Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Биологическая активность и механизм мембранотронного действия тритерпеиовых и стероидных гликозидов 9
1.1. Строение и биологическая активность тритерпеиовых и стероидных гликозидов 9
1.2. Взаимодействие тритерпеиовых и стероидных гликозидов с мембранами 18
1.3. Комплексе образование гликозидов со стеринами 23
1.4. Влияние гликозидов на свойства бислойных липидных мембран 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1. Материалы 37
2.2. Получение бислойных липидных мембран и измерение их электрических характеристик 43
2.3. Получение липосом и калориметрические измерения 45
2.4. Определение проницаемости липосомалышх мембран 46
2.5. Определение пролиферации опухолевых клеток 47
2.6. Измерение выхода ионов К+и гемоглобина из эритроцитов 47
ГЛАВА 3. Механизмы взаимодействия тритерпеиовых и стероидных гликозидов с липидными мембранами 49
3.1. Исследование механизмов мембранотропиого действия гликозидов голотурий 49
3.1.1. Влияние голотуринов на ионную проницаемость модельных и клеточных мембран 49
3.1.2. Влияние голотуринов иихгенинов натермотропный фазовых переход липосомальных мембран из дипальмитоилфосфотидилхолина 55
3.1.3. Калориметрическое изучение комплексообразования тритерпенового гликозида голотурина А2 и его свободного агликона с мембранным холестерином 60
3.1.4. Влияние кукумариозидов и их производных на ионную проницаемость мембран и термотропный фазовый переход дипальмитоилфосфотидилходина 65
3.2. Изучение механизма мембранотопного действия гликозилированных и свободных тритерпеиоидов растительного происхождения р-амирш-гового. даммаранового и лупанового рядов 72
3.2.1. Влияние гликозидов хедерагенина на ионную проницаемость и термотропное поведение мембран 72
3.2.2. Изучение механизма мембранотропного действия гликозидов женьшеня 79
3.2.3. Изучение механизма мембранотропного действия тритерпеноидов лупанового ряда 83
3.2.4. Влшшие свободных тритерпеноидов на свойства модельных мембран 87
3.3. Действие стероидного гликозида полигонатозида С1 и его агликона пенногенина на опухолевые клетки, липосомы и бислойные липидные мембраны 92
3.4. Мембранный механизм регуляции клеточной активности тритерпеновыми и стероидными гликозидами 99
Выводы 102
Литература
- Взаимодействие тритерпеиовых и стероидных гликозидов с мембранами
- Получение бислойных липидных мембран и измерение их электрических характеристик
- Влияние голотуринов на ионную проницаемость модельных и клеточных мембран
- Влияние кукумариозидов и их производных на ионную проницаемость мембран и термотропный фазовый переход дипальмитоилфосфотидилходина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Тритерпеновые и стероидные гликозиды (сапонины) относятся к классу низкомолекулярных биорегуляторов и обладают широким спектром медико-биологического действия. Они проявляют противоопухолевую, противогрибковую, противовирусную, и иммуномодулирующую активности и перспективны в качестве лекарственных препаратов и как инструменты в научных исследованиях. За последние 30 лет достигнуты значительные успехи в установлении их полной структуры. Накоплен обширный материал по связи между химическим строением и биологической активностью сапонинов. Многие виды биологической активности гликозидов обусловлены взаимодействием их с мембранными стеринами, в результате которого происходит нарушение структуры и избирательной проницаемости клеточных мембран. Для объяснения механизма действия гликозидов была предложена "стериновая" гипотеза. Но в настоящее время растет число фактов, которые не укладываются в рамки предложенной модели. В работах Богатского с соавт. и Корепановой с соавт. впервые было показано, что механизм действия тритерпеновых и стероидных гликозидов на мембраны, содержащие стерины, связан с образованием ионных каналов. К началу нашей работы зависимость параметров каналов от структуры гликозидов и стеринов была не изучена. Структура комплексов гликозидов со стеринами и роль углеводной части и агликона молекулы гликозида в образовании комплекса не ясна. Молекулярные механизмы взаимодействия гликозидов с мембранами были изучены недостаточно. Выяснение механизма действия тритерпеновых и стероидных гликозидов необходимо для успешного применения их в научных исследованиях, биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве. Поэтому изучение механизмов взаимодействия гликозидов с мембранами актуально как в теоретическом, так и в практическом отношении.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение физико-химических механизмов взаимодействия тритерпеновых и стероидных гликозидов с мембранами, установление общих закономерностей и индивидуальных особенностей действия гликозидов, выяснение различий в мембранотропном действии свободных и гликозилированных тритерпеноидов и стероидов. В задачи нашего исследования входило:
изучение механизма действия тритерпеновых гликозидов голотурий на ионную проницаемость и термотропное поведение модельных мембран; установление связи структура - активность и калориметрическое изучение комплексообразования тритерпенового гликозида голотурина Аг и его свободного агликона с мембранным холестерином;
изучение механизма мембранотропного действия гликозилированных и свободных тритерпеноидов растительного происхождения Р-амиринового, даммаранового и лупанового рядов
изучение механизма действия стероидного гликозида и его агликона на клеточные и модельные мембраны;
Научная новизна.
Впервые изучены ион-селективные каналы и неселективные поры, образованные гликозидами различного строения в стеринсодержащих мембранах. Установлена связь между химическим строением гликозидов, их каналообразующей активностью. Установлено, что каналообразующая активность и устойчивость мембран к действию гликозидов определяются липидным составом мембран, структурой и количественным содержанием стеринов в мембранах.
Впервые изучено влияние тритерпеновых гликозидов различного строения на термотропный фазовый переход липидных мембран и калориметрически показано образование комплексов одинаковой стехиометрии для тритерпенового гликозида и его свободного агликона с мембранным холестерином. Показана роль углеводного компонента и агликона в проявлении мембранотропного действия гликозидов.
Впервые показано, что тритерпеновые гликозиды из высших растений (гликозиды хедерагенина, бетулиновая кислота и ее гликозиды, цитотоксические гликозиды женьшеня) образуют ионные каналы в модельных и клеточных мембранах и влияют на физическое состояние липидного бислоя и термотропное поведение мембран. Показано обратимое регулирование проницаемости мембран с помощью рН-управляемых каналов, образованных тритерпеновым гликозидом.
Впервые изучен механизм мембранотропного действия стероидного гликозида и его свободного агликона на клеточные и модельные мембраны. Показано образование ионных каналов, и изменение физического состояния мембран в присутствии стероидного гликозида и отсутствие ионных каналов и стериноподобные эффекты при действии на мембраны его свободного агликона.
Впервые проведено сравнительное изучение мембранотропного действия свободных и гликозилированных тритерпеноидов животного и растительного происхождения и показаны различия в механизмах их действия. Предложены молекулярная модель действия гликозидов на мембраны и мембранный механизм регуляции клеточной активности биорегуляторами тритерпеновой и стероидной природы.
Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание физико-химических механизмов действия тритерпеновых и стероидных гликозидов на клетки, углубляют существующие представления о влиянии низкомолекулярных биорегуляторов на проницаемость мембран.
Установленные закономерности служат основой для прогноза мембранной активности новых соединений или модификации структуры известных соединений для получения заданных свойств.
Предложен новый биохимический инструмент для научных исследований на основе гликозида хедерагенина для регулируемого изменения проницаемости мембран.
Полученные данные по свойствам ионных каналов, образованных тритерпеновыми гликозидами, и по влиянию гликозидов и их генинов на термотропное поведение мембран могут найти применение в научно-исследовательских лабораториях. Результаты диссертационного исследования используются при чтении спецкурса для студентов, а также при выполнении курсовых и дипломных работ.
Обоснованность и достоверность результатов подтверждается использованием современных биофизических методов исследования мембран и способов обработки полученных экспериментальных данных.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999). Сделаны доклады на симпозиуме «Сапонины: Структура и биологическая активность» Американского химического общества (Чикаго, США, 1995); на международных конференциях по сапонинам (Пилава, Польша, 1999 и 2004): на XIII Всемирном конгрессе по токсинам (Париж, 2000); на IX Азиатско-тихоокеанском конгрессе (Тайбей, Тайвань, 1998); на региональных научных конференциях ТИБОХ ДВО РАН Владивосток. Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ.
Личный вклад автора состоит в том, что им самостоятельно получены экспериментальные данные по влиянию исследуемых соединений на ионную проницаемость и термотропное поведение мембран, проведена обработка и интерпретация полученных данных и написаны соответствующие разделы статей.
Структура и объем работы Работа состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, полученных экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 157 цитируемых работ. Работа изложена на 120 страницах, содержит 10 таблиц и 37 рисунков.
Работа проводилась при поддержке грантов РФФИ: № 96-04-51016-а, № 99-04-48058-а, №03-04-49521-а.
Взаимодействие тритерпеиовых и стероидных гликозидов с мембранами
Взаимодействие гликозидов с клеточной мембраной является первым этапом в действии гликозидов на клетки. Действие гликозидов на этом этапе проявляется в нарушении структуры и избирательной проницаемости клеточных мембран. В присутствии гликозидов обнаружено увеличение выхода ионов из клеток, а также УФ-поглощающих веществ нуклсотидного пула. Показано, что в зависимости от типа клеток, структурных особенностей гликозида и его концентрации наблюдается либо постепенное изменение проницаемости мембран, когда гликозиды в низких концентрациях вызывают выход ионов из клеток, а с увеличением концентрации наблюдается выход УФ-поглощающих веществ, либо одновременное увеличение проницаемости для ионов и УФ-поглощающих веществ [20]. Показано, что чувствительность клеток к действию гликозидов зависит от содержания стерштов в плазматических мембранах. Включение экзогенного холестерина в клеточные мембраны повышает чувствительность клеток к действию гликозидов [107, 108]. В экспериментах на липосомах было показано, что проницаемость липосом в присутствии гликозидов возрастает с увеличением содержания холестерина в липосомальной мембране. Липосомы без стерина не изменяли своей проницаемости в присутствии гликозидов. Стеринзависимость в действии гликозидов на проницаемость мембран проявляется в изменении проницаемости мембран в зависимости от вида и количественного содержания стеринов мембранах. Обнаружено, что эффективность действия гликозидов на клетки коррелирует с их действием на проницаемость липосомалытых мембран [108].
Тритерпеновые и стероидные гликозиды нарушают проницаемость мембран эритроцитов, вызывая выход ионов К+ и гемоглобина из эритроцитов (гемолиз). Гемолитическая активность гликозидов в настоящее время наиболее хорошо изучена [109, ПО]. В работе Трона [110] впервые проведено сравнительное изучение гемолитической активности гликозидов гол останов ого, амирииового и спиростанового рядов. Показано, что гликозид морского происхождения голостанового ряда голотурии А является наиболее сильным гемолитиком по сравнению с растительными гликозидами. В действии гликозидов на эритроциты имеются как общие черты, так и существенные различия. Обнаружено, что концентрация гликозида, при которой начинается гемолиз, зависит от концентрации клеток. Обнаруженные различия в действии гликозидов на эритроциты автор связывает с особенностями химического строения гликозидов и их способностью вызывать изменения в структуре клеточных мембран. Отмечено, что в некоторых случаях не наблюдается корреляция между гемолитической активностью и сродством гликозида к холестерину.
Известно, что гемолитическая активность гликозидов ингибируется свободным холестерином, плазмой крови и липидами [111]. Показано, что наиболее высокой нейтрализующей активностью обладает холестерин. Для нейтрализации активности гликозидов требуется в 20 и 30 раз большее количество молекул лецитина или альбумина, соответственно, чем молекул холестерина. Обнаружено, что гемолитическую активность некоторых гликозидов ингибируют свободные агликоны (генины) тритерпенових и стероидных гликозидов [112]. Ингибирующая активность генинов различна и была ниже, чем у холестерина. В случае гликозидов хедерагенина не наблюдалось ингибиругощсго действия генинов. По-видимому, это связано с частичной ионизацией карбоксильной группы в гликозидах хедерагенина и генинов при рН 6,5 и их электростатическим отталкиванием. Гликозид с метилированной карбоксильной группой ингибировался генинами [113]. Показано, что генины при введении в мембраны также, как холестерин, повышают чувствительность мембран к действию гликозидов.
Связь между структурой и гемолитической активностью производных олеаноловой кислоты проанализирована в работе [113]. Показано, что бисдссмозиды обладают слабой гемолитической активностью. Удаление углеводной части в положении С-28 увеличивает активность гликозида в 30 раз, а метилирование карбоксильной группы увеличивает активность в 10 раз. Удаление углеводной цепи по С-3 приводит к полной потери активности.
В работе японских авторов [27] изучены гемолитическая активность гликозидов различного строения, влияние их на проницаемость липосом и ингибирование гемолиза липосомами различного липидного состава. Показано, что гликозиды с двумя углеводными цепями не обладают гемолитической активностью и не изменяют проницаемость липосом до концентрации 2-10"4М. Гликозиды, вызывающие гемолиз, увеличивают проницаемость фосфатидилхолиновых липосом, содержащих холестерин. Поэтому, по мнению авторов, мишенью этих гликозидов в эритроцитарных мембранах является холестерин. Обнаружено, что прсинкубация гликозидов с липосомами, содержащими холестерин, ингибирует гемолиз. Показано, что особенностью гликозида даммаранового ряда является то, что его действие направлено на фосфатидилхолиновый бислой, а холестерин защищает мембраны от действия гликозида. Стероидный гликозид спир останов ого ряд, напротив, не действует на липосомы без стерина. Чувствительность липосом к действию стероидного гликозида возрастает с увеличением содержания холестерина в мембранах.
Получение бислойных липидных мембран и измерение их электрических характеристик
БЛМ получали по методу Мюллера [139] из 0.3-1,0% растворов липидов в н-гептане или н-октане на отверстии диаметром 0,25 мм тефлонового стаканчика, помещенного в термостатированную оптически прозрачную кювету, заполненную электролитом. Наблюдение за образованием БЛМ проводили в отраженном свете с помощью микроскопа МБС-2. Стерины, свободные тритерпеыоиды и стероиды вводили в формирующий раствор в определенном мольном отношении к липиду. Водные, водно-спиртовые растворы или растворы в диметил сульфоксиде (ДМСО) добавляли в водную фазу с двух сторон до формирования БЛМ или с одной стороны БЛМ после формирования мембраны.
Омическое сопротивление БЛМ измеряли на постоянном токе. Ток через БЛМ измеряли в режиме фиксации потенциала на мембране. Флуктуации тока через БЛМ в присутствии исследуемых соединений измеряли по стандартной методике в режиме фиксации потенциала на мембране. Ток от мембраны отводился с помощью Ag/AgCl-электродов. Электрические параметры БЛМ измеряли с помощью высокоомного вольтметра-электрометра ВК2-16 и регистрировали потенциометром КСП-4. Измерительный тракт позволял регистрировать флуктуации тока величиной до 10" 3А и длительностью до 0,5 секунд. Для устранения микрофонного эффекта БЛМ, обусловленного механическими колебаниями, установка виброизолировалась.
Сопротивление БЛМ (Rm) рассчитывали из соотношения: Rm=Roc UBx/UB1 [4, где UBX и UBblx-подаваемое на БЛМ и измеряемое на выходе усилителя напряжение, Roc - сопротивление обратной связи усилителя (Roc =10 ,10 ,10 ом). Значение удельной электропроводности БЛМ определяли по формуле: G=(RmS) 1 где S - площадь мембраны, которую определяли по диаметру мембраны, измеренному с помощью измерительного окуляра микроскопа МБС-2. Ошибка в измерении площади мембраны составляла не более 5%.
Проводимость одиночного канала (g) определяли по формуле: g= AlW R0C UBX где UBX - напряжение, подаваемое на БЛМ, А11вых - величина флуктуации напряжения в режиме измерения тока, Roc - сопротивление обратной связи усилителя. Наиболее вероятную проводимость канала находили из гистограмм распределения величины проводимости от 100 до 300 каналов, образованных исследуемыми соединениями. Среднее время нахождения ионных каналов в открытом состоянии (г) определяли из графика зависимости, построенного в логарифмическом масштабе,
N=N0exp(/i), где N - число каналов, находящихся в открытом состоянии время t. Значение lnNn на графике соответствует точке пересечения прямой с осью ординат. По величине In N=lnN(rl графически определяли величину т.
Селективность каналов определяли по величине и знаку потенциала, возникающего при создании десятикратного градиента (1М/0ДМ) концентрации соли через БЛМ с функционирующими каналами.
Электромеханическую стабильность БЛМ оценивали по величине разности потенциалов на мембранах, при которой наблюдается их разрушение.
Значение рН водной фазы внутри измерительной ячейки контролировали с помощью комбинированного микроэлектрода "Orion 91-15" (США). Изменение величины рН с одной стороны БЛМ проводили путем титрования соответствующими растворами ОД М ІІС1 или 0,1 М КС1 при хорошем перемешивании электролита в ячейке с помощью магнитной мешалки.
Межфазное натяжение on границы раздела раствор липнда в в н-гептане/электролит определяли методом взвешивания рамки. Платиновую квадратную рамку с размером ребра, равным 2 см, взвешивали на торсионных весах ВТ-200 без пленки и с цветной пленкой, полученной после продавливания рамки через границу раздела. Расчет о проводили согласно [124] по формуле: 0"12=(РгР2}/2/, где Р[ и Р2 - вес рамочки без и с цветной пленкой, соответственно, / -ширина рамочки. Значение рассчитывали по данным 15-20 независимых измерений в каждой точке. Точность измерений а12 составляла ±0,05 мН/м. Межфазное натяжение границы вода/воздух у определяли по методу [140] с помощью капилляра радиусом 3 мм и погрешностью измерений не более 5%.
Мультислойные липосомы для изучения термотропного поведения липидных мембран получали по стандартной методике [141]. Липидную пленку получали, высушивая на роторном испарителе раствор с заданной концентрацией дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) в свежеперегнанном хлороформе. К полученной липидной пленке (200-400 мкг ДПФХ) добавляли 2 мл бидистиллированноЙ воды и диспергировали при температуре выше температуры фазового перехода ДПФХ механическим встряхиванием в течении 15 минут при нагревании па водяной бане до температуры Т=50-60С. Полученные липосомы медленно охлаждали до комнатной температуры. Предварительные исследования показали, что липосомы, приготовленные этим методом, наиболее близки к состоянию термодинамического равновесия и дают хорошо воспроизводимые термограммы. Исследуемые свободные тритерпеноиды и стероиды вводили в хлороформный раствор липида до получения липосом для максимально возможного взаимодействия соединений с молекулами липида. Водные, водно-спиртовые растворы или растворы исследуемых гликозидов в ДМСО добавляли в водную фазу до получения липосом.
Влияние голотуринов на ионную проницаемость модельных и клеточных мембран
Взаимодействие голотуринов различного строения с липидными мембранами изучено высокочувствительным методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДОС), который позволяет определить природу возмущений в липидиом бислое, локализацию и характер взаимодействия молекул в мембране [146]. Действие голотурина А2 на фазовый переход ДПФХ в низких концентрациях проявляется в изменении параметров предперехода. снижении температуры, отвечающей пику предперехода, и уменьшении его энтальпии, что свидетельствует об изменении наклона жирнокислотиых цепей ДПФХ по отношению к плоскости бислоя в присутствии голотурина. С увеличением концентрации голотурина Аг (рис. 11) изменяются параметры основного фазового перехода ДПФХ гель-жидкий кристалл: сдвигается температура, уменьшается энтальпия и кооперативность этого перехода, появляется дополнительный пик с максимумом в области низких температур (рис. 11, А, В, Г). Температурный диапазон фазового перехода в присутствии голотурина А2 увеличивается и сдвигается в низкотемпературную область (рис. 11. А). Характер изменений термограмм ДПФХ свидетельствует о выраженном взаимодействии голотурина с липидным бислоем и о латеральном разделение фаз в мембране в присутствии тритерпенового гликозида. Латеральное разделение фаз молсет приводить к возникновению на границах доменов зон с нарушенной упаковкой молекул и к появлению различного рода "дефектов", ответственных за изменение ионной проницаемости липидных бислоев. Обнаружено, что увеличение ионной силы электролита усиливает гидрофобное взаимодействие молекулы гликозида с липосомальной мембраной (рис. 11, Б). По-видимому, разрушение гидратной оболочки вокруг углеводной цепи способствует более глубокому проникновению агликоиной части гликозида в гидрофобную область липидного бислоя.
Голотурии Ві оказывает аналогичное действие, вызывая латеральное разделение фаз в мембране, но в изменении относительной энтальпии наблюдается меньший скачек при концентрации 10"4 М, при которой начинается солюбилизация мембран, и в меньшей степени сдвигает фазовый переход в низкотемпературную область, чем голотурии А2. Голотурииогенин А2 изменяет энтальпию и кооперативность основного фазового перехода ДПФХ и оказывает стериноподобный эффект на параметры фазового перехода (рис. 12, А). Анализ зависимости относительной энтальпии фазового перехода ДПФХ от концентрации исследуемых соединений показал, что для голотуринов с тетрасахаридной углеводной частью наблюдается более резкое уменьшение относительной энтальпии, чем для гликозида с дисахаридной углеводной частью, В присутствии голотурина А изменение энтальпии и температуры фазового перехода (рис. 11, В и Г) происходят при более высокой концентрации гликозида. Ранее было показано, что детергенты дезоксихолат натрия и холат натрия влияют аналогичным образом на энтальпию основного фазового перехода ДПФХ [147].
Обнаружено, что голотуриногении А с окисленной и замкнутой боковой цепью влияет на термотропный фазовый переход при более высоких концентрациях и слабее взаимодействует с гидрофобной областью мембран, но сравнению с голотуриногенином А2 (рис. 12, Б). При введении в липосомальные мембраны голотуриногенины уменьшают проницаемость липосомальиых мембран для глюкозы, но менее эффективно, чем холестерин (рис.12, В).
Таким образом, строение боковой цепи агликона влияет на взаимодействие голотуриногенина с липидным бислоем. Голотурины с одинаковым строением углеводной части и отличиями в строении боковой цепи агликона по-разному влияют на ионную проницаемость клеточных мембран (рис. 10). Обнаружено, что меньшую активность проявляет гликозид и его десульфатированный аналог, агликон которых слабее взаимодействует с гидрофобной областью мембран. Калориметрические данные по влиянию тритерпеноидов на физическое состояние мембран коррелируют с меньшей активностью голотурина А и стериноподобным стабилизирующим действием голотуриногенинов на проницаемость мембран.
Влияние сульфатной группы при первом моносахаридиом остатке углеводной цепи голотуринов изучили при действие голотурина А и его десульфатиро ванного производного на термотропный фазовый переход ДПФХ (рис. 13).
Обнаружено, что отсутствие сульфатной группы в молекуле гликозида уменьшает возмущающее действие гликозида на термотропный фазовый переход ДПФХ, но характер действия гликозида сохраняется. Оба гликозида вызывают расщепление пика основного фазового перехода на компоненты. Концентрация гликозида, при которой происходит расщепление пика и резкое изменение относительной энтальпии, соответствует концентрации, при которой наблюдаются структурные перестройки липосомальных мембран, проявляющиеся в изменении оптической плотности суспензии липосом, и связанные, возможно, с солюбилизацией липидных мембран. Различие в изменении относительной энтальпии голотурина А и его десульфатированного производного свидетельствует о более высокой солюбилизирующей активности голотурина А по сравнению с его десульфатированным производным.
Влияние кукумариозидов и их производных на ионную проницаемость мембран и термотропный фазовый переход дипальмитоилфосфотидилходина
Основной фазовый переход ДПФХ в слабощелочной (рН 8,0) и нейтральной среде (рН 7,4) сохраняется до концентрации гликозида 100 мкг/мл. В слабокислой среде (рН 5,6) при этой концентрации гликозида наблюдается резкое уменьшение энтальпии основного фазового перехода ДПФХ и расщепление пика на компоненты. Снижение рН среды до 4,5 приводит к дальнейшему уменьшению энтальпии перехода.
Таким образом, показано, что в зависимости от степени ионизации карбоксильной группы в агликоне каулозида С изменяется локализация и ориентация агликона в мембране и это приводит к изменению гидрофобного взаимодействия гликозида с мембраной и порообразующей активности.
Изучено мембранотрош-гое действие хедерагенииа и двух его гликозидов, отличающихся друг от друга только размером углеводной цепи. Обнаружено, что хедерагенин, имеющий дополнительную гидроксильную группу, слабее взаимодействует с гидрофобной областью липидного бислоя, чем олеаноловая кислота. Хедерагенин незначительно увеличивал фоновую проводимость моноолеиновых БЛМ в слабокислой среде, а его гликозиды проявляют рН-зависимое действие на проницаемость мембран. Гликозид с двумя моиосахаридными остатками в углеводной цепи при С-3 оказывает большее возмущающее действие на структуру липидного бислоя и образует ионные каналы и поры большего размера, чем гликозид с одним моносахаридным остатком в углеводной цепи (рис.26, Д). Размер каналов, формируемых гликозидами хедерагенииа, зависит от концентрации и структуры молекул гликозидов, а также от структуры и количества мембранных стеринов. Отличительной особенностью мембранотропного действия гликозидов хедерагенииа со свободной карбоксильной является рН-зависимость мембранной активности, действие на мембраны без стерина и более высокие, по сравнению с гликозидами голотурий, действующие концентрации. При действии на БЛМ, содержащие стерины, в высоких концентрациях каулозид С вызывает структурный переход бислойных мембран в небислойные структуры, подобно голотуринам. Это обусловлено образованием каулозид-холестеринового комплекса в мембранах. Крутая зависимость проводимости, индуцированной каулозидом С от концентрации гликозида, известная из литературных данных, позволяет предположить, что каулозидная пора состоит из 6-8 субъединиц. Молекула гликозида агликошгой частью погружена в бислой, а углеводная цепь по С-3 находится в водной фазе. Выяснение механизма мембранотропного действия гликозидов хедерагенина позволило нам разработать новый подход к регуляции проницаемости клеточных и модельных мембран с помощью рН-регулируемых сапониновых пор. Изменение проницаемости мембран сапонинами и другими токсинами используется уже давно, но недостатком существующих подходов является то, что после формирования в мембранах пор их работой нельзя было управлять (рис. 27, А).
При использовании каулозида С для формирования пор в мембранах их размером, временем жизни и работой можно управлять, изменяя рН среды в физиологической области (рН 5,0-7,5). Показано, что открыванием и закрыванием каулозидных пор можно управлять с помощью рН среды (рис. 27, Б).При добавлении гликозида в слабокислой среде с одной стороны БЛМ, функционирующие поры практически мгновенно закрываются при изменении рН водной фазы до 7,4 с этой стороны БЛМ. В экспериментах на БЛМ показана обратимость прообразующего действия каулозида С в зависимости от рИ среды. Поры, образованные гликозидом в БЛМ в слабокислой среде, закрываются при изменении рН среды до 7,4 и открываются при повторном сдвиге рН в слабокислую область. Обнаружено, что процесс открывания пор при переходе из нейтральной в кислую среду имеет латентный период, в отличие от процесса закрывания пор, который происходит очень быстро. Выключение пор в нейтральной среде происходит мгновенно, возможно, из-за вытеснения пор, имеющих заряд, из гидрофобной области мембран. Полученные данные являются прямым экспериментальным подтверждением возможности управления работой сапониновых пор в мембранах с помощью рН среды в физиологическом диапазоне изменения рН. Каулозид С предложен в качестве нового биохимического инструмента для регуляции проницаемости клеток с целью введения или выведения из клеток веществ с сохранением жизнеспособности клеток. В работе [148] показано, что с помощью этих пор удается провести нагрузку клеток такими вторичными посредниками как ионы кальция и циклический аденозинмопофосфат. Таким образом, на примере гликозида хедерагенина показана возможность создания простого и удобного инструмента формирования регулируемых пор для научных исследований, биотехнологии и медицины.
Изучено влияние гликозидов женьшеня, цитотоксическая активность которых изучена в работе [56] и структуры которых приведены на рис. 1, на ионную проницаемость эритроцитарных мембран и на термотропный фазовый переход липосомальиых мембран. Обнаружено, что нецитотоксичные или с самой низкой цитотоксической активностью гинзенозиды Rbl,Rb2. Re, Rd, Re, Rf, Rgl, Rg2, Ro, F-l, M7-cd и NG-R2 увеличивают скорость выхода ионов калия в 1,5-5 раз по сравнению со скоростью выхода К1 из интактных клеток. Умеренно цитотоксические соединения протопанаксадиол и его гликозиды Rh2, соединение К, F-2 и Rg3 увеличивают скорость выхода калия в 19, 66, 200, 59 и 24 раз, соответственно (табл. 10).
