалась с 34 до 60 мкмоль/мг хл ч. Увеличение дыхания обусловлено, по-видимому, избытком субстрата. Этот факт неоднократно отмечался в литературе (Melis et al., 2000; Zang et al., 2002; Kosourov et al., 2002). Во всяком случае, содержание восстановителей, которые могут локировать электроны в ЭТЦ фотосинтеза через пул хинонов возрастает, об этом свидетельствует увеличение у голодающих клеток скорости темпового восстановления Р700 в присутствие диурона. По нашим данным, за первые 24 ч серного голодания полувремя восстановления Р700 увеличивалось с 8,2 до 0,4 с.
Начало регистрируемого выделения Нг было зафиксировано через 9 ч после установления анаэробных условий (рис. 3.13 А). Общий объем выделившегося газа за 60 ч составлял около 200 мл/л (рис. 3.13 А). Поскольку используемый нами в этом случае волюмометрический метод не позволяет определять газ, растворенный в жидкости, можно полагать, что процесс выделения водорода начинался раньше. Методом газовой хроматографии было показано, что к 80 ч серного голодания концентрация Н2 в газовом пространстве культиватора составляла около 6 ммол/л.
Регистрация параметров флуоресценции Хл а методом РАМ при постоянном освещении непосредственно в культиваторе позволяет выявить изменения активности ФС2 в клетках С. reinhardtii на всех стадиях голодания, предшествующих выделению водорода, и на стадии его выделения. Изучение динамики активности ФС2 С. reinhardtii в замкнутом культиваторе показало, после 10 ч серного голодания, в стадии поглощения 02 постепенно снижалась величина AF/Fm , характеризующая эффективность запасания энергии ФС2 в данных условиях (рис. 3.13 Б). При этом, оба параметра флуоресценции Ft и Fm возрастали. Медленную инактивацию ФС2 связывают с неспособностью РЦ к фотохимическому тушению возбуждения вследствие высокой восстановленное пула хинонов, которая достигается в результате усиления хлородыхания (Zhang et al., 2002).
Как отмечалось ранее, на фоне медленного снижения величины AF/Fm наблюдается быстрое падение этой величины в момент установления анаэробных условий. Причем быстрая инактивация ФС2, в отличие от медленной, обратима при возврате к аэробным условиям (Antal et al., 2003). В наших экспериментах, мы также наблюдали быстрое (минуты) снижение величины AF/Fm с 0,16 до нуля, что свидетельствует о полной инактивации ФС2. При этом увеличение Ft происходило быстрее, чем Fm , поэтому наблюдаемое уменьшение AF/Fm происходит главным образом за счет роста Ft, что указывает, согласно данным (Cournac et al., 2000) на увеличение восстановленности пула хинонов.
Через 9 ч после установления анаэробных условий величина AF/Fm и, следовательно, активность ФС2, начинали возрастать, что указывает на участие ФС2 в донировании электронов к ФС1 и далее через ферредоксин к гидрогеназе (фаза выделения Н2). При этом мы наблюдали постепенное снижение как Ft так и Fm , что иногда объясняют частичной деградацией клеток (Kosourov et al., 2005). Однако в наших экспериментах концентрация хлорофилла в течение всего эксперимента практически не изменялась. Проведенная нами микроскопия голодающих по сере клеток С. reinhardtii с помощью флуоресцентного микроскопа показала, что до 70 ч все клетки культуры остаются живыми. Количество флуоресцирующих клеток снижается на 10% только к 120 ч голодания. Следовательно, уменьшение значений параметров флуоресценции {Ft, Fm ) может быть связано с изменениями в процессах запасания и диссипации энергии.
Нарушения активности ФС2 в фазе поглощения 02 и небольшое ее восстановление в фазе выделения Н2 подтверждает анализ кинетических кривых флуоресценции клеток С. reinhardtii, отобранных анаэробно из культиватора на разных стадиях голодания, исследованных методом РАМ. Суспензии клеток отбирались из культиватора в фазе поглощения 02, анаэробной и фазе выделения Н2. В качестве контроля использовали суспензию клеток, отобранную из культиватора в фазе выделения 02. Измерения производились после 2 мин адаптации клеток к темноте. В кинетике нарастания флуоресценции как правило, выделяют несколько компонент. Начальная, быстрая компонента (Fo-Fi) обусловлена наличием в ФС2 QB-невосстанавливающих центров, медленная (Fi-Fp) - QB-восстанавливающих. Максимальный уровень флуоресценции (Fp) определяется восстановленностыо пула хинонов, снижение Fp связывают с окислением пула хинонов ФС1 и начинающимся развитием нефотохимического тушения (Lazar et al., 1999).
Как видно из рисунка 3.14 Б, через 18 ч серного голодания немного увеличился уровень Fo и значительно увеличивалась доля QB-невосстанавливающих центров по сравнению с контролем. Небольшое увеличение Fo можно объяснить отсоединением части белков малой антенны от корового комплекса ФС2 (Briantais et al., 1998). У голодающей культуры пока еще, наблюдается снижение максимального уровня флуоресценции за счет начинающегося нефотохимического тушения. Время перехода от уровня Fi к Fp кривой флуоресценции определяется скоростью восстановления пластохино-нового пула (Krause, Weis, 1991). Оно уменьшалось через 18 ч серного голодания от 1300 до 890 мс (рис. 3.14 А, Б), поскольку пул хинонов у голодающих клеток более восстановлен. В анаэробной фазе (рис. 3.14 В) кривая индукции флуоресценции имела только быструю компоненту, так как к этому времени все центры становятся QB-невосстанавливающими.
