Регуляция хемотаксиса в жизненном цикле одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii Никитин Максим Михайлович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 9

1.1. Поведенческие реакции водорослей 9

1.1.1. Феноменология процессов и их классификация 9

1.1.2. Светозависимые поведенческие реакции 10

1.1.3. Хемотаксис 19

1.1.4. Аэротаксис 23

1.1.5. Магнитотаксис 23

1.1.6. Гравитаксис 24

1.2. Транспорт аммония у эукариот 26

1.2.1. Системы транспорта аммония у высших растений 26

1.2.2. Системы транспорта аммония у грибов 29

1.2.3. Системы транспорта аммония у Dictyostelium discoideum ЗО

1.2.4. Системы транспорта аммония у Chlamydomonas reinhardtii..31

1.3. Ассимиляция аммония у Chlamydomonas reinhardtii 36

Глава 2. Материалы и методы 41

2.1. Объекты исследования 41

2.2. Условия культивирования 42

2.3. Капиллярный метод изучения хемотаксиса 42

2.4. Определение 2-кето-кислот 43

2.5. Получение и определение количества образовавшихся гамет 43

2.6. Метод тетрадного анализа 44

2.7. Получение автолизина 45

2.8. Генетическая трансформация 45

2.9. Блот-гибридизация по Саузерну 48

2.10. Определение поглощения [14С]-метиламмония 48

2.11. Выделение тотальной ДНК и РНК 49

2.12. Метод ПЦР с предшествующей обратной транскрипцией 50

2.13. Метод ПЦР в режиме реального времени 51

2.14. Сайт-специфическая амплификация методом ПЦР 52

2.15. Секвенирование продуктов ПЦР 54

Глава 3. Результаты и обсуждение 56

3.1. Хемотаксис С. reinhardtii на разных этапах жизненного цикла. 56

3.1.1. Вегетативные клетки 57

3.1.2. Прегаметы и гаметы 60

3.1.3. Сигнальная функция света 62

3.1.4. Характеристика мутантов, способных к гаметогенезу в отсутствии светового сигнала 63

3.2. Роль ионов аммония в процессе преобразования системы хемотаксиса при гаметогенезе 64

3.2.1. Действие аминокислот на изменение хемотаксиса к аммонию в процессе гаметогенеза 65

3.2.2. Контроль дедифференцировки гамет ионами аммония 68

3.2.3. Действие мочевины на изменение хемотаксиса к аммонию в процессе гаметогенеза 70

3.2.4. Действие 0,1 -метионин-0,1 -сульфоксимина на хемотаксис к аммонию 71

3.3. Транспортеры аммония и их роль на разных этапах жизненного цикла С. reinhardtii 74

3.3.1. Системы LATS и HATS 74

3.3.2. Хемотаксис мутантов с повреждениями транспортера АМТ1;4 76

3.3.3. Получение и характеристика мутанта с нарушенной активностью системы HATS 78

Заключение 90

Выводы 93

Список литературы: 95

• Системы транспорта аммония у грибов
• Блот-гибридизация по Саузерну
• Характеристика мутантов, способных к гаметогенезу в отсутствии светового сигнала
• Получение и характеристика мутанта с нарушенной активностью системы HATS

Введение к работе

Направленное движение клеток в ответ на действие внешних стимулов, определяемое в литературе как поведение, описано у многих одноклеточных организмов на разных стадиях их развития. Поведение является наиболее сложной формой жизнедеятельности организма и в самом общем виде представляет собой формируемый организмом отклик на сигналы, поступившие к нему из окружающей среды (Гаазе-Раппопорт, Поспелов, 1987). В последние годы предпринимаются многочисленные попытки определения механизмов, лежащих в основе взаимодействия подвижных клеток с окружающей средой и последующей ориентированной относительно внешнего раздражителя двигательной реакции - поведенческой реакции. Поведенческие реакции часто называют таксисами. Таксисы описаны у различных представителей архей, бактерий и эукариотических микроорганизмов. Способность к поведенческим реакциям позволяет микроорганизмам искать питательные субстраты и избегать вредных воздействий. Для многих микроорганизмов, неподвижных в течение длительного периода вегетативного роста, подвижная стадия представляет собой единственную возможность целесообразной пространственной ориентации в окружающей среде, что может иметь немаловажное значение для выживания, так как подвижные клетки репродуктивной стадии могут обеспечивать не только функцию распространения организма, но и оптимизацию условий его жизнедеятельности и перехода к вегетативному росту. Особый интерес к изучению механизмов контроля двигательных поведенческих ответов можно объяснить как важной биологической ролью данного явления, так и выявленными взаимосвязями регуляции поведения одноклеточных организмов с такими фундаментальными процессами как дифференцировка клеток и межклеточная сигнализация при половом размножении.

В настоящее время наиболее подробно исследованы молекулярные механизмы зависимого от жизненного цикла контроля систем направленного движения бактерий, у которых охарактеризована природа регуляторных сигналов и выявлены механизмы экспрессии генов, продукты которых необ- ходимы для перехода к подвижной стадии (Ермилова и др., 2004). У эука-риотических микроорганизмов регуляция подвижности и поведения в жизненном цикле изучена главным образом у клеточного миксомицета Dictyos-telium discoideum с амебоидным типом движения (Williams, Harwood, 2003; Strmecki et al., 2005). Вместе с тем, у одноклеточных эукариот, обладающих жгутиками и ресничками, исследовалась в основном структурно-функциональная организация систем движения. Подобное ограничение связано с особыми требованиями, предъявляемыми к объектам исследования, и, прежде всего, с точки зрения знаний биологии, физиологии, частной генетики и наличия разработанных методов молекулярно-генетического анализа. В этом отношении Chlamydomonas reinhardtii является уникальным модельным организмом для проведения молекулярно-генетических исследований поведенческих реакций. В последние годы достигнуты значительные успехи в расшифровке молекулярных механизмов, контролирующих светозависимые поведенческие ответы (Ehlenbeck et al., 2002) и хемотаксис к органическим соединениям у этого модельного микроорганизма (Ermilova et al., 2000). С целью расширения, углубления и детализации механизмов контроля направленного движения С. reinhardtii необходим анализ дополнительных систем рецепции и передачи сигналов на разных этапах жизненного цикла организма.

Целью настоящей работы являлось комплексное исследование хемо-таксиса С. reinhardtii к наиболее предпочтительному для микроорганизма источнику азота, ионам аммония, на разных этапах жизненного цикла, а также выявление физиологической основы взаимосвязи между процессами ассимиляции аммония и направленного движения к аммонию (хемотаксиса). Задачи работы были связаны с решением принципиальных вопросов, ранее не освещенных в литературе. В частности, предполагалось экспериментально исследовать и теоретически проанализировать:

1. Хемотаксис к аммонию подвижных клеток, представляющих разные стадии жизненного цикла: вегетативные клетки, прега-меты (некомпетентные гаметы), гаметы.

Действие сигналов (голодание по источнику азота, свет), регулирующих формирование зрелых гамет, на характер реакции хемотаксиса к аммонию.

Два типа транспортных систем для переноса аммония в клетки, транспортеров с низким сродством к аммонию (LATS) и транспортеров с высоким сродством к аммонию (HATS), у вегетативных клеток, прегамет и гамет.

Возможную роль транспортеров аммония в контроле реакции хемотаксиса к аммонию.

В процессе изучения реакции хемотаксиса к аммонию у Chlamydomonas reinhardtii был получен фактический материал, показывающий, что ор-ганизация аппарата хемотаксиса изменяется на разных этапах жизненного цикла, в частности вегетативные клетки и прегаметы демонстрируют хемотаксис к аммонию/метиламмонию, тогда как зрелые гаметы утрачивают хе-мотактическую активность к ним. Установлено, что сигналы, контролирующие утрату реакции хемотаксиса, те же, что и в случае контроля формирования состояния компетентности у гамет: голодание по азоту и свет. Предложена схема предполагаемого взаимодействия сигналов в клетках Chla-mydomonas в ходе гаметогенеза. Впервые проанализирована активность двух типов транспортных систем на разных этапах жизненного цикла и описаны особенности экспрессии восьми генов семейства Amtl. Впервые показано, что LATS-система у Chlamydomonas reinhardtii включает неспецифичные чувствительные к TEA К⁺-каналы. Получены данные, свидетельствующие, что транспортеры аммония Chlamydomonas играют ключевую роль в способности этого одноклеточного организма к реакции хемотаксиса к аммонию.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературных данных, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 112 страницах, содержит 10 таблиц и 33 рисунка, список литературы включает 187 наименования. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. . Глава 1. Обзор литературы 1.1. Поведенческие реакции водорослей 1.1.1. Феноменология процессов и их классификация

Поведенческие реакции подвижных одноклеточных организмов определяют как активную ориентацию клеток в соответствии с внешними сигналами (Hinrichsen, 1993). Суммарный результат поведенческих реакций проявляется в неравномерном распределении клеток в пространстве относительно сигналов, поступивших из среды. В зависимости от характера поступающего сигнала, вида и функционального состояния организма, а также условий внешней среды может наблюдаться либо скопление клеток (аккумуляция), либо уменьшение их количества (рассеивание). Эти эффекты часто обозначали соответственно как положительный и отрицательный таксис (Maier, 1993). Однако как скопление, так и рассеивание клеток в пространстве может быть в разных случаях следствием различных по механизму двигательных ответов.

В настоящее время выделяют три основных типа поведенческих реакций в ответ на сенсорные сигналы, которые определяют распределение популяции организмов в пространстве (Diehn et al., 1977; Maier, 1993; Ruffer, Nultsch, 1995). Кинез, реакция, при которой уровень двигательной активности организма зависит от абсолютной величины стимула (интенсивность света, концентрация хемоэффектора) без изменения его пространственного градиента. Если при таком воздействии изменяется скорость линейного перемещения, то реакцию определяют как ортокинез, а если изменяется частота актов смены направления движения, то такую реакцию определяют как клинокинез. В соответствии с этой классификацией хемосенсорное поведение, описанное у бактерий, имеющих жгутики, и часто называемое в литературе хемотаксисом, по существу является хемоклинокинезом, а хемосенсорное поведение простейших рода Paramecium — результатом хемоорто-и хемоклинокинеза. Таксис определяют как направленное движение организмов, основанное на восприятии пространственного градиента внешнего стимула. Примерами таких поведенческих реакций может служить фототаксис одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii и хемотаксис миксамеб Dictyostelium discoideum. Третий тип двигательной реакции, называемый реакцией шока, характеризует временное нарушение линейного поступательного движения клетки в ответ на изменение интенсивности стимула во времени. В настоящее время наиболее детально реакция фотошока изучена у С. reinhardtii.

Таким образом, аккумуляция или рассеивание одноклеточных организмов в пространстве может быть результатом одной или всего комплекса указанных поведенческих реакций, специфически проявляющихся у разных видов из различных систематических групп. Для клеток эукариотических водорослей описаны поведенческие реакции в ответ на световые сигналы, химические соединения, магнитное поле и гравитационное поле.

1.1.2. Светозависимые поведенческие реакции

Светозависимые поведенческие реакции широко распространены среди подвижных водорослей, что, очевидно, связано с адаптивным значением этих реакций, необходимых для выбора клетками оптимальных условий освещения. В системе фотоповеденческих ответов можно выделить три основных элемента: 1) фоторецепторную систему; 2) систему преобразования поступающего светового сигнала; 3) эффектор, вызывающий двигательный ответ клетки относительно светового стимула.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что фоторецеп-торные системы подвижных водорослей отличаются большим разнообразием (Foster, Smyth, 1980; Kivic, Walne, 1983; Посудин, Масюк, 1996; Hel-lingwert et al., 1996). Как правило, фоторецепторная система состоит из собственно фоторецептора и модулирующей свет стигмы (рис. 1). Стигмы у различных водорослей образованы группами сферических осмиофильных гранул, содержащих каротиноидные пигменты; количество гранул может варьировать от нескольких десятков до нескольких сотен. Стигма может находиться за пределами хлоропласта, непосредственно в цитоплазме.

Рис. 1. Строение стигмы у различных групп водорослей (по Kawai, Kreimer,

2000) A-Chlorophyta; B-Cryptophyta; C-Euglenophyta; D-Phaeophyta; E-Eustigmatophyta; F- Dinophyta (i - Woloszynskia coronata, ii - тип стигмы симбионтов Chromophyta; iii - тип стигмы с перидинин-содержащими группами; iv - Warnowia; v - Gimnodinium natalense)

Такое расположение стигмы описано у эвгленофитовых водорослей (Euglenophyta) (Feinleib, 1980; Lend, Ghetti, 1989; Barsanti et al., 1997) и подвижных репродуктивных клеток эустигматофицеевых водорослей (Eustigma-tophyceae), причем у последних стигма не окружена мембранами (Couillard, 1984). У большинства других представителей стигма является частью хлоропласта (Chlorophyta, Dinophyta, Cryptophyta, Xantophyceae, Phaeophyta) (Foster, Smyth, 1980). Однако у разных представителей она может быть одно- и многослойной, а, кроме того, и те, и другие типы стигмы могут иметь разное взаиморасположение тилакоидов со слоями пигментированных глобул, или же тилакоиды в области стигмы могут отсутствовать (Melkonian, Robenek, 1984).

Фоторецепторные структуры изучены мало, и во многих случаях точное местоположение фоторецептора неизвестно. Есть данные, что фоторецептор может быть расположен на жгутике (Euglenophyta, Chrysophyceae, Xantophyceae, Phaeophyta), на плазмалемме вне связи со жгутиковым аппаратом (Chlorophycophyta) или на тилакоидах внутри клетки (Cryptophyta). Роль фоторецепторных пигментов, предположительно, могут выполнять как пигменты, участвующие в фотосинтезе, например, перидинин у Dinophyta (Foster, Smyth, 1980), фикобилины у Cryptophyta (Watanabe et al., 1976), хлоро-филлы у Desmidiales (Nultsch, 1975), так и специфические пигменты, не входящие в состав фотосинтетических комплексов, например, флавины и их производные у Xantophyceae, Chrysophyceae (Kawai, Inouye, 1989; Gualti-eri et al., 1986). Однако следует отметить, что многие выводы сделаны авторами на основе изучения спектров действия фотоповеденческих ответов и их сопоставлении со спектрами поглощения различных веществ и, следовательно, их нельзя считать окончательными, и эти вопросы, несомненно, нуждаются в дальнейших специальных исследованиях. Фоторецепторы и фоторецепторные пигменты наиболее детально охарактеризованы только у представителей подвижных водорослей из родов Chlamydomonas (Chlorophycophyta) и Euglena (Euglenophyta).

Рецепция светового сигнала у Chlamydomonas осуществляется родоп- синами археального типа. Молекулы фоторецептора расположены в стигме и ориентированы параллельно ее мембране (Witman, 1993). Только два из семи известных в настоящее время родопсинов принимают участие в фототактической ориентации клеток Chlamydomonas, - родопсин-1 (ChR1, от англ. channelrhodopsin) и родопсин-2 (ChR2; Nagel et al., 2003, Sineshchekov et al., 2002). При возбуждении родопсинов видимым светом хромофор, представленный полностью транс-ретиналем, изомеризуется в 12-цис форму (рис. 2).

Животные

Археи и Chlamydomonas

^6^*^8хЧо0/ЧО2/Цл4^СНО '\'\-цис-ретинапь

ПОЛНОСТЬЮ транс-ретиналь

сно полностью транс-ретиналь

13-цис-ретиналь

Рис. 2. Хромофоры зрительных пигментов

Это конформационное изменение служит исходным молекулярным механизмом, запускающим передачу светового сигнала в клетке. Интересно отметить, что хромофор архей, содержащийся в бактериородопсине, также представлен полностью транс-ретиналем, тогда как в зрительных рецепторах человеческого глаза и у различных животных - 11-цис-ретиналем. У животных ретиналь находится в G-s-цис конфигурации, а у бактерий и Chlamydomonas - в 6-s-mpaHc конфигурации. Таким образом, у животных геометрическая конфигурация хромофора и конформационные изменения, происходящие в ней под действием света, отличаются от конфигурации хромофоров Chlamydomonas и архей. Принимая во внимание, что полностью транс-форма является наиболее термодинамически стабильным изомером ретиналя, ее появление у прокариот и Chlamydomonas может быть результатом конвергентной эволюции.

Второй компонент зрительного пигмента Chlamydomonas, ретинальсвя-зывающий белок опсин, имеет некоторую гомологию в строении с опсинами беспозвоночных. Вместе с тем, все описанные ранее родопсины содержат в своем составе семь трансмембранных спиральных доменов и связаны с другими компонентами сенсорного пути (G-белки в зрительных пигментах животных и Htrl и Htrll в случае сенсорных родопсинов архей). У опсина Chlamydomonas отсутствует домен, ответственный за взаимодействие с G-белками, и нет какой-либо гомологии с опсинами галофильных архей (Halo-bacterium salinawm).

Родопсины функционируют как светозависимые протонные и катионные каналы, и принимают участие в генерации фототоков. Анализ спектров действия показал наличие максимумов поглощения при 500 нм для ChR1 и при 470 нм для ChR2. Электрофизиологические исследования хламиродопсина показали, что ChR2 генерирует медленный фоторецепторный ток при низкой интенсивности освещения, и поглощение одного кванта света приводит к переносу через клеточную мембрану, по крайней мере, сотни электронов, как это было показано ранее для Haematococcus pluvialis (Hegemann et al., 1988). ChR1 генерирует фоторецепторный ток гораздо быстрее (менее 50 мс после вспышки света) и при значительно большей интенсивности света. При постоянном освещении пропускная способность СІ^2-канала падает, и для ее повышения необходимо добавление в среду протонов. Экспрессия генов ChR2, главным образом, происходит в условиях низкого освещения, что предполагает участие ChR2-6enKOB в фоторецепции у клеток Chlamydomonas, адаптированных к темноте. Хотя, несомненно, необходимы до- полнительные исследования для доказательства функционирования активируемого светом ионного канала как единого целого, уже сейчас можно утверждать, что родопсины Chlamydomonas представляют собой новый тип сенсорного фоторецептора. Возможно, родопсины Chlamydomonas дивер-гировали от опсинов животных на ранних этапах эволюции зрительных пигментов.

У другого представителя зеленых водорослей, Volvox, показано наличие в области стигмы соматических клеток вольвоксопсина, который обладает довольно высоким родством с опсином Chlamydomonas (около 62%) и, несомненно, относится к тому же семейству белков (Braun, Hegemann, 1999).

Фоторецептор у Euglena представлен парабазальным телом (ПБТ), которое находится в основании активного жгутика в виде небольшого утолщения диаметром 1 мкм (Foster, Smyth, 1980). ПБТ, расположенное непосредственно под мембраной, окружающей аксонему, имеет кристаллическую структуру и связано с ней через специальный паражгутиковый стержень (Kivic, Vesk, 1972; Wolken, 1977). Однако, если локализация фоторецептора в клетке сейчас не вызывает сомнений, то вопрос о природе фоторецеп-торного пигмента до сих пор остается дискуссионным. Ряд авторов определяют пигмент как флавин и птерин (Schmidt et al., 1990; Brodhum, Hader, 1990), в других работах приведены доказательства, свидетельствующие о его родопсиновой природе (Gualtieri et al., 1992; Barsanti et al., 1993; 1997).

Во всех случаях обязательным элементом поступательного движения жгутиковых водорослей является их вращение вокруг собственной продольной оси (Foster, Smyth, 1980). При этом клетка с помощью единственного фоторецептора способна сравнивать интенсивность света в различные моменты времени, так как вращательное движение приводит к амплитудной модуляции света, попадающего на фоторецептор, величина которой зависит от направления движения клетки по отношению к направлению распространения света. Стигма может выполнять функции только модулятора, не отражая света (Euglenophyceae) или дополнительно фокусировать отраженный свет на фоторецептор (Chrysophyceae, Phaeophyceae, некоторые виды Dinophyceae, репродуктивные клетки Eustigmatophyceae) (Kreimer, 1994).

Считается, что модуляционный механизм фоторецепции присущ всем подвижным эукариотическим водорослям (Foster, Smyth, 1980; Посудин, Масюк, 1996). Кроме общего модуляционного механизма у разных представителей описаны дополнительные механизмы, усиливающие модуляционный эффект. Так, способ ориентации может быть основан на свойстве оптической анизотропии самого фоторецептора за счет параллельного расположения плоскостей хромофоров фоторецепторных молекул. В этом случае максимальное поглощение света будет происходить при движении клетки параллельно направлению распространения света (Creutz, Diehn, 1976). Действие такого механизма описано у Euglena gracilis (Hader et al., 1986). Ранее для объяснения фоторецепции у зеленых водорослей был предложен также интерференционный механизм, основанный на взаимодействии света с многослойной четвертьволновой пластиной, образованной несколькими чередующимися пигментированными и непигментированными слоями стигмы, расположенными, предположительно, под фоторецептором (Foster, Smyth, 1980). Однако в литературе не описаны стигмы, которые бы состояли из сплошных пигментированных слоев. Так, стигма зеленых водорослей состоит из отдельных сферических глобул или из плотно упакованных глобул, принимающих гексагональную форму. Такое строение представляет собой, по сути, разновидность дифракционной решетки, а не четвертьволновые пластины. В связи с этим, для представителей Chlorophyta был предложен дифракционный механизм фоторецепции, который основан на взаимодействии света с периодической глобулярной структурой стигм (Посудин, Масюк, 1996). Согласно предложенному механизму, дифракция света на периодической структуре стигмы сопровождается взаимодействием световых волн, отраженных от различных глобул, с образованием дифракционных максимумов, совпадение которых с местонахождением фоторецептора приводит к усилению светового сигнала.

У подвижных водорослей, не обладающих жгутиковым аппаратом (Desmidiales, Bacillanophyta, Rhodophyta), наблюдается фотоориентация с помощью двух фоторецепторов на разных концах клетки путем сравнения их освещенности в один и тот же момент времени (Hader, 1981; Kivic, Walne, 1983).

Таким образом, фоторецепторные системы в различных таксонах эука-риотических водорослей достаточно разнообразны и, по-видимому, являются результатом множественных параллельных эволюции (Kivic, Walne, 1983).

В последовательности событий, приводящих к фотоповеденческой реакции, световой сигнал от фоторецептора передается далее к жгутикам и воздействует на характер их работы. Среди эукариотических водорослей возможный механизм преобразования светового стимула описан только на примере фотоповедения С. reinhardtii и родственных видов (Harz, Hege-mann, 1991; Sineshchekov et ai., 1992). Авторами установлен сложный каскад фотоиндуцированных трансмембранных токов, осуществляющих передачу светового сигнала. Основной составляющей системы является двух-компонентный фоторецепторный ток, который приводит к деполяризации плазмалеммы и более позднему изменению тока ионов Са²⁺ в жгутиках (Sineshchekov et al., 1990; Pazour et al„ 1995).

Изменение концентрации Ca²⁺ в жгутиках приводит к изменению характера их движения. У некоторых зеленых водорослей изменение характера движения связано с Са²⁺-зависимой переориентацией базальных тел жгутикового аппарата (Schulze et al., 1986). Описанная авторами переориентация вызвана сокращением дистальных фибрилл, соединяющих базальные тела в жгутиковом аппарате (McFadden et al., 1987). За процесс сокращения дистальных фибрилл ответствен Са²⁺-связывающий белок центрин (Wiech et al., 1996). У Chlamydomonas описан уникальный механизм фототактического поворота, определяемый функциональным различием двух жгутиков (Kamiya, Witman, 1984).

Оказалось, что цис-жгутик (расположен ближе к стигме) и транс-жгутик по-разному отвечают на изменение концентрации ионов Са²⁺ (рис. 3). Так, свет средней интенсивности приводит у Chlamydomonas к увеличению концентрации кальция в жгутиках до 10"⁷ - 10"⁶ М, инактивируя таким образом более чувствительный к Са²⁺ цис-жгутик на 1-2 цикла биения, что вызывает поворот клетки, приводящий к продолжению движения в направлении источника света (положительный фототаксис).

^10* м с ІЙ вспышка света

1СГ М Са фототаксис хемотаксис реакция фотошока

Рис. 3. Двигательные ответы Chlamydomonas, определяющие направленное движение клетки относительно фото- и хемосигналов (по Ермилова, 2000)

При более высоких интенсивностях света происходит уменьшение концентрации кальция в жгутиках относительно его концентрации в нести-мулированных клетках, что вызывает временную инактивацию трансжгутика и, как следствие этого, активный поворот клетки, приводящий затем к ее движению от источника света (отрицательный фототаксис). Мутанты, которые утратили способность цис- и транс-аксонем изменять характер своего движения при изменении концентрации Са²*, сохранили нормальную реакцию фотошока, но не демонстрировали реакции фототаксиса. Эти штаммы, по-видимому, имеют повреждения в генах, кодирующих белки ак-сонем, чувствительные к субмикромолярным концентрациям кальция. Считается, что они могут быть компонентами Са²⁺-регулируемого комплекса, расположенного, предположительно, в высокоспециализированном регионе жгутиков, формирующем границу между флагеллоплазмои и цитоплазмой и плазматической мембраной и жгутиковой мембраной.

Резюмируя сказанное, можно заключить, что, несмотря на многочисленные литературные данные по вопросу фотоповедения эукариотических водорослей, сведения о механизмах рецепции, преобразования и передачи световых сигналов являются неполными и достаточно фрагментарными, а в ряде случаев касаются лишь немногих видов зеленых водорослей и нуждаются в дальнейшем дополнении.

1.1.3. Хемотаксис

Хемосенсорное поведение подвижных клеток эукариотических водорослей в литературе, как правило, называют хемотаксисом, не учитывая при этом механизм двигательной реакции, вызвавшей активную ориентацию организма относительно химического стимула. Из-за отсутствия данных о возможных механизмах хемоповеденческих реакций, мы в дальнейшем для удобства также будем использовать термин хемотаксис.

Впервые хемотаксис у эукариотических организмов был описан у некоторых криптогамных растений и низших грибов, мужские гаметы которых привлекались женскими гаметами в процессе полового размножения (Mach-lis, 1973; Jaenicke, 1991). Однако следует отметить, что только в нескольких случаях феноменологическое описание поведения клеток в популяции было подтверждено выделением и анализом химической структуры предполагаемого феромона. К таким организмам относятся, прежде всего, представители бластокладиевых грибов из рода Allomyces (Machlis et al., 1968). Феромон, названный сиренином, представляет собой терпеноид, бицикличе-ский сесквитерпен (Plattner, Rapoport, 1971). Впоследствии хемотаксис у гамет при половом размножении был выявлен у бурых водорослей.

Интерес к хемосенсорному поведению у бурых водорослей (Phaeophy-сеае) вызван, очевидно, его связью с процессом полового размножения. Женские гаметы многих видов выделяют аттрактанты (феромоны), которые привлекают мужские гаметы (Maier, Miiller, 1986). Эффективность процесса полового размножения в значительной степени определяется поведением подвижных клеток, сперматозоидов. Все известные в настоящее время феромоны бурых водорослей представляют собой ненасыщенные Сц- или С₈-углеводороды и могут быть подразделены на четыре основных группы: циклопропаны, циклопептены, циклогептадиены и олефины (Maier, 1993). В некоторых боковых цепях были найдены модификации. Характерной чертой феромонов является то, что они не являются строго специфичными в пределах рода, но специфичны для более крупных таксонов, таких как семейства и порядки. В связи с этим, у, более чем, пятидесяти видов из 12 порядков бурых водорослей в качестве аттрактантов мужских гамет было идентифицировано всего одиннадцать соединений (Muller et al., 1971; Miiller, 1989). Представители порядков Laminariales, Desmarestiales и Sporochnales синтезируют феромоны, которые не только привлекают сперматозоиды, но и стимулируют их выход из антеридиев (Maier, Muller, 1986).

Рядом авторов была предпринята попытка охарактеризовать хеморецепторы с помощью набора синтетических аналогов феромонов (Maier et al., 1988). Предполагается, что связывание феромонов с рецепторными белками может происходить за счет нековалентных взаимодействий. Кроме того, такой механизм связывания обладает энантиомерной специфичностью и поэтому строго зависит от стерических характеристик молекул, особенно пространственного расположения их двойных связей (Boland et al., 1984). Не исключено, что координационным центром связывания феромона служит катион металла в рецепторе. Вместе с тем, нет каких-либо данных относительно природы или клеточной локализации хеморецепторов бурых водорослей. Полностью отсутствуют также сведения о возможных механизмах преобразования хемосенсорных сигналов, поступающих к жгутиковому аппарату.

Для представителей родов Laminaria и Fucus были описаны двигательные ответы сперматозоидов в градиенте феромонов (Maier, Muller, 1990). Сперматозоиды Laminaria и Fucus имеют два жгутика различной длины, которые ориентированы в противоположных направлениях. Изменение движения клетки в градиенте феромона происходит в результате работы заднего, более длинного жгутика, в результате чего сперматозоид совершает характерные U-образные повороты. При увеличении концентрации феромона переориентация подавляется, и сперматозоид плывет прямо, то есть в направлении женской яйцеклетки. Регуляция направленного движения происходит путем контроля частоты актов смены направления движения. Однако этот процесс, в отличие от поведения бактерий (Macnab, 1979), не является случайным. В связи с этим, очевидно, авторы не использовали общепринятый термин клинокинез, а ввели новый термин клинотаксис (Maier, 1993). Интересно, что аналогичный по характеру двигательный ответ описан у сперматозоидов и спор грибов, обладающих асимметричными жгутиками (Miles, Holwill, 1969), и одножгутиковых половых клеток у некоторых гидроидных (Miller, 1985). Высказывается гипотеза, что такой тип ориентации, клинотаксис, может быть общим механизмом в хемосенсорном поведении мужских гамет при половом размножении различных систематических групп.

Наряду с бурыми водорослями, хемотаксис описан у ряда эндогоние-вых водорослей (Chlorophyta). Показано, что у гетероталличного вида Ое-dogonium cardiacum сперматозоиды привлекаются к оогинальной поре. Было установлено, что синтезируемый феромон имеет молекулярную массу около 500-1500 Да, хорошо растворим в воде, термочувствителен, а также растворяется в кислоте и щелочи (Machlis et al., 1974). Феромоны О. bori-sianum и О. donnellii растворимы в неполярных растворителях (Hill, 1980). Высказано предположение, что феромоны, являющиеся аттрактантами ан-дроспор, у этой группы зеленых водорослей контролируют также направленный рост нитей, на которых впоследствии формируются антеридии (Hill et al., 1989). Однако, на наш взгляд, эта гипотеза требует дополнительного подтверждения.

У одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas allensworthii был описан хемотаксис мужских гамет (Starr et al., 1995). Аттрактант, привлекающий мужские гаметы, синтезируют зрелые женские гаметы. Это соединение было названо люрленом, который представляет собой 0(4)-p-D-ксилозопластогидрохинон (Jaenicke, Marner, 1995; Jaenicke, Starr, 1996). Хемотактическую активность люрлена определяет его ксилозный остаток.

Хемосенсорное поведение эукариотических водорослей, не связанное с половым размножением, описано у зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii (Sjoblad, Frederikse, 1981, Ermilova et al., 2003) и Dunaliella tertio-lecta (Sjoblad et al., 1978). Показано, что подвижные клетки обоих видов привлекаются ионами аммония. Кроме того, Dunaliella salina демонстрирует хемотаксис к глицину, лизину и олигопептидам, содержащим эти аминокислоты (Koehdai et al., 1996).

Особо следует подчеркнуть, что до сих пор хемотаксис, основанный на активном изменении направления движения под воздействием хемоэффек-торов, был описан только у клеток, обладающих амебоидным типом движения (миксамебы, лейкоциты крови человека и животных). Для клеток и одноклеточных организмов, включая бактерии, простейших и гаметы ряда водорослей двигающихся с помощью жгутиков и ресничек, хемотаксис был охарактеризован как стратегия случайного поиска, в результате которой ориентация достигается за счет изменения частоты самопроизвольных актов смены направления движения (хемоклинокинез) или за счет изменения скорости движения в ответ на химический стимул (хемоортокинез). Однако активная переориентация в отношении градиента химических веществ может определять также направленную подвижность клеток, имеющих жгутики, и, таким образом, ориентацию по типу хемотаксиса, что, очевидно, нельзя рассматривать как тип поведенческой реакции, характерной только для клеток с амебоидным движением (Ermilova et al., 2000).

Таким образом, сведения о хемотаксисе водорослей весьма ограничены. Тем не менее, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что хемоат- трактантами могут быть различные классы соединений от гидрофобных углеводородов у бурых водорослей до аминокислот и производных пластохи-нона у зеленых водорослей. Не исключено, что степень разнообразия структуры аттрактантов в пределах рода может отражать специфичность хеморецепции у представителей разных таксонов. Однако этот вопрос, безусловно, требует дальнейшего изучения.

1.1.4. Аэротаксис

Аэротаксис — поведенческая реакция, которая позволяет клеткам двигаться в направлении оптимальной концентрации кислорода. У бактерий основным белком, отвечающим за аэротактический ответ клеток, является белок Аег (Bibikov et al., 2000). При этом в отличие от хемотаксиса, адаптация клеток к кислородным условиям происходит независимо от относительного уровня метилирования/деметилирования белков (Bibikov et al., 2004).

Несмотря на то, что кислород необходим для дыхания клеток водорослей, этот тип двигательного ответа в литературе практически не обсуждался. Более двадцати лет назад были опубликованы результаты, свидетельствующие о том, что рецептором в реакции аэротаксиса у Euglena gracilis служит цитохром а₃ (Miller, Diehn, 1978). Было высказано предположение, что аэротаксис у Euglena определяется системой транспорта электронов. Других литературных данных, которые позволили бы более подробно обсудить этот тип поведенческой реакции у водорослей, в литературе нет.

1.1.5. Магнитотаксис

У водорослей рода Anisonema (Euglenophyceae) описан уникальный тип двигательной реакции, магнитотаксис (Torres de Araujo et al., 1986). Как было установлено, клетки содержат частицы Fe₃0_4l которые образуют цепочки и создают, в результате, магнитный дипольный момент. Следует подчеркнуть, что магнитотаксис принципиально отличается от других обсуждаемых нами типов таксиса, так как не требует специальных механизмов для восприятия и передачи внешнего сигнала. В этом случае ориентация клеток происходит вдоль линий магнитного поля Земли за счет взаимодействия между магнитным диполем клетки и линиями магнитного поля Земли. Биологическое значение магнитотаксиса точно не установлено. Высказано предположение, что для гетеротрофных водорослей рода Anisonema движение вглубь толщи воды вдоль линий магнитного поля позволяет клеткам достигать оптимальных условий с более низким содержанием кислорода, меньшей интенсивностью света и менее высокой температурой, чем на поверхности воды.

Интересно отметить, что магнитотаксис выявлен у многих бактерий, в частности у некоторых микроаэрофилов и факультативных анаэробов из о> и р-субклассов Proteobacteria и Nitrospora (Mann et al., 1990; Bazylinski et al., 1990; 1991). У магнитобактерий частицы магнетита расположены во внутриклеточных мембранных везикулах и называются магнитосомами. Примечательно, что магнитотаксис у бактерий также представляет собой однонаправленную ориентацию клеток вдоль линий магнитною поля Земли и не включает ряда сложных механизмов регуляции, характерных для фото- и хемосенсорного поведения (Spring, Schleifer, 1995). Очевидно, что независимая эволюция магнитотаксиса у прокариот и эукариот привела к формированию сходных механизмов двигательной ориентации.

1.1.6. Гравитаксис

Подвижные клетки эукариотических организмов, в отличие от бактерий, обладают еще одним механизмом, позволяющим им различать верх и низ — гравитаксисом. Способность к гравитаксису, ориентированному движению относительно гравитационного поля Земли, выявлена у некоторых простейших (Fenchnel, Finlay, 1986; Taneda, 1987; Taneda et al., 1987), жгутиковых водорослей (Creutz, Diehn, 1976; Rhiel et al., 1988; Kessler et al., 1992), миксомицета Physarium polycephalum (Block et al., 1986; Wolke et al., 1987).

Среди представителей эукариотических водорослей проблема ориен- тации клеток в гравитационном поле обсуждалась в основном на примере Euglena, которая демонстрирует отрицательный гравитаксис, проявляющийся в направленном движении клеток вверх в отсутствие светового стимула (Hader, 1987). Высказана гипотеза, согласно которой гравитаксис подвижных клеток Euglena является результатом активного восприятия сигнала, а не пассивной ориентацией в результате асимметричного положения центра гравитации в клетке (Hader, Liu, 1990). Установлено, что гравитаксис нарушается при увеличении плотности окружающей среды, действием ингибиторов механочувствительных ионных каналов и агентами, снижающими величину мембранного потенциала (Lebert, Hader, 1996). Предложена модель, согласно которой результирующее давление цитоплазмы по-разному деформирует различные области плазматической мембраны в зависимости от положения клетки, что вызывает активацию механочувствительных ионных каналов. Вызванный активацией ионных каналов ток ионов изменяет потенциал плазматической мембраны и является первичным событием в восприятии сигнала. Причем высказано предположение, что механочувст-вительные ионные каналы, включенные в механизм гравитаксиса Euglena, распределены преимущественно на полюсах клетки. Предполагается, что такой механизм гравитаксиса может быть общим для подвижных одноклеточных организмов (Lebert, Hader, 1996; 1997).

Наличие отрицательного гравитаксиса показано также и у Chlamydomonas (Bean, 1977). Было установлено, что мутанты Chlamydomonas, не имеющие реакции фототаксиса, демонстрировали нормальный гравитаксис (Kam et al., 1999). Таким образом, можно сделать вывод, что механизмы контроля гравитаксиса отличаются от механизмов фототактического поведения, т. е. переключение работы жгутиков Са²⁺-независимо. Предложены два возможных механизма, определяющих гравитаксис Chlamydomonas: 1) клетки могут определять результирующее давление, оказываемое цитоплазмой на клеточную мембрану; 2) во время пассивного движения клеток происходит изгибание основания жгутиков, что может приводить к генерации мембранного потенциала (Yoshimura et al., 2003). В подтверждение по- следней гипотезы говорит наличие и в клетке, и в жгутиках механочувстви-тельных каналов (Yoshimura et al., 1996; Yoshimura et al., 1998). Изменение мембранного потенциала может приводить к изменениям в уровнях внутриклеточного цАМФ и фосфорилирования белков, именно тех факторов, которые непосредственно определяют работу жгутиков (Hasegawa et al., 1987; King, Dutcher, 1997). Однако для окончательного подтверждения этой точки зрения необходимы дополнительные эксперименты, в частности, с мутант-ными штаммами, в которых повреждены отдельные компоненты пути.

1.2. Транспорт аммония у эукариот

Аммоний представляет самой один из наиболее предпочтительных источников азота для различных эукариотических организмов. Причем важным этапом в контроле метаболизма аммония является регуляция процесса переноса через плазматическую мембрану. В связи с этим транспортные системы аммония в настоящее время активно изучаются у различных представителей.

1.2.1. Системы транспорта аммония у высших растений

Общей характеристикой процесса поглощения аммония у высших растений является наличие двух типов транспортных систем аммония: систем с высоким сродством (HATS, от англ. high affinity transport system) и систем с низким сродством (LATS, от англ. low affinity transport system); последние начинают активно функционировать при концентрации аммония в среде выше 1 мМ (Rawat et al., 1999). Кинетические параметры HATS-систем описываются классическим уравнением Михаэлиса-Ментена, тогда как LATS-система характеризуется линейной (без фазы насыщения) зависимостью, что указывает на работу данной системы по типу систем пассивного транспорта (катионные каналы; Rawat et al., 1999).

Подавляющее большинство экспериментов по физико-химическому анализу процесса транспорта аммония доказывает, что LATS-система транспортирует в клетки протонированную форму NH₄⁺, причем с затратой энергии (Forde and Clarkson, 1999). Депротонированная форма аммония NH₃ пассивно диффундирует через плазматическую мембрану в среду, где далее может быть протонирована и перенесена снова в клетку (Forde and Clarkson, 1999). Данное явление производило обманчивое впечатление пассивного переноса NH₄⁺ через мембрану. Тем не менее, точный механизм транспорта ионов аммония через плазматическую мембрану до конца не изучен. Высказывались предположения, что перенос ионов аммония может сопровождаться одновременным переносом протонов, генерируя, таким образом, протонный градиент, который, как было косвенно показано ранее, важен для работы HATS-системы в корнях риса (Wang et al., 1993b). Однако до сих пор нет никаких прямых доказательств работы H⁺/NH₄⁺ симпорта в корнях растений.

Функционирование HATS-системы зависит от азотного питания растения. Например, при переносе Arabidopsis из среды с высоким содержанием аммония и нитрата в среду с низким их содержанием происходило 12-кратное увеличение активности работы HATS (Rawat et al., 1999). При этом активность LATS-системы не изменялась.

Первым клонированным геном транспортера аммония высших растений был ген AtAmt1;1 из Arabidopsis thaliana (Ninnemann et al., 1994). Чуть позже, путем сравнения гомологичных последовательностей кДНК были охарактеризованы еще два гена (AtAmt1;2 и AtAmt1;3), которые, как и AtAmt1;1, обладают гомологией с генами, кодирующими транспортеры аммония дрожжей (Gazzarrini et al., 1999). К настоящему времени семейство АМТ1 у Arabidopsis включает 5 генов, которые кодируют гидрофобные белки, состоящие из 475-514 аминокислотных остатков, и принадлежащие к АМТ/МЕР-семейству генов, которые найдены у бактерий, архей, грибов, высших растений и животных (Saier et al., 1999). Все транспортеры данного семейства, помимо аммония, могут переносить и его неметаболизируемый аналог - метиламмоний. Экспрессия генов происходит, в основном, в корнях, хотя AtAmt1;1 имеет также высокий уровень экспрессии в побеге (Nin- nemann et al., 1994; Gazzarrini et al., 1999), и репрессируется высокой концентрацией ионов аммония (Gazzarrini et al., 1999; Rawat et al., 1999).

Кроме арабидопсиса, выделены и охарактеризованы гены АМТ1 семейства у таких растений как Lycopersicon esculentum (LeAMT), Lotus japonicus (LjAMT) и Brassica napus (BnAMT). Филогенетический анализ последовательностей выделенных генов показал, в частности, что LeAmt1;1 и LjAmt1;1 составляют подсемейство АМТ1;1, тогда как LeAmt1;2 наиболее близок гену AtAmt1;2. Также выявлена высокая гомология между генами AtAmt1;3 и AtAmt1;5, что, вместе с фактом наличия смежного участка хромосомы между этими генами, указывает на относительно недавнюю генную дупликацию (Crawford, Forde, 2002).

Компьютерное прогнозирование топологии АМТ/МЕР-транспортеров предсказывает наличие у них 11 трансмембранных доменов, в то время как транспортер аммония у Е. coli - белок AmtB - имеет 12 трансмембранных доменов (Thomas et al., 2000). Регуляция транспортеров аммония сложна и, по-видимому, осуществляется на различных уровнях (Crawford, Forde, 2002). В частности, предполагается возможность посттранскрипционной регуляции HATS (Rawat et al., 1999) путем непосредственного ингибирования активности транспортеров или путем ингибирования синтеза и/или посттрансляционного созревания АМТ-белков.

У высших растений показано также наличие второго семейства транспортеров, АМТ2. АМТ2-транспортеры, в отличие от АМТ1-белков, не способны переносить метиламмоний (Simon-Rosin et al., 2003; Sohlenkamp et al., 2000). Филогенетический анализ последовательностей Amt2-reHOB показал, что семейство транспортеров АМТ2 высших растений близко к семейству транспортеров МЕР дрожжей (Simon-Rosin et al., 2003; Sohlenkamp et al., 2000). Экспрессия генов Amt2 выявлена во всех органах растений, но наиболее высокий уровень экспрессии наблюдается в листьях и корнях (Sohlenkamp et al., 2002). Предполагается, что одной из основных функций АМТ2-белков является повторный транспорт в клетки «лишнего» аммония, который образуется в процессе фотодыхания либо же при азотфиксации бактероидами (в случае с симбиотическими ассоциациями) и выводится из клеток (Simon-Rosin et al., 2003). Хотя следует подчеркнуть, что, в отличие от микроорганизмов, многие высшие растения гораздо лучше растут на средах, содержащих нитрат и аммоний, чем на средах, содержащих аммоний в качестве единственного источника азота (Wilkinson, Crawford, 1993). Возможно, данное явление отражает адаптацию растений к росту в аэробных почвах, где азот представлен преимущественно в форме N0₃", тогда как концентрация ионов NH/ редко превышает 50 мкМ (Marchner, 1995).

1.2.2. Системы транспорта аммония у грибов

Наряду с глутамином и аспарагином, аммоний является для грибов наиболее предпочтительным источником азота (Marini et al., 1997). Транспорт аммония осуществляется специальными МЕР-транспортерами. Белки МЕР1 и МЕР2 являются транспортерами с высоким сродством к аммонию (К_т 1-10мкМ), тогда как МЕРЗ относится к LATS-системе (К_т 1,4-2,1 мМ); тем не менее, аминокислотные последовательности МЕР1 и МЕРЗ обладают 79%-ной гомологией (Marini et al., 1997). Штаммы, утратившие все три Мер-гена, не способны расти на средах с содержанием аммония (в качестве единственного источника азота) менее чем 5 мМ. С другой стороны, при высоких концентрациях аммония (>20 мМ) отсутствие МЕР-транспортеров не критично для роста клеток.

Помимо собственно транспортной функции, белок МЕР2 также принимает участие в контроле дифференцировки псевдогиф у Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans в условиях азотного голодания (Lorenz, Heit-man, 1998; Biswas, Morschhauser, 2005). Таким образом, МЕР2-пермеаза является сенсором внеклеточного аммония, регулируя переход клеток к филаментозному росту путем активации GPA2 - а-субъединицы одного из G-белков, который совместно с белком RAS2 координирует рост клеток дрожжей (рис. 4; Lorenz, Heitman, 1998). Однако никаких свидетельств прямого взаимодействия между МЕР2 и GPA2 не обнаружено. Можно предпо- ложить, что МЕР2 вовлечен в синтез некоего соединения (возможно продукта азотного метаболизма), который, в свою очередь, активирует GPA2. другие МЕР1/3 / \ МЕР2 пермеазы

GPA2

МАЛА амл/\_-^алллд аденилатциклаза протеинкиназа А

Рис. 4. Модель регуляции дифференцировки псевдогиф белком МЕР2 (по Lorenz, Heitman, 1998)

Схожий тип регуляции с участием G-белков показан также на примере перехода клеток S. pombe и С. neoformans к половому размножению в условиях азотного голодания (Isshiki et al., 1992; Alspaugh et al., 1997). Тем не менее, непосредственно механизм активации G-белков остается не выясненным.

1.2.3. Системы транспорта аммония у Dictyostelium discoideum

Цикл развития миксамебы D. discoideum включает в себя такие необычные этапы, как формирование многоклеточных структур путем агрегации отдельных клеток и формирование плодового тела, состоящего из го- ловки со спорами и «стебелька». Аммоний является одной из самых важных сигнальных" молекул, регулирующих различные клеточных процессы на протяжении всего цикла развития (Follstaedt et al., 2003). На ранних стадиях агрегации в зависимости от концентрации аммония в среде изменяется характер передвижения индивидуальных клеток за счет ингибирования синтеза цАМФ (Bonner et al., 1986, 1989). Изменения в активности цАМФ-зависимой протеинкиназы также лежат в основе формирования многоклеточного организма на завершающих стадиях развития (Singelton et al., 1998).

У D. discoideum показано наличие трех транспортеров аммония - AmtA, AmtB и AmtC. Все АМТ-гены экспрессируются на относительно постоянном уровне, однако обладают пространственной и временной регуляцией (Follstaedt et al., 2003). В частности, на стадии образования агрегатов ген amtA имеет наибольший уровень экспрессии в тех клетках, которые в дальнейшем образуют «стебелек», тогда как гены amtB и amtC - в клетках, которые в дальнейшем образуют споры (Follstaedt et al., 2003). Поскольку «престе-бельковые» клетки, как показано, экспортируют аммоний, обеспечивая им «преспоровые» клетки (Cotter et al., 1992), то, можно предположить, что AmtA отвечает за экспорт аммония из клеток, a AmtB и AmtC - за его импорт. Кроме того, AmtC, аналогично МЕР2, является сенсором аммония и участвует в пути передачи сигнала, который определяет переход в стадию многоклеточного организма (Follstaedt et al., 2003).

Вполне вероятно, что транспортеры аммония у D. discoideum принимают участие в регуляции гораздо большего числа клеточных процессов. Все это является предметом дальнейших исследований.

1.2.4. Системы транспорта аммония у Chlamydomonas reinhardtii

У Chlamydomonas reinhardtii перенос аммония, также как и у высших растений, осуществляется двумя транспортными системами (HATS и LATS).

Однако молекулярно-генетический анализ последовательностей генома С. reinhardtii выявил наличие сразу 8 генов АМН-семейства (СгАМТЇ), кодирующих белки-транспортеры аммония (Gonzalez-Ballester et al., 2004). Филогенетический анализ генов показал, что семейство СгАМТЇ имеет промежуточное эволюционное положение между АМН-белками высших растений и дрожжей с одной стороны, и бактериями с другой стороны (рис. 5).

Тем не менее, СгАМТ1;1-1;6 близки семейству АМН высших растений (от 33 до 45% сходства), тогда как филогенетическое родство СгАМТ1;7 и СгАМТ1;8 к семейству АМТ1 высших растений не столь очевидно (только 21-29%). СгАМТЇ ;2 и СгАМТ1;8 с высокой вероятностью (>90%) имеют хло-ропластный сигнальный и транзитный пептиды, соответственно. Для двух генов - CrAmt1;5 и CrAmt1;7 - обнаружена возможность альтернативного сплайсинга.

АМТ1 Chlamydomona&l подклассы I и II :рМТ1 высших растений

Рис. 5. Филогенетичесое древо АМТ1 белков (по Gonzeiles-Ballester etal.,2004)

Длинный и короткий варианты СгАМТ1;7 обладают митохондриальным сигнальным и транзитным пептидом, соответственно. СгАМТ1;3 и СгАМТ1;4, по-видимому, не имеют сигнальной последовательности, тогда как, СгАМТ1;1 и СгАМТ1;5, скорее всего, локализованы в плазматической мембране. Особенностью СгАМТ1;8, которой нет у других транспортеров аммония, является наличие аланин-богатого участка (размером около 50 аминокислот), который располагается между трансмембранными доменами 6 и 7. Два остатка гистидина и один аргинина, консервативные в большинстве АМН -белков высших растений, также присутствуют в СгАМН, тогда как высоко консервативный аспартатный участок (Howitt, Udvardi, 2000) заменен в СгАМН ;7 и СгАМН ;8 на аспарагиновый.

Пять из восьми генов, CrAmt1;1, CrAmt1;2, CrAmt1;4, CrAmt1;5 и CrAmt1;8, предпочтительно экспрессируются в среде с нитратом и/или в безазотной среде. Интересно, что только CrAmt1;6 и CrAmt1;7 имеют высокий уровень экспрессии в среде с аммонием, тогда как остальные гены имеют либо очень низкий, либо не определяемый уровень экспрессии в этой среде. CrAmt1;1 - единственный ген, который экспрессируется преимущественно в условиях голодания (свыше 99% общей экспрессии), и чья экспрессия усиливается со временем (Gonzalez-Ballester et al., 2004).

Наличие у Chlamydomonas такого широкого набора HATS-систем для аммония и других источников азота, в частности нитрата, вероятно, отражает стратегию одноклеточного организма, направленную на обеспечение источниками азота в меняющихся условиях среды за счет различных, дополняющих друг друга систем с разными активностями и сродством к субстратам. В любом случае, аммоний требует регулированного вхождения в клетку, так как он может быть ассимилирован в цитоплазме или хлоропласте, аккумулирован в вакуолях или экспортирован обратно в среду. Кроме того, аммоний, образующийся в процессе фотодыхания, должен быть выведен из митохондрий (Glass, 2003; Howitt, Udvardi, 2000). Хотя считается, что большая часть аммония переносится в клетку за счет LATS и/или пассивно по градиенту концентрации (в форме NH₃) (Forde, Clarkson, 1999; von Wiren et al., 2000, а), в других случаях, таких как, импорт в хлоропласт, необходим активный транспорт (von Wiren et al., 2000a; Howitt, Udvardi, 2000). С другой стороны, у Chlamydomonas не найдено ни одного гена АМТ2-семейства, что позволяет предположить, что функцию АМТ2-транспортеров выполняют белки из семейства АМТ1.

Ряд данных свидетельствует о том, что насыщение клеток азотом ингибирует поглощение аммония и экспрессию генов Amt (Rawat et al., 1999; Gazzarrini et al., 1999; von Wiren et al., 2000b; Glass, 2003). Если предположить, что белки семейства АМТ1 принадлежат HATS-системе, то стандартная концентрация аммония (7,5 мМ), обычно используемая в лабораторных средах, очень высока, и, вполне вероятно, наблюдается эффект отрицательной обратной связи. В естественных условиях обитания содержание аммония не превышает 50 мкМ (Marschner, 1995), в сельскохозяйственных почвах - 0,8 мМ (Glass, 2003). Белки HATS высших растений имеют значения К_т для аммония от 0,5 до 170 мкМ, а у Chlamydomonas - от 7 до 30 мкМ (Franco et al., 1988). Поэтому в таких условиях аммоний, по-видимому, переносится в клетки белками LATS или белками семейства АМТ1 с низким сродством, как МЕРЗ-транспортеры дрожжей, которые имеют К_т >164 мМ (Marini et al., 1997). Необходимо подчеркнуть, что только CrAmt1;6 и CrAmt1;7 гены имеют высокий уровень экспрессии в среде с 7,5 мМ аммония (Gonzalez-Ballester et al., 2004). Это может быть связано с тем, что обе системы: 1) могут отвечать за поглощение аммония при его высокой концентрации в среде; 2) могут участвовать в переносе аммония в вакуоли, хотя и предполагается, что этот процесс происходит путем пассивной диффузии NH₃ (Britto et al., 2001b); 3) могут быть вовлечены в экспорт аммония из клеток. Клетки Chlamydomonas, как и высшие растения, вынуждены выводить излишки аммония из цитоплазмы и хлоропласта, а также из митохондрий при активном фотодыхании (Cordoba et al., 1987; Wallsgrove et al., 1987; von Wiren et al., 2000a; Britto et al., 2001a, b; Glass, 2003). Хотя некоторые авторы считают, что выход аммония из клеток осуществляется путем пассивной диффузии NH₃ (Forde, Clarkson, 1999; Howitt, Udvardi, 2000; Crawford, Forde, 2002) и участие АМТ-белков не установлено, можно предположить, что существуют мембранные транспортеры, выполняющие эту функцию. Дело в том, что предполагаемое соотношение NH3/NH/ в цитозо-ле и хлоропласте слишком мало и недостаточно, чтобы клетки эффективно освобождались от вредного уровня аммония (Britto et al., 2001а, b; Glass, 2003). В литературе описано несколько примеров наличия системы активного экспорта аммония из клеток у высших растений с низкой устойчивость к аммонию, таких как ячмень (Britto et al., 2001а, b; Glass, 2003). Можно предположить, что CrAMTI ;6 и/или СгАМТ1 ;7 также могут функционировать как системы экспорта аммония.

Другой причиной, объясняющей наличие большого числа АМТ-белков у Chlamydomonas по сравнению с высшими растениями, может быть необходимость для одноклеточного организма заново поглощать выведенный аммоний. В отличие от высших растений, у которых межклеточные взаимодействия и система апопласта обеспечивают процессы разбавления/концентрирования избыточного или недостающего аммония, Chlamydomonas нуждается в очень эффективных механизмах вывода аммония при высоких и токсических концентрациях, а также возможного повторного поглощения NH₃ даже при очень низкой внеклеточной концентрации аммония (Wang et al., 1993). Эти процессы могли бы осуществлять АМН-транспортеры, локализованные в плазматической мембране, которые, однако, регулируются иначе, нежели транспортеры, ответственные за поглощение аммония. В этой связи, регуляция CrAmt1;4, CrAmt1;5 и CrAmt1;8, видимо, соответствует повторному поглощению ранее выведенного аммония, поскольку они репрессируются аммонием, но индуцируются нитратом и в безазотной среде (Gonzalez-Ballester et al., 2004). В любом случае, для понимания функционального значения каждого СгАМН необходимо выявление их точной субклеточной локализации и кинетических характеристик.

1.3. Ассимиляция аммония у Chlamydomonas reinhardtii

Основным путем ассимиляции аммония у Chlamydomonas, как и у высших растений, является GS/GOGAT цикл (Cullimore, Sims, 1981а, b, с). Глу-таминсинтетаза (GS) катализирует АТФ-зависимую реакцию образования глутамина из аммония и глутамата. Существует две формы этого фермента: одна (GS1) расположена в цитоплазме, другая (GS2) - в хлоропласте (Florencio, Vega, 1983; Chen, Silflow, 1996). Активность GS регулируется различными факторами окружающей среды, в частности, уровнем освещенности и содержанием углерода и азота в среде. Глутаминсинтетаза обратимо инактивируется в темноте или при обработке клеток высокой концентрацией аммония (Cullimore, Sims, 1981b) и реактивируется на свету или in vitro в присутствии тиоредоксинов - белков, участвующих в организации тиольных групп фермента (Florencio et al., 1993). Анализ уровней экспрессии и активностей двух форм GS показал, что концентрация GS1 возрастает при росте клеток на среде с нитратом в качестве единственного источника азота и уменьшается при росте на среде с аммонием, в то время как GS2 экспрессируется конститутивно в обоих случаях (Chen, Silflow, 1996).

Глутаматсинтаза (GOGAT) катализирует реакцию переноса амидной группы с глутамина на 2-оксоглутарат с затратой восстановительных эквивалентов. Образовавшиеся две молекулы глутамата являются субстратом для GS (Lea, Miflin, 1975). У С. reinhardtii идентифицировано две изоформы фермента, для первой донором электронов служит ферредоксин, для второй - NADH (Cullimore, Sims, 1981с, Galvan et al., 1984). Обе формы глута-матсинтазы расположены в хлоропласте (Fisher, Klein, 1988), и, таким образом, полный GS-GOGAT цикл у С. reinhardtii осуществляется только в пластидах. К сожалению, гены, кодирующие GOGAT, не клонированы и о характере их экспрессии известно очень мало. Активность ферредоксин-GOGAT увеличивается на свету, к тому же при росте клеток на среде с аммонием она выше, чем при росте на среде с нитратом в качестве единст- венного источника азота (Cullimore, Sims, 1981b; Marquez et al., 1986; Martinez-Rivas et al., 1991). Активность NADH-GOGAT не зависит от света, что говорит, по-видимому, о всего лишь вспомогательной роли этого фермента в фотосинтетической ассимиляции аммония (Martmez-Rivas et al., 1991).

Помимо ферментов GS-GOGAT цикла у С. remhardtii обнаружен фермент ІЧАО(Р)Н-глутаматдегидрогенеза (GIDH), который катализирует обратимое аминирование 2-оксоглутарата с образованием глутамата, однако его роль в азотном метаболизме до сих пор не ясна (Cullimore, Sims, 1981b; Fisher, Klein, 1988). Выявлено три формы этого фермента (GIDH1-3), но точная их локализация в клетке не установлена (Fisher, Klein, 1988; Moyano et al., 1992). Предполагается, что только GIDH1 принимает участие в ассимиляции аммония, тогда как GIDH2 и GIDH3, образуя 2-оксоглутарат, являются посредниками в цикле трикарбоновых кислот (Moyano et al., 1992).

Следует подчеркнуть, что в отсутствие в среде аммония и нитрата клетки С. remhardtii способны использовать и другие источники азота, такие как аминокислоты, мочевина и пуриновые нуклеотиды. При этом аргинин -единственная аминокислота, которая переносится в клетки специальной транспортной системой, индуцируемой при голодании и репрессируемой аммонием (Kirk, Kirk, 1978). Остальные аминокислоты внеклеточно деами-нируются неспецифической оксидазой L-аминокислот с образованием соответствующей оксокислоты и аммония, который далее транспортируется в клетки (Munoz-Blanco et al., 1990). В среде, содержащей ацетат, образовавшиеся оксокислоты не утилизируются, таким образом, их органический скелет не используется в качестве источника углерода (Munoz-Blanco et al., 1990). In vitro оксидаза L-аминокислот способна деаминировать все аминокислоты, кроме цистеина и пролина (Vallon et al., 1993), однако С. reinhardtii утилизирует только 12 аминокислот: аспарагин, глутамин, аргинин, лизин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серии, метионин, гистидин и фенилала-нин (Munoz-Blanco et al., 1990). Оксидаза активируется при голодании клеток в среде с источником органического углерода (Vallon et al., 1993).

Глутамат, образующийся в GS/GOGAT цикле, играет важную роль в метаболических путях углеводов и липидов (Torchinsky, 1987; Lam et al., 1996). У С. reinhardtii обнаружены две аминотрансферазы: L-аспартатаминотрансфераза (ААТ), переносящая аминогруппу от глутамата на аспартат, и L-аланинаминотрансфера (AST), переносящая аминогруппу от глутамата на аланин (Munoz-Blanco et al., 1988; Chen et al., 1996). Оба фермента состоят из двух идентичных субединиц, размером 65 кДа (у ААТ) и 45 кДа (у AST). ААТ и AST также активируются при голодании в присутствии источника органического углерода (Munoz-Blanco et al., 1988). В данных условиях трансаминирование контролирует содержание внутриклеточных аминокислот, обеспечивая клетки азотом и/или углеродом для их нормального функционирования (Munoz-Blanco et al., 1988; Lam et al., 1996).

Пурины являются важной составляющей нуклеиновых кислот, регуляторов метаболизма, АТФ, а также коферментов. С. reinhardtii способна утилизировать такие соединения как аденин, гуанин, гипоксантин, аллантоин, мочевина. Деградация пуринов происходит по тому же пути, что у высших растений, животных и многих микроорганизмов (Pineda et al., 1994). Поглощение пуринов С. reinhardtii осуществляется транспортными системами с высоким сродством, которые репрессируются в присутствии аммония. Аденин и гуанин переносятся в клетки одной и той же транспортной системой (Lisa et al., 1995), тогда как ксантин и гипоксантин - разными (Perez-Vicente et al., 1992; Lisa et al., 1995). Поглощение гипоксантина подавляется адени-ном и гуанином, чей транспорт, в свою очередь, конкурентно ингибируется гипоксантином (Perez-Vicente et al., 1991; Lisa et al., 1995). При росте С. reinhardtii на ксантине в качестве единственного источника азота в клетках временно образуется пул ксантина, который виден как электронно-плотный материал в цитоплазматических вакуолях (Perez-Vicente et al., 1995). Мочевина очень быстро поглощается клетками и запасается в хлоропласте в виде метаболически неактивного пула (Williams, Hodson, 1977). С. reinhardtii гидролизует мочевину до аммония с помощью ферментного комплекса АТФ:амидолиазы мочевины (Leftley, Syrett, 1973). Этот комплекс обладает двумя ферментативными активностями: сначала мочевина карбоксилирует-ся с образованием аллофаната, затем лиаза расщепляет аллофанат с образованием аммония (Whitney and Cooper, 1973; Hodson et al., 1975). Метаболизм мочевины репрессируется аммонием и индуцируется мочевиной или ацетамидом в отсутствии аммония (Hodson et al., 1975; Semler et al., 1975).

Обобщая имеющийся в настоящей время литературный материал, следует отметить, что подвижные клетки водорослей, обладающие жгутиковым аппаратом, демонстрируют, по крайней мере, шесть типов поведенческих реакций. Среди них наиболее изученными являются светозависимые поведенческие ответы. Данные о разнообразии строения фоторецепторных систем водорослей представляют значительный интерес в качестве дополнительных признаков, позволяющих более полно обосновать филогенетическую систему водорослей. Кроме того, результаты последних исследований фотоповедения зеленых водорослей свидетельствуют о важной роли биоэлектрических процессов в фоторегуляции их движения. По мнению некоторых авторов, изменение электрического потенциала в клеточной мембране с последующим электрическим возбуждением мембраны может быть общим компонентом в системе преобразования световых сигналов у отдельных представителей прокариотических и эукариотических организмов. Однако это предположение имеет пока скорее характер рабочей гипотезы.

Хемотаксис водорослей остается одной из наименее изученных областей их поведения. В литературе мало данных о возможных механизмах преобразования и передачи хемосенсорных сигналов. Отсутствие синтетических аналогов аттрактантов и недостаток данных о соединениях, которые могут быть хемоэффекторами, существенно ограничивают возможности изучения механизмов регуляции хемотаксиса. Это отчасти связано с тем, что синтезируемые клетками аттрактанты выделяются в среду в очень незначительных количествах, их пороговые концентрации составляют около 10"¹⁰-10"¹² М. Необходимость использования в большинстве случаев высокоспецифичных методов выделения и очистки этих соединений выводит эту проблему за рамки только биологической. Многие ключевые вопросы, связанные с исследованием хемосенсорного поведения, могут быть решены с помощью выявления и использования более доступных соединений - хе-моэффекторов. Изучение регуляторных механизмов поведения невозможно без привлечения модельных объектов, для которых разработаны методы молекулярно-генетического анализа. В связи с этим, использование в качестве модельной системы реакцию хемотаксиса С. reinhardtii к аммонию может способствовать более успешному изучению этого типа поведенческих реакций. Кроме того, участие транспортеров в качестве сенсоров в пути передачи сигнала открывает дополнительные перспективы для анализа функций транспортных белков у одноклеточных организмов и может способствовать выявлению физиологической основы взаимосвязи между процессами транспорта и метаболизма аммония, и направленного движения к аммонию.

Системы транспорта аммония у грибов

Наряду с глутамином и аспарагином, аммоний является для грибов наиболее предпочтительным источником азота (Marini et al., 1997). Транспорт аммония осуществляется специальными МЕР-транспортерами. Белки МЕР1 и МЕР2 являются транспортерами с высоким сродством к аммонию (Кт 1-10мкМ), тогда как МЕРЗ относится к LATS-системе (Кт 1,4-2,1 мМ); тем не менее, аминокислотные последовательности МЕР1 и МЕРЗ обладают 79%-ной гомологией (Marini et al., 1997). Штаммы, утратившие все три Мер-гена, не способны расти на средах с содержанием аммония (в качестве единственного источника азота) менее чем 5 мМ. С другой стороны, при высоких концентрациях аммония ( 20 мМ) отсутствие МЕР-транспортеров не критично для роста клеток.

Помимо собственно транспортной функции, белок МЕР2 также принимает участие в контроле дифференцировки псевдогиф у Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans в условиях азотного голодания (Lorenz, Heit-man, 1998; Biswas, Morschhauser, 2005). Таким образом, МЕР2-пермеаза является сенсором внеклеточного аммония, регулируя переход клеток к филаментозному росту путем активации GPA2 - а-субъединицы одного из G-белков, который совместно с белком RAS2 координирует рост клеток дрожжей (рис. 4; Lorenz, Heitman, 1998). Однако никаких свидетельств прямого взаимодействия между МЕР2 и GPA2 не обнаружено. Можно предпо ложить, что МЕР2 вовлечен в синтез некоего соединения (возможно продукта азотного метаболизма), который, в свою очередь, активирует GPA2.

Схожий тип регуляции с участием G-белков показан также на примере перехода клеток S. pombe и С. neoformans к половому размножению в условиях азотного голодания (Isshiki et al., 1992; Alspaugh et al., 1997). Тем не менее, непосредственно механизм активации G-белков остается не выясненным.

Цикл развития миксамебы D. discoideum включает в себя такие необычные этапы, как формирование многоклеточных структур путем агрегации отдельных клеток и формирование плодового тела, состоящего из го ловки со спорами и «стебелька». Аммоний является одной из самых важных сигнальных" молекул, регулирующих различные клеточных процессы на протяжении всего цикла развития (Follstaedt et al., 2003). На ранних стадиях агрегации в зависимости от концентрации аммония в среде изменяется характер передвижения индивидуальных клеток за счет ингибирования синтеза цАМФ (Bonner et al., 1986, 1989). Изменения в активности цАМФ-зависимой протеинкиназы также лежат в основе формирования многоклеточного организма на завершающих стадиях развития (Singelton et al., 1998).

У D. discoideum показано наличие трех транспортеров аммония - AmtA, AmtB и AmtC. Все АМТ-гены экспрессируются на относительно постоянном уровне, однако обладают пространственной и временной регуляцией (Follstaedt et al., 2003). В частности, на стадии образования агрегатов ген amtA имеет наибольший уровень экспрессии в тех клетках, которые в дальнейшем образуют «стебелек», тогда как гены amtB и amtC - в клетках, которые в дальнейшем образуют споры (Follstaedt et al., 2003). Поскольку «престе-бельковые» клетки, как показано, экспортируют аммоний, обеспечивая им «преспоровые» клетки (Cotter et al., 1992), то, можно предположить, что AmtA отвечает за экспорт аммония из клеток, a AmtB и AmtC - за его импорт. Кроме того, AmtC, аналогично МЕР2, является сенсором аммония и участвует в пути передачи сигнала, который определяет переход в стадию многоклеточного организма (Follstaedt et al., 2003).

Вполне вероятно, что транспортеры аммония у D. discoideum принимают участие в регуляции гораздо большего числа клеточных процессов. Все это является предметом дальнейших исследований.

У Chlamydomonas reinhardtii перенос аммония, также как и у высших растений, осуществляется двумя транспортными системами (HATS и LATS). Однако молекулярно-генетический анализ последовательностей генома С. reinhardtii выявил наличие сразу 8 генов АМН-семейства (СгАМТЇ), кодирующих белки-транспортеры аммония (Gonzalez-Ballester et al., 2004). Филогенетический анализ генов показал, что семейство СгАМТЇ имеет промежуточное эволюционное положение между АМН-белками высших растений и дрожжей с одной стороны, и бактериями с другой стороны (рис. 5).

Тем не менее, СгАМТ1;1-1;6 близки семейству АМН высших растений (от 33 до 45% сходства), тогда как филогенетическое родство СгАМТ1;7 и СгАМТ1;8 к семейству АМТ1 высших растений не столь очевидно (только 21-29%). СгАМТЇ ;2 и СгАМТ1;8 с высокой вероятностью ( 90%) имеют хло-ропластный сигнальный и транзитный пептиды, соответственно. Для двух генов - CrAmt1;5 и CrAmt1;7 - обнаружена возможность альтернативного сплайсинга.

. Филогенетичесое древо АМТ1 белков (по Gonzeiles-Ballester etal.,2004) Длинный и короткий варианты СгАМТ1;7 обладают митохондриальным сигнальным и транзитным пептидом, соответственно. СгАМТ1;3 и СгАМТ1;4, по-видимому, не имеют сигнальной последовательности, тогда как, СгАМТ1;1 и СгАМТ1;5, скорее всего, локализованы в плазматической мембране. Особенностью СгАМТ1;8, которой нет у других транспортеров аммония, является наличие аланин-богатого участка (размером около 50 аминокислот), который располагается между трансмембранными доменами 6 и 7. Два остатка гистидина и один аргинина, консервативные в большинстве АМН -белков высших растений, также присутствуют в СгАМН, тогда как высоко консервативный аспартатный участок (Howitt, Udvardi, 2000) заменен в СгАМН ;7 и СгАМН ;8 на аспарагиновый.

Блот-гибридизация по Саузерну

Выделенная тотальная ДНК обрабатывалась рестриктазами (Apal, Pstl или Pvull (Fermentas, Канада); 12 ч при 37С), после чего образовавшиеся фрагменты разделяли электрофорезом в 0,7%-агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану Nitran N (Schleicher&Shuell, США; Sambrook et al., 1989). Изготовление меченого зонда (ПЦР-продукт гена Ые; рис. 6) с использованием дУТФ-дигоксигенина, а также отмывку мембраны проводили согласно рекомендации производителя (Boehringer Mannheim, Германия; The DIG System User s Guide for Filter Hybridization). Детекцию сигнала производили на фотопленке XAR-5 (Kodak, США; время экспозиции -1 ч).

Вегетативные клетки из логарифмической фазы роста (15-20 мкг хлорофилла) осаждали центрифугированием (5000 об/мин, 3 мин) и ресуспен-дировали в среде ТМР без азота. Для получения прегамет и гамет клетки инкубировали 18 ч в темноте или на свету, соответственно. Затем к 2 мл суспензии добавляли [14С]-метиламмоний (NEN, США) до конечных концентраций 6, 8, 12,5, 25, 50, 100 и 200 мкМ. Каждые 3 минуты при постоянном перемешивании отбирали по 250 мкл суспензии и центрифугировали (12000 об/мин, 1 мин) в удлиненных эппендорфах с 80 мкл смеси динонилфталата (Fluka, Швейцария) с силиконом (Fluka, 60:40). Затем 50 мкл супернатанта добавляли к 2 мл специального буфера (Ready Gel, Beckman), и подсчитывали количество распадов ядра изотопа 14С в счетчике LS 6000ТА (Beckman). Начальную скорость поглощения V вычисляли для каждого временного отрезка по следующей формуле (Franco et al., 1988):

v _ cpml - cpml

R t2x) где cpml и cpm2 - число распадов/мин [14С]-метиламмония в моменты времени U и t2, соответственно; R - исходное число распадов/мкмоль/мин.

Значения Vmax и Km определяли графическим способом.

Для определения содержания хлорофилла к 100 мкл суспензии клеток добавляли 500 мкл ацетона. Смесь перемешивали и центрифугировали 10 мин (12000 об/мин). Отбирали супернатант и измеряли его поглощение (А) при длине волны 652 нм. Содержание хлорофилла (Chi) вычисляли по формуле (в мг/мл):

Е где Е - коэффициент экстинкции света (ослабление света при распространении в среде за счет процессов поглощения и рассеяния).

Вегетативные клетки (50 мл) из логарифмической фазы роста осаждали центрифугированием (5000 об/мин, 3 мин, 4С), ресуспендировали в 1 мл буфера (50 мМ Трис-НСІ, рН 8; 0,3 М NaCI; 5 мМ ЭДТА; 2% SDS) и хранили при -80С. Для опыта смесь центрифугировали, супернатант отбирали и трижды обрабатывали смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1), после чего нуклеиновые кислоты переосаждали в хлороформе (Sambrook et al., 1989). При выделении ДНК смесь оставляли в 95 этаноле на 30 мин при -20С, затем переосаждали 70 этанолом. Осадок высушивали и растворяли в воде MilliQ. При выделении РНК смесь оставляли в 95 этаноле на 3-4 часа при -20С, после чего ресуспендировали в 4М LiCI и оставляли не менее чем на 4 ч при -4С. Затем РНК осаждали из раствора двойным объемом 70 этанола и растворяли в воде MilliQ с 0,1% диэтилпирокарбонатом.

Синтез одноиепочечной кДНК

Для синтеза одноцепочечной кДНК из тотальной РНК, выделенной из разных штаммов, использовали N-(polyT)2omer праймеры в соответствии с инструкцией фирмы-производителя (Invitrogen, Нидерланды). Смесь объемом 12 мкл, содержащую 1 мкл Oligo(dT)12-i8, 2 мкг РНК и 1 мкл смеси де-зоксирибонуклеотидилфосфатов, нагревали при 65С в течение 5 мин. Затем добавляли 4 мкл реакционного буфера, 0,5 мкл ингибитора РНКазы и 0,5 мкл фермента обратной транскриптазы; доводили общий объем смеси до 20 мкл водой MilliQ и инкубировали 50 мин при 42С. Реакцию инактиви-ровали путем нагревания смеси до 72С в течение 15 мин. Синтезированную кДНК хранили при -40С.

Амплификация методом ПЦР

Реакции осуществлялись в объеме 25 мкл со следующими компонентами: 0,2 пМ каждого праймера (табл. 2); 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклео-тидилфосфатов; 0,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Biotools, Испания); 2,5 мМ MgCI2; 1-2 мкл одноцепочечной кДНК; 2,5 мкл реакционного буфера и 2-3% диметилсульфоксида (ДМСО). Условия реакций были следующими: денатурация ДНК (95С, 5 мин); 40 циклов, состоящих из денатурации ДНК (95С, 30 с), отжига праймеров (53-68С, 30 с), синтеза цепи ДНК (72С, 15 с); дополнительный синтез ДНК (72С, 10 мин).

Характеристика мутантов, способных к гаметогенезу в отсутствии светового сигнала

Были изучены хемотактические ответы трех Irg мутантов (от англ. [ight regulation of gametogenesis), которые дифференцировались в компетентные гаметы, как на свету, так и в отсутствие светового сигнала (Gloecker, Beck, 1995). В отличие от дикого типа, вегетативные клетки Irg штаммов в среде без азота в темноте полностью утратили хемотаксис к аммо-нию/метиламмонию (табл. 5).

Возможно, что мутации Ігд1, ІгдЗ и Irg4 привели к нарушению генов, продукты которых вовлечены в отрицательный контроль процесса гамето-генеза, который снимается у клеток дикого типа действием светового сигнала. Наличие задержки в процессе формирования хемотактически неактивных гамет у штамма 1гд4, вероятно, связано с остаточной активностью продукта этого гена. Генетический анализ Irg мутантов позволил предположить, что белки LRG1, LRG3 и LRG4 формируют гетеромультимерный комплекс, который может быть включен у дикого типа в поддержание стадии прегамет в отсутствие светового сигнала (Beck, Haring, 1996). Его инактивация приводит к независимой от света дифференцировке гамет. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что этот комплекс также контролирует изменение в системе хемотаксиса у гамет. Для подтверждения этой гипотезы необходимо клонирование Ігд-генов и характеристика их продуктов.

Таким образом, способность С. reinhardtii реагировать на аммоний (и метиламмоний) зависит от этапа жизненного цикла и полностью утрачивается гаметами. Биологический смысл подобного изменения характера поведения в ходе жизненного цикла может быть связан с тем, что аммоний приводит к дедифференцировке гамет в вегетативные клетки (Beck, Haring, 1996) и, таким образом, наличие реакции хемотаксиса к аммонию у гамет обеспечивало бы их движение к соединению, которое блокировало бы осуществление их основной биологической функции - формирование пары с гаметой противоположного типа спаривания в ходе полового цикла развития. Для проверки этой гипотезы была проанализирована возможность восстановления реакции хемотаксиса под действием источников азота.

Как отмечалось, в индукции половой дифференцировки С. reinhardtii ключевую роль играет удаление из среды источника азота (Sager, Granick, 1954). Причем недостаток в среде других элементов не влияет на инициацию процесса гаметогенеза С. reinhardtii, что свидетельствует об уникальной роли именно азота в контроле дифференцировки вегетативных клеток в гаметы (Harris, 1989). В почве, где преимущественно обитает Chlamydomo-nas, количество азота часто лимитировано, поэтому формирование в ответ на удаление азота устойчивых к воздействию температуры и высушиванию зигот, по-видимому, отражает адаптационный механизм, способствующий выживанию в природе этого фотосинтезирующего микроорганизма.

Компоненты регуляторной системы, контролирующей восприятие недостатка азота в среде и последующий переход к половой дифференциров-ке, пока не изучены. Инициация гаметогенеза голоданием по азоту, вероятно, является интегральной частью этой системы. Причем именно ионы аммония контролируют переход к гаметогенезу (Matsuda et al., 1992). В связи с этим, изучение механизмов контроля системы хемотаксиса к аммонию в процессе гаметогенеза позволит приблизиться к пониманию общей системы, регулирующей половую дифференцировку у С. reinhartitii.

Добавление в безазотную среду аминокислот, используемых С. reinhartitii в качестве источников азота, не приводило, в отличие от аммония (Matsuda et al., 1992), к блоку дифференцировки вегетативных клеток в гаметы. В наших экспериментах внесение в среду TMP-N глутамина не блокировало также и процесс дифференцировки, приводящий к утрате хемотаксиса к ионам аммония (рис. 13). Однако при добавлении глутамина в среду, содержащую ацетат Na (TAP-N), исчезновение реакции хемотаксиса не происходило. Подобное различие в результатах можно объяснить тем, что ассимиляция глутамина клетками С. reinhartitii происходит только в присутствии в среде ацетата (Munoz-Blanco et al., 1990). Нарушение утраты хе-мотактической активности в присутствии аминокислот в среде с ацетатом Na может быть связано с аккумуляцией ионов аммония в среде при деза-минировании аминокислот.

В пользу этого предположения свидетельствует блокирование диффе-ренцировки и сохранение клетками хемотактическои активности в присутствии только ассимилируемых С. reinhardtii аминокислот (табл. 6).

У С. reinhardtii процесс внеклеточного дезаминирования аминокислот осуществляет неспецифическая оксидаза L-аминокислот (Munoz-Blanco et al., 1990), действие которой может быть определено по накоплению в среде 2-кето-кислот. В частности, из L-аланина под действием оксидазы формируется пировиноградная кислота, которая была зафиксирована только в среде содержащей ацетат Na (рис. 14), то есть в условиях, когда в клетках была блокирована утрата хемотаксиса к ионам аммония. В среде без ацетата не происходит формирование 2-кето-кислоты, а, значит, и ионов аммония, и клетки полностью утратили хемотаксис к аммонию.

Получение и характеристика мутанта с нарушенной активностью системы HATS

Были изучены хемотактические ответы трех Irg мутантов (от англ. [ight regulation of gametogenesis), которые дифференцировались в компетентные гаметы, как на свету, так и в отсутствие светового сигнала (Gloecker, Beck, 1995). В отличие от дикого типа, вегетативные клетки Irg штаммов в среде без азота в темноте полностью утратили хемотаксис к аммо-нию/метиламмонию (табл. 5).

Возможно, что мутации Ігд1, ІгдЗ и Irg4 привели к нарушению генов, продукты которых вовлечены в отрицательный контроль процесса гамето-генеза, который снимается у клеток дикого типа действием светового сигнала. Наличие задержки в процессе формирования хемотактически неактивных гамет у штамма 1гд4, вероятно, связано с остаточной активностью продукта этого гена. Генетический анализ Irg мутантов позволил предположить, что белки LRG1, LRG3 и LRG4 формируют гетеромультимерный комплекс, который может быть включен у дикого типа в поддержание стадии прегамет в отсутствие светового сигнала (Beck, Haring, 1996). Его инактивация приводит к независимой от света дифференцировке гамет. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что этот комплекс также контролирует изменение в системе хемотаксиса у гамет. Для подтверждения этой гипотезы необходимо клонирование Ігд-генов и характеристика их продуктов.

Таким образом, способность С. reinhardtii реагировать на аммоний (и метиламмоний) зависит от этапа жизненного цикла и полностью утрачивается гаметами. Биологический смысл подобного изменения характера поведения в ходе жизненного цикла может быть связан с тем, что аммоний приводит к дедифференцировке гамет в вегетативные клетки (Beck, Haring, 1996) и, таким образом, наличие реакции хемотаксиса к аммонию у гамет обеспечивало бы их движение к соединению, которое блокировало бы осуществление их основной биологической функции - формирование пары с гаметой противоположного типа спаривания в ходе полового цикла развития. Для проверки этой гипотезы была проанализирована возможность восстановления реакции хемотаксиса под действием источников азота.

Как отмечалось, в индукции половой дифференцировки С. reinhardtii ключевую роль играет удаление из среды источника азота (Sager, Granick, 1954). Причем недостаток в среде других элементов не влияет на инициацию процесса гаметогенеза С. reinhardtii, что свидетельствует об уникальной роли именно азота в контроле дифференцировки вегетативных клеток в гаметы (Harris, 1989). В почве, где преимущественно обитает Chlamydomo-nas, количество азота часто лимитировано, поэтому формирование в ответ на удаление азота устойчивых к воздействию температуры и высушиванию зигот, по-видимому, отражает адаптационный механизм, способствующий выживанию в природе этого фотосинтезирующего микроорганизма.

Компоненты регуляторной системы, контролирующей восприятие недостатка азота в среде и последующий переход к половой дифференциров-ке, пока не изучены. Инициация гаметогенеза голоданием по азоту, вероятно, является интегральной частью этой системы. Причем именно ионы аммония контролируют переход к гаметогенезу (Matsuda et al., 1992). В связи с этим, изучение механизмов контроля системы хемотаксиса к аммонию в процессе гаметогенеза позволит приблизиться к пониманию общей системы, регулирующей половую дифференцировку у С. reinhartitii.

Добавление в безазотную среду аминокислот, используемых С. reinhartitii в качестве источников азота, не приводило, в отличие от аммония (Matsuda et al., 1992), к блоку дифференцировки вегетативных клеток в гаметы. В наших экспериментах внесение в среду TMP-N глутамина не блокировало также и процесс дифференцировки, приводящий к утрате хемотаксиса к ионам аммония (рис. 13). Однако при добавлении глутамина в среду, содержащую ацетат Na (TAP-N), исчезновение реакции хемотаксиса не происходило. Подобное различие в результатах можно объяснить тем, что ассимиляция глутамина клетками С. reinhartitii происходит только в присутствии в среде ацетата (Munoz-Blanco et al., 1990). Нарушение утраты хе-мотактической активности в присутствии аминокислот в среде с ацетатом Na может быть связано с аккумуляцией ионов аммония в среде при деза-минировании аминокислот. В пользу этого предположения свидетельствует блокирование диффе-ренцировки и сохранение клетками хемотактическои активности в присутствии только ассимилируемых С. reinhardtii аминокислот (табл. 6).

У С. reinhardtii процесс внеклеточного дезаминирования аминокислот осуществляет неспецифическая оксидаза L-аминокислот (Munoz-Blanco et al., 1990), действие которой может быть определено по накоплению в среде 2-кето-кислот. В частности, из L-аланина под действием оксидазы формируется пировиноградная кислота, которая была зафиксирована только в среде содержащей ацетат Na (рис. 14), то есть в условиях, когда в клетках была блокирована утрата хемотаксиса к ионам аммония. В среде без ацетата не происходит формирование 2-кето-кислоты, а, значит, и ионов аммония, и клетки полностью утратили хемотаксис к аммонию.

Проведенные ранее исследования доказали возможность использования ядерной трансформации для получения инсерционных мутантов С. reinhardtii с нарушениями в поведенческих ответах (Ермилова и др., 1999; Ермилова и др., 2000) и гаметогенезе (Dame et al., 2000).

При трансформации клеток для получения этих групп мутантов была использована плазмида, содержащая гомологичный ген аргининсукцинат-лиазы. Выбор для трансформации плазмидных векторов, содержащих собственные гены С. reinhardtii, предполагает использование ауксотрофных реципиентных штаммов, которые не всегда подходят для анализа поведенческих ответов и дают, как правило, низкую выживаемость мейотического потомства после скрещиваний. Вместе с тем, маркеры устойчивости к антибиотикам и различным ингибиторам не требуют использования специальных мутантных штаммов. Так, плазмида pSP124S (см. рис. 6), содержащая бактериальный ген Ые, который определяет устойчивость к зеомицину, была успешно использована для получения фотосинтетических мутантов Chlamydomonas (Dent et al., 2005). Нами была использована плазмида pSP124S для получения мутантов С. reinhardtii с нарушениями в реакции хемотаксиса при росте на средах с различными источниками азота.

В качестве реципиентного штамма нами был выбран штамм СС-124. Эффективность трансформации в среднем составила 79,7 трансформантов на 1 мкг ДНК плазмиды pSP124S (табл. 8), что несколько ниже данных, полученных Schroda с соавторами (2002), но согласуется с показателями, полученными Dent с соавторами (2005). В работе последних авторов также использовался в качестве реципиентного штамм с клеточной стенкой, а не мутанты по синтезу компонентов клеточной стенки. Можно предположить, что дополнительная процедура обработки клеток автолизином (см. рис. 7) сказывается на конечном числе жизнеспособных трансформантов. В результате четырех опытов было отобрано 1276 трансформантов.

Первоначальный скрининг трансформантов проводился на средах, содержащих нитрат или аргинин в качестве источников азота и метиламмонии в различных концентрациях (0,1, 1 и 4 мМ). Метиламмонии токсичен для Chlamydomonas, и клетки водоросли приобретают резистентность к этому соединению в результате нарушений в транспортных системах аммо-ния/метиламмония. Нами было отобрано 12 резистентных к метиламмонию штаммов.

Второй этап отбора проводился на среде, содержащей в качестве источника азота аминокислоту глутамин. Как нами отмечалось ранее, ассимиляция аминокислот (за исключения аргинина) происходит через поглощение аммония, образующегося при действии экзогенной оксидазы аминокислот, то есть в результате процесса, при котором клетки испытывают в течение некоторого времени недостаток азота; последнее обстоятельство приводит к экспрессии HATS, нарушения в которой будут сказываться на показателях роста. Нами был отобран штамм, который при росте на глутамине демонстрировал задержку роста (рис. 25), и время генерации мутантного штамма составляло 22 ч, по сравнению с 13 ч для исходного штамма.

Параллельно нами был проведен анализ реакции хемотаксиса к аммонию (рис. 25). Как видно из полученных результатов, клетки обнаруживали хемотактическую реакцию только через 96 ч инкубации в среде с глутамином, что совпадает с моментом начала роста культуры. Подобная задержка может быть связана с нарушением экспрессии компонентов системы HATS, а для функционирования второй системы, LATS, обладающей меньшим сродством к аммонию, требуются его большие концентрации в среде, для достижения которых за счет функционирования оксидазы аминокислот требуется некоторый период времени. Характеристика транспортных систем к аммонию

Для проверки предположения о нарушении у мутанта транспортной системы с высоким сродством был проведен ряд экспериментов по транспорту метиламмония. Сравнительный анализ кинетик поглощения [14С]-метиламмония у дикого типа и мутанта показал, что тогда как у дикого типа присутствуют оба типа транспортных систем для переноса аммо-ния/метиламмония в клетки (LATS и HATS), у трансформанта активна только система LATS (рис. 26). В связи с этим мутант был назван hatl (от англ. defective in HATS).

В настоящее время ни у одного организма система LATS не охарактеризована на молекулярном уровне. Есть данные, указывающие на то, что у растений поглощение NH4+ с низким сродством может осуществляться с помощью неспецифических К+-каналов и/или К+-транспортеров, чувствительных к ингибитору К+-каналов - тетраэтиламмонию (ТЭА). Нами была проверено возможное включение этого типа К+-каналов в систему LATS. Если штамм hatl был перенесен в среду ТАР с ТЭА, клетки полностью сохраняли подвижность, но утрачивали хемотактическую активность (рис. 27, а) и у них блокировалось поступление [14С]-метиламмония (рис. 27, в). У клеток дикого типа после внесения ТЭА не нарушалась хемотактическая активность и сохранялась некоторая активность системы LATS (рис. 27, б).

Полученные данные позволяют нам предположить, что LATS-система у hatl включает К+-каналы, чувствительные к ТЭА. Нас интересовало, необходима ли для передачи хемотактического сигнала активно функционирующая LATS-система. Для выявления этого вопроса вегетативные клетки были выращены в среде, содержащей в качестве единственного источника азота мочевину (рис. 28). Как отмечалось, мочевина переносится в клетки С. reinhardtii с помощью специфического транспортера, после чего гидролизуется специальным ферментативным комплексом с образованием внутриклеточного аммония, который ассимилируется клетками, обеспечивая их рост. В этих условиях транспортеры аммония не функционируют. в среду TAP-N с мочевиной в момент времени 0.

Как видно из рис. 28, клетки демонстрировали нормальный рост, но полностью утратили хемотактическую активность. Это свидетельствует в пользу предположения, что для восприятия/передачи хемотактического сигнала требуется активно-функционирующая транспортная система аммония.

Похожие диссертации на Регуляция хемотаксиса в жизненном цикле одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii

Белковый состав нуклеоидов пластид высших растений и зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtiiОлескина Юлия Петровна

Влияние серного голодания на первичном процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное образование водорода у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtiiВолгушева Алена Александровна

Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtiiЧекунова Елена Михайловна

Выделение водорода Chlamydomonas reinhardtii в условиях недостатка серыТолстыгина Ирина Викторовна

Белки теплового шока HSP70B хлоропластов Chlamydomonas reinhardtii: связь с устойчивостью клеток к окислительному стрессу и репарацией ДНКЕрмохина Ольга Викторовна

Влияние некоторых факторов среды на биопродуктивность водорослей рода Chlamydomonas в сточных водах химического производстваКраснояруженская Мария Александровна