Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы; постановка задачи 7
1.1. Газообмен растений 7
1.2. Индукция фотосинтеза 9
1.3. Индукция флуоресценции и замедленной люминесценции фотосистемы 2 10
1.4. Триозофосфатный транслокатор 12
1.5. Влияние неорганического фосфата на эффективность фотосинтеза 13
1.6. Синтез крахмала 14
1.7. Циклический электронный транспорт вокруг ФС1 17
1.8. Методы исследования циклического транспорта 20
1.8.1. Регистрация термолюминесценции 20
1.8.2. Измерение окислительно-восстановительного состоянияр700 24
1.9. Синтез и транспорт сахарозы 25
1.9.1. Ингибиторы транспорта сахарозы 29
1.10. Теоретические модели фотосинтеза 31
1.11. Постановка задачи 33
ГЛАВА II. Методика теоретических расчетов и экспериментов 36
II. 1. Описание теоретической модели 36
II.2. Методика измерения замедленной люминесценции 39
II.3. Методика измерения содержания крахмала в листьях гороха 41
II.4. Методика измерения газообмена 41
II.5. Методика измерения окислительно-восстановительного состояния Р700 43
II.6. Методика измерения термолюминесценции 47
II.7. Методика инфильтрации ингибиторов и сахаров 49
II.8. Объекты исследования 49
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 50
III. 1. Теоретическое исследование влияния метаболизма неорганического фосфата на ширину индукционных кривых фотосинтеза при непрерывном и импульсном освещении 50
III.2. Теоретическое исследование регуляторной роли синтеза крахмала 56
III.3. Экспериментальное исследование мутантов гороха с недостатком крахмала в семенах 62
III.3.1. Измерение содержания крахмала в листьях мутантов 62
III. 3.2. Измерение газообмена листьев мутантов и дикого типа гороха 63
III. 3.3. Влияние недостатка крахмала в листьях гороха на параметры кривых индукции замедленной люминесценции. 66
III. 3.4. Активация циклического транспорта в листьях гороха мутантов rrrbrb с недостатком крахмала и дикого типа rrrbrb 70
III. 3.4.1. Влияние увеличения температуры на активацию циклического транспорта в листьях гороха (pisum sativum) 74
III. 3.4.2. Влияние добавления сахаров на активацию циклического транспорта в листьях гороха (pisum sativum) 78
III. 3.4.3. Чувствительность циклического транспорта в листьях гороха (pisumsativum) кантимицинуа иротенону. 82
III.4. Экспериментальное исследование влияния оттока сахарозы из листьев высших растений на параметры кривых индукции замедленной люминесценции 85
Выводы 99
Список литературы 100
- Индукция фотосинтеза
- Методы исследования циклического транспорта
- Методика измерения содержания крахмала в листьях гороха
- Теоретическое исследование регуляторной роли синтеза крахмала
Введение к работе
Фотосинтез является процессом, в ходе которого происходит превращение световой энергии в энергию химических связей. Выделяющийся в процессе фотосинтеза кислород является важнейшим веществом для поддержания жизни на Земле. Поэтому изучение процессов фотосинтеза и возможных механизмов регуляции эффективности усвоения углерода имеет большое значение. Взаимосвязь различных процессов фотосинтеза обеспечивает жизнедеятельность растения в изменяющихся условиях. Изучение регуляторных связей позволяет выводить растения, приспособленные к резким изменениям климата, содержащие различное количество Сахаров и других веществ, а также позволяет создавать условия, благоприятные для оптимального роста и развития растения. В настоящее время известно молекулярное строение основных компонентов фотосинтетического аппарата, фотохимические и биохимические реакции фотосинтеза. Однако механизмы взаимодействия между ними и способы регуляции остаются неизученными.
Взаимодействие световых и темновых реакций фотосинтеза особенно ярко проявляется в процессах индукции, когда происходит переход адаптированного к темноте растения к стационарному фотосинтезу после включения возбуждающего света. Индукция объясняется несколькими причинами, в том числе активацией ферментов цикла Кальвина, которая зависит от концентраций метаболитов цикла Кальвина и запасных веществ, а также от энергетического потенциала клетки. На практике для исследования индукционных процессов часто используют флуоресцентные методы, в том числе быструю флуоресценцию и замедленную люминесценцию. Поскольку световые стадии фотосинтеза через цепь электронного транспорта связаны с темновыми реакциями ассимиляции углерода, то характеристики люминесценции зависят не только от состояния светособирающих пигментов и компонентов цепи электронного транспорта, но и от биохимических процессов, происходящих в цикле Кальвина. В связи с этим большой интерес представляет изучение влияния транспорта и запасания продуктов ассимиляции углерода на первичные процессы фотосинтеза.
Также как и другие процессы метаболизма, ассимиляция углерода при фотосинтезе подвержена контролю и регуляции. Регуляция осуществляется посредством изменения активности ферментов, как правило, катализирующих необратимые реакции; а также изменением концентраций метаболитов по закону действующих масс и транспортом метаболитов между хлоропластом и окружающей его клеточной средой. Наиболее важным в жизнедеятельности растительной клетки является обмен неорганического фосфата с триозофосфатом, осуществляемый триозофосфатным транслокатором. Работа этого белка
подвержена регуляции концентрацией фосфата внутри и снаружи хлоропласта и определяет, какая часть фиксированного углерода будет участвовать в восстановительной фазе цикла Кальвина, какая часть пойдет на синтез крахмала, а какая часть будет транспортироваться из клетки и превращаться в сахарозу.
Синтез крахмала в хлоропластах также регулируется концентрацией неорганического фосфата. Важную роль в этом процессе играет фермент АДФглюкозопирофосфорилаза, от активности которого зависит скорость синтеза крахмала. Содержание крахмала в хлоропластах растительных клеток влияет на эффективность фиксации углерода и на первичные реакции фотосинтеза. В частности, недостаток крахмала может приводить к активации циклического транспорта, исследование которого позволяет более детально изучить процессы переноса электронов и механизмы регуляции активности ФС2. Большую помощь в исследовании регуляторной роли крахмала оказывает использование мутантов с мутациями в генах, отвечающих за активность АДФглюкозопирофосфорилазы, и имеющих недостаток крахмала в семенах.
Помимо перечисленных способов контроля эффективности ассимиляции углерода на уровне клетки существует регуляция посредством переноса питательных веществ по целому растению. Большое значение здесь занимает транспорт сахарозы из листьев. Сахароза играет важную роль в регуляции фотосинтеза. Известно, что низкое содержание Сахаров приводит к стимуляции фиксации СОг, деградации крахмала и усиленному транспорту Сахаров. Избыток Сахаров стимулирует рост растения и накопление запасных веществ.
Цель данной работы состоит в исследовании механизмов регуляции активности цикла Кальвина транспортом продуктов ассимиляции СОг, а также регуляторной роли синтеза крахмала методами индукции флуоресценции и замедленной люминесценции, термолюминесценции и методом измерения окислительно-восстановительного состояния Р700.
Индукция фотосинтеза
Если ярко осветить зеленые листья, которые до этого находились в полной темноте, фотосинтетические процессы выделения О2 и фиксации СОг достигают максимальной скорости не сразу, а спустя несколько минут. Эта начальная задержка получила название "индукции" [3]. Индукция представляет собой искусственный процесс, поскольку резкий переход растения из темноты в условия яркого освещения в природе встречается очень редко. Тем не менее, она отражает регуляторные взаимодействия световых и темновых стадий фотосинтеза. Изучение процессов индукции позволяет гораздо лучше понять механизмы регуляции и взаимосвязь между хлоропластом и клеткой, в которой он находится. Впервые периоды индукции, которые длились несколько минут при комнатной температуре, зарегистрировали Остерхаут и Хасс, проводившие в 1918 г. опыты с зеленой водорослью Ulva, а также Варбург, работавший в 1920 г. с хлореллой. Наиболее важные исследования индукционных процессов фотосинтеза осуществили Мак-Алистер и Майерс, измерявшие поглощение СОг листьями пшеницы [3].
Индукция, как предполагали Остерхаут и Хасс, объясняется либо светоактивацией ферментов и их дезактивацией в темноте, либо истощением в темноте промежуточных продуктов, образованных в цикле Кальвина на свету [3]. В темноте происходит фиксация углерода и, следовательно, расходуется акцептор СОг, для восстановления которого требуются молекулы АТФ и НАДФН, которые в темноте не синтезируется. Поэтому со временем концентрация акцептора СОг и других метаболитов цикла Кальвина уменьшится.
Современные исследователи прибегают к объяснению индукции взаимодействием этих двух механизмов: светоактивацией ферментов и накопления промежуточных продуктов [3]. Например, постепенное накопление важного промежуточного продукта может также вызвать аллостерическую активацию фермента, катализирующего синтез этого продукта. В пользу объяснения индукции активацией ферментов на свету и накоплением промежуточных продуктов свидетельствует недостаток акцептора СОг в начале светового периода и автокаталитическое изменение его концентрации на свету до значения, необходимого для протекания фотосинтеза [6]. Здесь накопление акцептора СОг в течение индукционного периода происходит не только по принципу автокатализа, но и благодаря тому, что триозофосфат в основном включается обратно в цикл Кальвина, а не превращается в крахмал или экспортируется в цитозоль. Кроме триозофосфата (ТФ) на индукционный периодоказывает влияние присутствие ФГК и неорганического фосфата (Фн). Реакция превращения ФГК в ДФГК является энергетически невыгодной, осуществляется в присутствии высоких концентраций ФГК и чувствительна к падению отношения [АТФ]/[АДФ], следовательно, индукционный период связан с увеличением концентрации ФГК. Если в среде присутствует большое количество неорганического фосфата, то ТФ будет выходить из цикла Кальвина, и индукционный период возрастет, так как на регенерацию РуБФ потребуется больше времени [3]. В работе Р. Е. Хауслера на мутантах табака с ограничением транспорта Фн и ТФ было показано, что содержание ФГК в них возрастает по сравнению с растениями дикого типа, и индукционный период сокращается [7]. Таким образом, в процессах индукции проявляются многие механизмы регуляции фотосинтеза.
Одним из методов изучения индукции в целых растениях и листьях является исследование кинетики флуоресценции и замедленной люминесценции ФС2. Поскольку процессы захвата и передачи энергии молекулами пигментов не обладают абсолютным совершенством, существует вероятность ее потери, в том числе, в результате излучения квантов света с энергией, равной энергии перехода молекулы пигмента из первого синглетного возбужденного состояния в основное. Если такое излучение происходит до того, как произойдет разделение зарядов в реакционном центре, то оно называется флуоресценцией. Если такое излучение произошло в результате рекомбинации первоначально разделенных зарядов в реакционном центре, то оно называется замедленной люминесценцией. Рекомбинационные процессы происходят как в фотосистеме 1, так и в фотосистеме 2. Однако замедленная люминесценция из фотосистемы 1 по интенсивности составляет не более 1% от общей интенсивности послесвечения [8]. Замедленная люминесценция и флуоресценция не отличаются по спектру излучения, но имеют разное время затухания [9].
Индукционная кривая флуоресценции состоит из двух фаз: быстрой, в течение которой происходит подъем флуоресценции в первую секунду облучения, и медленной, когда в течение нескольких минут происходит спад флуоресценции. Быстрая фаза относится к первичным процессам ФС2, тогда как медленная фаза связана с взаимодействиями между процессами в мембранах тилакоидов и метаболическими процессами в строме, главным образом с метаболизмом углерода [10]. Спектр замедленной люминесценции подобенспектру флуоресценции, однако он может быть зарегистрирован после выключения возбуждающего света. Максимум замедленной люминесценции, возникающий в первую секунду индукционного периода, как правило, совпадает с моментом достижения максимального значения быстрой флуоресценции. Величины этих максимумов отражают окислительно-восстановительные переходы на акцепторной стороне ФС2. Также быстрая фаза индукции замедленной люминесценции приписывается изменениям электрического потенциала, зависящего от состояния реакционного центра ФС2. Второй максимум замедленной люминесценции (примерно на 10 секунде индукционного периода) может быть связан с индуцируемым фотонами градиентом протонов, а также с инициацией темновых реакций фотосинтеза [11]. Между перечисленными максимумами, быстрой и медленной фазами замедленной люминесценции, есть хорошо выраженный спад, который, возможно, является результатом закрытия реакционных центров ФС2 в течение восстановления пулов пластохинонов. Последующие небольшие по интенсивности максимумы замедленной люминесценции, по всей видимости, связаны с активацией цикла Кальвина, инициируемой накоплением АТФ и восстановлением АДФ. На практике выделить все перечисленные компоненты индукционной кривой замедленной люминесценции возможно с помощью метода одновременной регистрации сигнала в 50 последовательных временных интервалах длительностью 100 мкс каждый [12].
Интенсивность излучения флуоресценции и замедленной люминесценции пропорциональна концентрации возбужденных молекул пигментов, образующихся как при поглощении квантов света и передаче энергии возбуждения от соседних пигментов, так и в результате вторичного заселения возбужденных состояний в обратных реакциях первичных фотопродуктов. Поэтому регистрация этого излучения позволяет судить об эффективности переноса поглощенного кванта света к реакционному центру, разделения зарядов в них и использовании энергии разделенных зарядов в окислительно-восстановительных реакциях компонентов реакционного центра с компонентами электронтранспортной цепи фотосинтеза. Так, в работе Б. Страссера на суспензии клеток Scenedesmus obliquus было показано, что различия в кинетике флуоресценции, наблюдаемые при повышении температуры, при обработке различными концентрациями гидроксиламина (NH2OH), действующего как электронный донор для реакционного центра фотосистемы 2, и при добавлении ДХММ, известного, как блокатор электронного переноса между Qa и Qt,, могут быть объяснены дисбалансом между электронным потоком из реакционного центра на акцептор и электронным потоком на реакционный центр от донора [13]. Помимо этого измерение флуоресценции хлорофилла в совокупности с измерениями скорости выделения 02 и поглощения СОг позволяет оценить скорость электронного транспорта [14].
Методы исследования циклического транспорта
Разделение зарядов, с которым связана замедленная люминесценция, является температурнозависимым процессом. Методика измерения термолюминесценции имеет более широкие возможности, чем замедленная люминесценция, которая регистрируется при постоянной температуре, для изучения первичных процессов фотосинтеза. Термолюминесценция регистрируется в ходе нагревания предварительно охлажденного и облученного образца. При постепенном нагревается проявляются различные типы заряженных пар, рекомбинация которых приводит к появлению элементарных пиков термолюминесценции. Каждый элементарный пик термолюминесценции соответствует фазе экспоненциального затухания люминесценции. [65].
Разделенные заряды запасаются в виде 1) электрона на первичном хиноновом акцепторе, Qa", затем на вторичном акцепторе, Qt " и 2) четырех положительных дырок, представляющие собой состояния Si+, S2+, 8з+ и S4+ марганцевого комплекса расщепления воды. Из этих состояний только S2 и S3 способны рекомбинировать с Qa" и Qb". Переходное состояние S4+ переходит в So во время выделения молекулы кислорода из двух молекул воды [66]. Разделенные заряды в виде положительно заряженных переносчиков на донорной стороне ФС2 и электронов на акцепторной стороне ФС2 рекомбинируют разными способами, некоторые из которых приводят к образованию возбужденного состояния Р 680.
Короткая вспышка света (5 мкс) индуцирует один акт разделения зарядов на реакционном центре ФС2. Заряды стабилизируются в виде пары БгСЬ", которая может рекомбинировать с испусканием люминесценции, которую можно наблюдать в виде так называемого пика В термолюминесценции с температурным максимумом при 30С и 40С. Если термолюминесценция записывается после последовательности вспышек, то интенсивность пика В осциллирует с периодом 4 с максимумами после двух, шести и т.д. вспышек, что соответствует максимальному присутствию состояний S2+S3, способных рекомбинировать с Qa" и Qb". Состояние Si не способно к рекомбинации. В течение периода освещения возникает распределение состояний So, Si, S2 и S3. Состояния So и Si остаются стабильными в темноте, тогда как S2 и S3 переходят в Si, что приводит к распределению 1/4 So и 3/4 Si в адаптированных к темноте растениях. В листьях примерно 40 % Qb восстановлено, следовательно, отношение Qb /Qb слабо осциллирует с периодом 2 в соответствии с числом вспышек [65].
В изолированных тилакоидах при низком значении рН индуцируемый двумя вспышками пик В расщепляется на два пика: пик В1, происходящий из-за рекомбинации заряженных пар S3 Qb", и пик В2, возникающий благодаря рекомбинации заряженных пар S2 Qb". Состояние S3 в этом случае больше дестабилизируется протонированием, чем S2 [67]. В образцах, обработанных гербицидами (диурон и атрацин), которые блокируют транспорт электронов от Qa к Qb, накапливается восстановленный первичный хинон Qa", являющийся менее стабильным состоянием, чем Qb" и участвующий в рекомбинации с состояниями S2/S3 с образованием пика Q с максимумом при более низких температурах (примерно при 5 С в нейтральном рН), чем пик В [68]. В работах [68,69] предполагается, что пик С, наблюдаемый около 5 5 С, происходит благодаря рекомбинации состояния D+Qa". D+ означает окисленную форму тирозина D, пассивного донора ФС2. Функциональным электронным донором реакционного центра Р680 ФС2 является тирозин Z: Z+P68o -»Z++P68o"- Повреждение марганцевого комплекса при блокировании восстановления окисленного тирозина Z+ S-состояниями, приводит к появлению пика А примерно при -15С благодаря рекомбинации пар Z+Qb". Другие пики термолюминесценции появляются при более низких или высоких температурах ( 60С), рассмотрение которых для нас не представляет интереса, поскольку при таких температурах происходит повреждение фотосинтетического аппарата. Наоборот, интерес представляет пик AG ("послесвечение"), который наблюдается в интактных системах (интактных хлоропластах, водорослях и фрагментах листа). По мнению Ж.-М. Дюкруэ термин «послесвечение» (пик AG) отражает поток электронов от восстановленных структур в строме на пул пластохинонов и хиноновых акцепторов ФС2 и последующую их рекомбинацию с состояниями S2 и S3. Предполагается, что этот обратный перенос, которыйможет происходить различными способами от восстановленных акцепторов ФС1 в строме на пул пластохинонов, является индикатором циклического транспорта электронов или дыхания в хлоропластах [65]. Впервые пик "послесвечения" был описан В. Бертшем и Дж. Аззи в 1965 году, как скачок люминесценции, возникающий после облучения дальним красным светом ( 700 нм) [70]. В последствии Л. Бьерн показал, что это свечение относится к циклическому потоку электронов и чувствительно к увеличению температуры [71]. В то время, как заряженные пары БгСЬ и ЭзОУ участвуют в образовании пика В, состояния S2Qb и SsQb (с нейтральным хиноном) не приводят к испусканию люминесценции, пока электроны не попадают из стромы на Qb, вызывая испускание пика "послесвечения" AG. Интересно отметить, что это свечение, хотя и индуцируется дальним красным светом, который предпочтительно возбуждает ФС1, происходит из ФС2, что подтверждает наличие периода осцилляции интенсивности этого пика, равного 4 [65]. Дюкруэ отмечает,что даже слабое поглощение дальнего красного света ФС2 достаточно для создания состояний S2 и S3, участвующих в высвечивании [65]. Это "послесвечение", первоначально обнаруженное на водорослях, регистрируется и на листьях высших растений [72].
Интенсивность "послесвечения" усиливается с ростом температуры до 40С - 45С, являющейся пороговой для повреждения ФС2. Однако, более тонкие изменения происходят в области температур от 25С до 40С. Методом фотоакустической спектроскопии было показано, что при таких температурах активируется циклический транспорт электронов от восстановителей в строме на акцепторную сторону ФС2 [59]. Для предотвращения высвечивания пика AG в течение периода освещения дальним красным светом, можно использовать метод температурного скачка, который состоит в облучении образца при 10С, а затем в быстром увеличении температуры до 25С, 30С или 35С. В качестве альтернативы предложенному способу можно постепенно нагревать образец после возбуждения дальним красным светом при 10С или 0С. Эта процедура позволяет обнаруживать индуцируемый нагревом обратный перенос электронов к акцепторной стороне ФС2 в виде узкого пика термолюминесценции примерно при 45С [73]. Этот пик при 45С проявляет такие же свойства как "послесвечение": максимальное отношение интенсивностей пиков AG/B после трех вспышек и похожую чувствительность к некоторым химическим веществам. Например, добавление разобщителей или охлаждение ниже -5С подавляет пик AG и смещает пик В в область более низких температур, приводя к появлению одиночного пика при 35С. Основным свойством "послесвечения" является его подавление небольшой концентрацией антимицина А (5 мкМ), которая также избирательно ингибирует ферредоксин-пластохинон редуктазу, но не НАДФН-пластохинон-оксидоредуктазу, т. е. избирательно подавляет циклический транспорт [49, 50, 51]. В пользу этого свидетельствуеттот факт, что пик AG остается неизменным в мутантах табака с дефицитом НАДФН-дегидрогеназы [65]. В таких мутантах циклический электронный транспорт, оцениваемый по скорости восстановления Р700+ в темноте, полностью подавляется в растущих, молодых листьях, и остается неизменным в зрелых листьях [52].
В здоровых листьях узкий пик AG свидетельствует об индуцируемом теплом циклическом транспорте. Уширение или сдвиг в область более низких температур пика AG показывает, что циклический транспорт активен уже при более низких температурах. Для некоторых видов облученных растениях пик AG сдвигается в область более низких
Методика измерения содержания крахмала в листьях гороха
Для оценки эффективности фотосинтеза по поглощению СОг листьями гороха использовалась портативная измерительная система Li-Cor-6400, позволяющая регистрировать содержание СОг в листовой камере при постоянной температуре, влажности и освещении с минимальными изменениями в окружающей растительный материал среде. Устройство камеры для листа таково, что фотосинтез листа существенно не изменяет газового состава и влажности воздуха в измерительной камере. Измерения фотосинтеза основываются на сравнении содержания СОг в воздушном потоке, протекающем через кювету с образцом, и в воздушном потоке, проходящем через сравнительную кювету без образца. Опыт основывается на измерении поглощения СОг по интенсивности инфракрасного излучения. Концентрация СО2 в кюветах регистрируется откалиброванными в диапазоне от 0 до 1100 ррт (33,8 мкМ) СОг двумя независимыми инфракрасными газовыми анализаторами: газовым анализатором образца и газовым анализатором сравнения, что позволяет исключить временную задержку измерений и точно контролировать изменения газового состава анализируемого воздуха. Воздушный поток, поступающий в систему состоит из газа СОг известной концентрации, равной 423 ррт, и атмосферного воздуха. Любая доля входящего воздушного потока с помощью вентилей может направляться к трубкам, содержащим химические вещества для очистки и осушения воздуха. Поток воздуха создается насосом, мощность которого можно регулировать для созданияжелаемой скорости течения газа. В данной работе она составляла 500 мкмоль с . Сформировавшийся поток делится на две части отводными трубками. Одна часть поступает в кювету с образцом и к газовому анализатору образца, проходя через устройство, регистрирующее скорость потока, а другая часть потока поступает к газовому анализатору сравнения. Камера для образца имеет размер 4,4x4,4x0,3 см . Подложка для листа охлаждается вентилятором, мощность которого регулируется в зависимости от устанавливаемой температуры листа. Температура листа регистрируется с помощью термопары. Камера для листа освещена источником света, позволяющим выбирать спектральную область и интенсивность возбуждающего света. В данной работе температура листа поддерживалась около 22С±1С при интенсивности освещения образца равной 1500 мкмоль м 2 с"1. Известно, что при таком значении интенсивности света устанавливается стационарный фотосинтез для СЗ-растений [47].
Измерение фотосинтеза осуществляется путем контроля скорости изменения концентрации ССЬ в воздухе за короткий промежуток времени. Затем вычисляется чистая скорость фотосинтеза при помощи скорости изменения концентрации и других факторов, таких как площадь поверхности листа, помещенного в камеру, объем и температура. Определяющее значение в измерении концентрации СО2 имеет низкий уровень шумов Li-Сог-6400, примерно 0,2 ррт СОг. Это означает, что во время эксперимента изменение концентрации СОг на несколько ррт уже может регистрироваться.
Показателем открытия устьиц является параметр, отвечающий за устьичную проводимость. Когда лист помещается в камеру, влажность внутри камеры повышается из-за транспирации листа. В приборе Li-Cor-6400 это компенсируется за счет потока частично осушенного воздуха. Интенсивность транспирации вычисляется из величины изменения уровня влажности в листовой камере в зависимости от времени и скорости той части потока, которая проходит через осушитель. Затем интенсивность транспирации используется вместе с температурой листа и воздуха для вычисления общего сопротивления листа, из которого вычитается сопротивление пограничного слоя, в результате чего получается значение устьичного сопротивления и проводимости [1].
Все регистрируемые данные поступают в электронный блок, где они обрабатываются и выводятся на табло в совокупности с начальными установками. После каждого измерения все значения, зарегистрированные в оперативной памяти, отображаются на экране дисплея.В данной работе исследование фотосинтеза листьев гороха проводилось на основе А-Ci-кривых зависимости скорости поглощения СО2 листом от внутреклеточной концентрации СОг, определяемой непосредственно у центров рибулезобисфосфатазы. Предпосылки и возможности использования A-Ci-кривых для анализа фотосинтеза высших растенийрассмотрены в литературном обзоре. Внутриклеточную концентрацию СОг нельзя измерить экспериментально. В данной системе она автоматически рассчитывается в зависимости от проводимости мезофилла, температуры воздуха и влажности в камере для листа.
Перед началом измерений A-Ci-кривых лист был стабилизирован в темноте в течение примерно получаса при нормальных для атмосферы концентрациях СОг, примерно 400 ррт и 21% Ог, а затем при включенном белом свете с плотностью потока фотонов, составляющей 1500 мкмоль м"2 с"1 в течение примерно 1 часа, также как это делалось, например в работах Эйхельманн и Лайска [5] и Корника и Луасон [137]. Для получения А-Сі-кривьгх концентрация СОг в потоке, поступающем к образцу, изменялась от концентрации, соответствующей содержанию углекислого газа в атмосфере, до концентрации СОг, соответствующей СО2 компенсационной точке. Затем концентрация СО2 возвращалась к начальному значению и увеличивалась до верхнего предела, составляющего в данных экспериментах 1200-1400 ррт СОг. Такая последовательность изменения СОг была выбрана в соответствии с рекомендациями, данными в работе Г. Корника [4], а также согласно следующим соображениям. Высокая концентрация СОг может индуцировать закрытие устьиц, следовательно, если в рассмотрение включаются большие концентрации СОг, то они должны быть последними в серии. С другой стороны, если система находится в течение долгого времени вблизи СОг компенсационной точки, то может произойти дезактивация фермента рибулезобисфосфат карбоксилазы-оксидазы [2]. Полученные А-Сі-кривьіе сравнивались по скорости фиксации углерода в стационаре для листьев дикого типа и для мутантов гороха, определялось значение СОг компенсационной точки. По начальному наклону кривых оценивалась активность фермента РуБисКО, субстратом которого является С02.
Теоретическое исследование регуляторной роли синтеза крахмала
Из литературы известно, что синтез крахмала связан со скоростью фиксации углерода [37]. С помощью модели, включающей в явном виде синтез крахмала из ТФ, реакции которой представлены на рисунке 4, было исследовано влияние скорости синтеза крахмала на ширину индукционных кривых флуоресценции и НАДФН. Полученные кривые индукции флуоресценции и концентрации НАДФН при различных значениях константы скорости синтеза крахмала представлены на рисунках 18 и 19, соответственно.кривых индукции совпадает с началом фиксации СОг, поэтому по ширине кривых индукции можно судить о скорости поступления углерода в цикл Кальвина. Из расчетов видно, что с ростом скорости синтеза крахмала ширина кривых индукции увеличивается. Это можно объяснить тем, что с увеличением константы скорости синтеза крахмала все меньшая доля триозофосфатов поступает в цикл Кальвина на регенерацию РуБФ, стационарная скорость фиксации СОг достигается медленнее, и ширина кривых индукции увеличивается. В работах Г. Петтерссона [21,36] были получены зависимости стационарных концентраций интермедиатов цикла Кальвина и стационарной концентрации крахмала от внешней концентрации неорганического фосфата. Однако расчет зависимости стационарных концентраций метаболитов цикла Кальвина и стационарной концентрации крахмала от внешней концентрации неорганического фосфата с помощью модели, содержащей световые и темновые процессы фотосинтеза и синтез крахмала в явном виде, ранее не проводился. Нами были получены теоретические зависимости стационарных концентраций интермедиатов цикла Кальвина от начальной концентрации внешнего фосфата с помощью модифицированной модели, описанной в работе В. А. Караваева [133], в режиме с недостатком фосфата, найденным в работе С. А. Кузнецовой [135], чтобы система была более чувствительной к изменению концентрации внешнего фосфата. Полученные кривые представлены на рисунках 20 и 21.
Из рисунков видно, что концентрация ФГК уменьшается, концентрации ГЗФ, АТФ и РуБФ фактически не изменяются, концентрация ДФГК, крахмала и внешних триоз возрастают, но при очень большой концентрации внешнего фосфата можно заметить резкое изменение стационарных концентраций метаболитов цикла Кальвина. Это можно объяснить тем, что при докритической концентрации внешнего фосфата система успешно перерабатывает фосфат, который идет на образование АТФ, расходуется в цикла Кальвина и через фосфатный переносчик обменивается на ТФ. При критической концентрации внешнего фосфата ТФ начинают быстро выходить в цитозоль и частично включаются в синтез крахмала. Поэтому падают концентрации метаболитов цикла Кальвина таких, как РуБФ, ФГК и ДФГК, а концентрация внешних триоз и крахмала растет. Ортофосфат из хлоропласта фактически не выходит, поскольку активно экспортируются ТФ, а идет на синтез АТФ. Расход АТФ в реакциях восстановления РуБФ и ДФГК уменьшается, поскольку уменьшились концентрации субстратов в этих реакциях. Включение внутреннего Фн в синтез АТФ и ее замедленный расход в реакциях цикла Кальвина приводит к росту стационарной концентрации АТФ. АТФ образуется быстрее, чем идет ее расходование, из-за этого падает концентрация веществ в АТФ-зависимых реакциях, а ГЗФ выходит в цитозоль на образование сахарозы.
Выше, в главе I, упоминалось, что накопление крахмала линейно зависит от активности фермента АДФглюкозопирофосфорилазы, который активируется ФГК и ингибируется неорганическим фосфатом (Ф„). В работах Г. Петтерссона [21,36,129] была рассчитана стационарная концентрация крахмала в зависимости от внешней концентрации неорганического фосфата. Однако, зависимость скорости образования крахмала от отношения [ФГК]/[ФН] не учитывалась. Нами были рассчитаны стационарные концентрации метаболитов цикла Кальвина и стационарная концентрация крахмала при изменении начальной концентрации внешнего фосфата с учетом зависимости скорости синтеза крахмала от отношения [ФГК]/[ФН]. Для расчета данных зависимостей был выбран режим с недостатком фосфата. В этом режиме стационарная концентрация крахмала с ростом начальной внешней концентрации фосфата незначительно убьшает, как это видно из рисунка 22.Рисунок 22. Зависимость стационарных концентраций ДФГК, крахмала, внешних триоз и внутреннего ортофосфата от концентрации внешнего фосфата с учетом отношения ФГК/ФН в синтезе крахмала.
Получившийся результат можно объяснить тем, что с ростом начальной внешней концентрации фосфата концентрация ФГК в хлоропласте падает, а концентрация внутреннего фосфата неорганического фосфсата растет, следовательно, отношение [ФГК]/[ФН] убывает, а фермент АДФглюкозопирофосфорилаза инактивируется, поскольку он аллостерически регулируется этим отношением, и синтез крахмала замедляется.На рисунке 23 представлены стационарные концентрации некоторых метаболитов цикла Кальвина и АТФ в зависимости от начальной концентрации внешнего фосфата в режиме с недостатком фосфата.
