Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о липолитических ферментах 9
1.1. Характеристика продуцентов и физико-химические свойства липаз 9
1.2. Особенности структуры и механизма действия эстераз 13
1.3. Значение липолитических ферментов в природе и хозяйственной деятельности человека 21
Глава 2. Современные аспекты иммобилизации липолитических ферментов 25
2.1. Методы иммобилизации липаз 25
2.2. Физико-химические аспекты катализа иммобилизованными ферментами 32
2.3. Применение иммобилизованных липаз в промышленности, медицине, аналитических целях 37
Глава 3. Объекты и методы исследования 40
3.1. Объект исследования 40
3.2. Методы исследования 40
3.2.1. Выделение препарата липазы из микромицета Rhizopus japonicus 1403 40
3.2.2. Очистка и определение молекулярной массы липазы методом гель-хроматографии 41
3.2.3. Ионообменная хроматография на колонке с диэтиламиноэтил-целлюлозой (ДЭАЭ-целлюлозой) 42
3.2.4. Определение содержания белка в препарате методом Лоури 43
3.2.5. Определение содержания белка в иммобилизованных ферментых препаратах модифицированным методом Лоури 44
3.2.6. Спектрофотометрический метод определения каталитической активности липазы 45
3.2.7. Подготовка ионитов АВ-26 и АВ-17-2П к иммобилизации 46
3.2.8. Методика сорбционной иммобилизации липазы 47
3.2.9. Методика ковалентной иммобилизации липазы с помощью глутарового альдегида 48
3.2.10. Подготовка исследуемых образцов к анализу методом ИК-спектрофотометрии (ИКС) 48
3.2.11 Аналитический электрофорез белков в полиакриламидном геле 51
3.2.12. Метод визуализации пространственной структуры белковых молекул на базе программы MolScript 52
3.2.13. Фотоокисление белков в присутствии метиленового голубого 53
3.2.14. Статистическая обработка результатов экспериментов 54
Глава 4. Вьщеление, очистка, физико-химические свойства препарата липазы из Rhizopus j aponicus 1403 55
4.1. Изучение условий выделения и очистки липазы из Rhizopus j aponicus 1403 55
4.2. Физико-химические свойства липазы из Rhizopus j aponicus 1403 64
Глава 5. Исследование особенностей строения активного центра ли пазы Rhizopus japonicus 68
5.1. Идентификация имидазольной группы гистидина в каталитическом центре молекулы липазы Rhizopus japonicus 68
5.2. Воздействие фенилметилсульфонилфторида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы 74
5.3. Воздействие дициклогексилкарбодииимида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы 79
5.4. Исследование роли ионов двухвалентных металлов в функционировании липазы Rhizopus j aponicus 82
Глава 6. Изучение особенностей четвертичной структуры липазы Rhizopus j aponicus 1403 88
6.1. Воздействие додецилсульфоната натрия на состояние четвертичной структуры липазы 88
6.2. Исследование особенностей вторичной структуры субъединиц липазы методом ИК-спектрофотометрии 92
6.3. Модификация липазы бифункциональными реагентами 95
6.4. Визуализация олигомерной структуры липазы Rhizopus j aponicus 1403 методом атомно-силовой микроскопии 96
Глава 7. Ковалентная иммобилизация липазы из Rhizopus japonicus 1403 на анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегидным методом 101
7.1. Исследование условий иммобилизации липазы на некоторых ионо обменных смолах 101
7.2. Некоторые физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободной и иммобилизованной липазой 106
7.3. Исследование технологических характеристик реакции гидролиза триглицеридов липазой, иммобилизованной на анионите АВ-17-2П 114
Глава 8. О молекулярном механизме реакции ферментативного гидролиза триглицеридов 118
Заключение 130
Выводы 134
Список литературы 136
- Значение липолитических ферментов в природе и хозяйственной деятельности человека
- Применение иммобилизованных липаз в промышленности, медицине, аналитических целях
- Очистка и определение молекулярной массы липазы методом гель-хроматографии
- Физико-химические свойства липазы из Rhizopus j aponicus 1403
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы при усовершенствовании многих технологических процессов широко используются гидролитические ферменты микроорганизмов, характеризующиеся более высокой активностью и низкой себестоимостью по сравнению с гидролазами растительного и животного происхождения. Выявление особенностей структуры и функционирования липолитичеких ферментов становится особенно актуальным в связи с их биологической ролью, а также предоставляет новые возможности: для создания катализаторов с целью их дальнейшего эффективного применения в различных отраслях промышленности и в качестве медицинских препаратов.
В настоящее время в лабораториях научно-исследовательских институтов разрабатывается новая прогрессивная технология — катализ с использованием иммобилизованных ферментов, которые имеют ряд преимуществ перед растворимыми катализаторами в связи с более высокой стабильностью по отношению к денатурирующим факторам окружающей среды. Кроме того, подбирая соответствующий носитель и способ связывания, можно значительно уменьшить неблагоприятное воздействие матрицы носителя на структуру белка и повысить тем самым его ценность как биокатализатора.
Возрастающие масштабы использования липаз в биотехнологии вызывают необходимость поиска эффективных продуцентов ферментов данной группы, в качестве которого в настоящей работе предложен микромицет Rhizopus japonicus 1403. Для решения проблем регулирования биологических свойств липазы необходимо детальное исследование физико-химических, кинетико-термодинамических свойств фермента, особенностей его структурной организации, раскрытие молекулярного механизма реакции превращения субстрата.
Выполненная работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуни верситета, входящей в координационный план научно-исследовательских работ РАН.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение молекулярного механизма реакции гидролиза сложноэфирной связи в молекуле триглицеридов липазой Rhizopus japonicus 1403.
В этой связи в работе были поставлены следующие задачи:
? разработка эффективной методики выделения и очистки липазы из микромицета Rhizopus japonicus 1403;
? идентификация функциональных групп каталитического и субстрат-связывающего центров в молекуле липазы;
? исследование особенностей надмолекулярной организации изучаемого фермента методами гель-хроматографии, электрофореза и атомно-силовой микроскопии;
? создание гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной модифицированным глутаральдегидным способом на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анионите АВ-17-2П;
? изучение физико-химических и кинетико-термодинамических аспектов гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой;
? выявление оптимальных технологических режимов функционирования полученного иммобилизованного препарата фермента в реакторах периодического и непрерывного действия;
• описание молекулярного механизма разрыва сложноэфирных связей в
молекуле триглицеридов. Научная новизна.
разработан эффективный метод получения гомогенного препарата липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой степенью очистки;
? впервые четвертичная структура обнаружена у липолитического фермента семейства Mucoraceae, выявлены физико-химические свойства и природа взаимодействия субъединиц;
создан новый гетерогенный биологический катализатор на основе липазы, иммобилизованной на отработанном в сахаро-рафинадном производстве анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегид-ным методом;
•по результатам исследования кинетико-термо динамических и технологических характеристик свободной и иммобилизованной липазы сконструирован реактор непрерывного действия, позволяющий осуществлять гидролиз триглицеридов с высоким выходом;
? изучено строение активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 методами Диксона, химической модификации специфическими реагентами и фотоокислением в присутствии метиленового голубого;
? на основании экспериментальных данных и при использовании программы MolScript описан молекулярный механизм реакции гидролиза сложноэфирной связи в молекуле триглицеридов липазой Rhizopus japonicus 1403
Практическая значимость Получен гомогенный препарат липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой гидролитической активностью. Изучение особенностей надмолекулярной организации липазы позволяет расширить представления о механизмах регуляции функциональных свойств ферментов in vivo. Создан гетерогенный биокатализатор с ковалентно иммобилизованной на отработанном анионите АВ-17-2П липазой, выявлены оптимальные условия его функционирования. Разработанные технологические режимы работы реактора непрерывного действия с полученным гетерогенным катализатором позволяют рекомендовать его для применения в промышленных масштабах. Результаты исследования строения активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 и молекулярного механизма каталитического гидро лиза сложноэфирных связей расширяют и углубляют представления о закономерностях функционировании эстераз семейства Mucoraceae.
Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на IV Международном симпозиуме «Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001); XVIII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, 2001); Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок, экологически безопасные технологии» (Тверь, 2001); Международной научно-практической конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг» (Орел, 2001); Международной научно-практической конференции «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); Межрегион, конференции молодых ученых «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2001); Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002); Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); III Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматогра-фические приборы» (Москва, 2004), конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004), III Съезде биофизиков России (Воро-неж, 2004), 8 Conference of International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Boston, USA, 2004).
Публикации. По теме диссертационной работы имеется 20 публикаций: 9 статей и 11 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Нативная молекула липазы из Rhizopus japonicus 1403 функционирует в виде димера, образованного в результате гидрофобных взаимодействий между двумя субъединицами фермента, находящимися в «открытой» кон-формации.
т
2. Разработан модифицированный метод ковалентной иммобилизации липазы на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анио-ните АВ-17-2П, полученный препарат является эффективным биокатализатором и может быть рекомендован для применения в промышленной технологии.
3. Функционально значимые аминокислотные остатки субстратсвязы-вающего, каталитического центров и их микроокружения для липаз рода Rhizopus являются идентичными и входят в состав консервативных участков первичных структур гидролаз данной группы.
4. Схема молекулярного механизма расщепления сложноэфирных связей в молекуле триглицеридов.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа включает 156 страниц машинописного текста; состоит из Введения, 8 глав, Заключения, Выводов, Списка литературы (177 источников) и Приложения. Иллюстрационный материал включает 36 рисунков, 19 таблиц; в Приложении 9 таблиц.
Значение липолитических ферментов в природе и хозяйственной деятельности человека
Ферментативный катализ в силу своей уникальности (высокой каталитической активности и селективности в отношении превращаемых связей субстрата) обладает широкими перспективами при использовании в промышленной технологии и медицине.
По сравнению с амилазами и протеазами липазы значительно позже начали использоваться в практических целях. В настоящее время открываются новые перспективы применения их в различных сферах народного хозяйства. В этом отношении преимущество имеют липолитические ферменты микробного происхождения. Во-первых, они обладают более высокой активностью, во-вторых, низкой себестоимостью. Разнообразие особенностей биосинтеза липаз микробного происхождения создает широкий выбор этих ферментов по физико-химическим свойствам и субстратной специфичности.
Перспективно использование липаз в пищевой промышленности. Бесконтрольный липолиз может вызвать неприятный привкус молока, а также накопление свободных жирных кислот в маслах, для удаления которых требуется дополнительное центрифугирование. Показано, что липолитические ферменты могут входить в состав композиций, предназначенных для осветления соков и вин, а также для улучшения вкусовых качеств напитков. Липазы используют для переэтерификации пищевых масел (пальмового и оливкового) с целью получения масла какао. С помощью липаз проводят конверсию растительных масел в маргарины (J. Harwood, 1989).
Известно, что липолитические процессы имеют большое значение при производстве сыров (Y. Collins et al., 2003). Характерный вкус итальянского сыра «Моцарелла» обусловлен присутствием жирных кислот с короткой цепью, образующихся в результате гидролиза молочного жира под действием липаз (М. Katz et al., 2003). По данным Balcao et al. (2003) липолитически активные штаммы дрожжей в составе заквасок при производстве ветчины оказывают положительное влияние на формирование вкуса и аромата продукта. Есть основания считать перспективным применение липаз в хлебопечении. Кислая липаза, добавленная в тесто, вызывает образование моноглицеридов, значительно замедляющитх процесс черствения хлеба (A. Monfort et al., 1999; A.Leonetal.,2001).
Значительный интерес липазы представляют в производстве глицерина и жирных кислот (К. Jaeger et al., 1999). Липазы могут использоваться в коммунальном хозяйстве для очистки сточных вод (Е. Vasilevaonkova, D. Galabova, 2003). Во Франции, Великобритании, США выпускается множество моющих средств с добавлением липаз. Применение многих микробных эс-тераз целесообразно в легкой промышленности для обезжиривания отходов шелкомотального производства; в кожевенной промышленности — при выделке кожи (P. Dalev, L. Simeonova, 1992).
Не меньший интерес представляет использование липаз в медицине. Показано, что действие липопротеидлипазы оказывает непосредственное влияние на стенки кровеносных сосудов, снижая величину артериального давления и нивелируя риск заболеваний коронарных сосудов. При дефиците данного фермента может возникнуть липопротеинемия («липемия сепсиса»). Таким образом, управление липолитическои активностью играет ключевую роль в разработке методов лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний (М. Sea et al., 2000). Нарушения процессов депонирования жиров в организме связывают с функционированием холестеролэстеразы и сфинго-миелиназы (Н. Harris et al., 2000). Результаты исследований особенностей функционирования липазы сыворотки крови широко используются в клинике при мониторинге гемодиализа больных с почечной недостаточностью (Т. Shibasaki et al., 1996).
Липаза: печени принимает важное участие в регуляции метаболизма. Данный фермент поддерживает определенный уровень фосфолипидов с ненасыщенными жирными кислотами и производных холестерина в гепатоци-тах. Неактивная форма липазы печени способствует накоплению липопро-теинов и формированию «мостиков» между поверхностью гепатоцитов с ли-попротеинами (P. Connelly, P. Hegele, 1998; P. Connelly, 1999). Липаза, чувствительная к гормонам, играет важную роль в механизме глюкозозависимой секреции инсулина, и, таким образом, в регуляции метаболизма глюкозы (R. Roduit et al., 2001). .
Развитие медицинской энзимологии способствовало более широкому использованию липаз микробного происхождения в качестве лекарственных средств при заместительной терапии, а также в качестве агентов, специфически разрушающих нежелательные продукты обмена веществ в организме больного. Современная фармацевтическая промышленность выпускает следующие препараты животного происхождения: «Панзим форте», «Мезим форте», «Фестал», «Мексаза» и многие другие. Ферментные комплексы, обладающие липолитическои и протеолитическои активностью, оказываются эффективными при лечении заболеваний пищеварительного тракта, обусловленной недостаточной активностью панкреатического сока: при хронических панкреатитах, воспалительных заболеваниях желчного пузыря, хронических гастритах с секреторной недостаточностью, энтеритах, а также при необходимости усиления пищеварительных функций в целом (B.C. Кабанова, 1983). Липазы катализируют не только гидролиз, но и синтез длинноцепочеч-ных ацилглицеридов (М. Arroyo, J. Sinisterra, 1994; A. Yahya et al., 1998; L. Cao et al., 1999). Это свойство находит широкое применение в биотехнологии при производстве детергентов, пищевых добавок, в целлюлозно-бумажной промышленности, для получения витаминов (К. Jaeger, 1998; Т. Maugard, 2000).
Применение иммобилизованных липаз в промышленности, медицине, аналитических целях
После первых исследований в области иммобилизации ферментов стала очевидна возможность их практического применения в качестве катализаторов многоразового использования. Грибные и бактериальные липазы имеют наибольшее значение с точки зрения их применения в промышленной технологии и органической химии.
Как известно, липазы способны катализировать не только гидролиз, но и синтез длинноцепочечных ацилглицеролов. S. Chiou et W. Wu (2004) предложили способ адсорбционной и ковалентной иммобилизации липазы Candida rugosa на носителе углеводной природы хитозане и показали возможность многократного применения полученного препарата для реакции этери-фикации жирных кислот и алифатических спиртов. Липаза Candida antarctica, иммобилизованная на гранулированном силикагеле, может успешно применяться для непрерывного производства этиловых и метиловых эфиров посредством трансэтерификации столового жира (A. Hsu et al., 2002). Синтез разнообразных сложных эфиров в среде n-гептана возможен с высоким выходом при использовании липазы Chromobacterium viscosum, иммобилизованной в порах микроэмульсионного геля.
Преимуществом включения фермента в пространственную сетку гелей является то, что при данном подходе не происходит химической модификации глобул белка, исключается денатурация фермента, обеспечиваются мягкие условия для иммобилизации. Для этих целей используются полиакрила-мидные, полиэтиленгликольметакрилатные, полисахаридные, полиионитные, а также различные неорганические гели (И.В. Березин и др., 1976). Новый метод иммобилизации на желатине липаз из разных источников позволяет осуществлять непрерывный синтез нерастворимых эфиров жирных кислот в среде циклогексана с выходом 90%. Носитель не подвергается механическим повреждениям, стабилен по отношению к микроорганизмам в течение нескольких месяцев (М. Schuleit, P. Luisi, 2001).
Перспективным в настоящее время представляется разработка методов иммобилизации липаз для получения глицерина, этиленгликоля, жирных кислот, спиртов. Т. Watanabe et al. (1995) разработали эффективный технологический режим гидролиза масла периллы в реакторе непрерывного действия липазой Candida rugosa, иммобилизованной на порошке полиэтилена. Полученный препарат рекомендован для использования в промышленности при производстве а-линоленовой кислоты.
Иммобилизованные липолитические ферменты широко применяются в химии олеинов. Ковалентно связанная с различными носителями липаза Candida rugosa используется для гидролиза пальмового масла, продукты которого могут служить альтернативными видами топлива, а также ценными пищевыми добавками (D. de Oliveira et al., 2000; Bhatia et al., 1999; T. Matsumoto et al., 2004). Препарат Novozym 435 успешно используется в течение ряда лет для производства глицерина и жирных кислот.
В последние годы иммобилизованные липолитические ферменты являются незаменимыми при производстве некоторых антибиотиков, в частности, пенициллиновой группы (С. Torres, 2003).
Анализируя вышеизложенное, можно заключить, что поиск новых типов носителей для иммобилизации липаз и методов ковалентного и некова-лентного связывания, изучение физико-химических и кинетико-термодинамических аспектов катализа свободными и иммобилизованными ферментами, разработка оптимальных технологических режимов ферментативного катализа приобретает возрастающую значимость на современном этапе развития химической энзимологии. В связи с тем, что данное направление разработано недостаточно, мы поставили в работе следующие задачи: изучить физико-химические и кинетико-термодинамические характеристики гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой H3Rhizopusjaponicus 1403; выявить оптимальные технологические режимы функционирования полученного иммобилизованного препарата фермента в реакторах периодического и непрерывного действия.
Очистка и определение молекулярной массы липазы методом гель-хроматографии
Гель-хроматографию проводили на колонке, заполненной сефадексом G- 150 (fine), уравновешенной 0,2 моль/л фосфатно-цитратным буфером (рН 6,5). Размеры колонки 1,5 см х 50 см. Исследуемую пробу фермента наносили на колонку в количестве 1 мл. Скорость элюции 12 мл/ч, объем элюирую-щих фракций — 3 мл. О наличии фермента во фракциях судили по величине оптической плотности, которую измеряли на спектрофотометре СФ-46 -при длине волны 280 нм. Активность липазы определяли спектрофотометриче-ски, количество белка в препарате- методом Лоури. При определении кажущейся молекулярной массы липазы пользовались калибровочным графиком, для построения которого через колонку с сефадексом G-150 пропускали следующие белки — маркеры: - а - лактатальбумин - 14,4 кДа; - соевый ингибитор трипсина - 20 кДа; - карбоангидраза - 30 кДа; - овальальбумин - 43 кДа; - сывороточный альбумин — 67 кДа; - фосфорилаза — 96 кДа. Белки-маркеры наносили в количестве 1 мг, элюцию осуществляли по методике, описанной выше. Калибровочный график строили в следующих координатах: по оси ординат - десятичный логарифм молекулярной массы белка-метчика, по оси абсцисс - объем элюата (мл). ДЭАЭ-целлюлоза, благодаря своей функциональной группе — диэтиламиноэтильному остатку [- О - СНг - 0 - N = (Сг Н5 )г], обладает свойствами слабого анионообменника. Подготовка ДЭАЭ - целлюлозы к работе: -Необходимое количество ДЭАЭ-целлюлозы (5-7 г) перемешивали в течение 15 минут в 0,5 моль/л соляной кислоте (500 мл) и оставляли на 1 ч. - ДЭАЭ-целлюлозу отмывали дистиллированной водой до нейтрального значения рН (отмывание удобно проводить, прокачивая воду с помощью насоса); - отмытую ДЭАЭ-целлюлозу смешивали с 0,5 моль/л NaOH (50 мл) и ставили на 1 ч; - целлюлозу отмывали до значения рН = 7,0 и заливали пятикратным объемом воды, откачивая воздух. Колонку (2x15 см) заполняли суспензией подготовленного к работе ио-нообменника, уравновешенного фосфатно-цитратным буфером (рН 6,5). Для формирования столбика ДЭАЭ - целлюлозы всю конструкцию устанавливали строго вертикально, закрывали нижний кран, помещали на дно колонки тонкий слой стекловаты, поверх нее — фильтровальную бумагу, затем наполняли растворителем и при перемешивании постепенно вносили в колонку ионообменника.
Поверх слоя целлюлозы помещали кружок фильтровальной бумаги, диаметр которого соответствовал диаметру колонки. Для нанесения образца избыток элюата из колонки удаляли почти полностью и в один прием осторожно вносили пипеткой 3 мл раствора фермента. После того, как раствор впитывался, поверхность дважды промывали равным объемом элюата. Скорость элюции — 12 мл/ч. Содержание белка во фракциях определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм и по методу Лоури. Данный метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина - Чокальтеу в сочетании с биу-ретовой реакцией на пептидные связи. Метод Лоури является наиболее чувствительным и точным из всех методов количественного определения белка. Реактивы: 1. Раствор № 1 - 2 % раствор Na2C03, приготовленный на 0,1 моль/л растворе натриевой щелочи. 2. Раствор № 2 — 0,5 % раствор C11SO4 5Н20, приготовленный на 1 % растворе цитрата натрия. 3. Рабочий раствор: 1 мл раствора № 2 смешать с 50 мл раствора №1. Раствор готовится в день определения. 4. Реактив Фолина - Чокальтеу. 5. Раствор альбумина, содержащий 0,25 мг белка в 1 мл. Ход определения. Исследуемый раствор, содержащий 10-100 мкг белка, доводили дистиллированной водой до 0,4 мл, соединяли с 2 мл рабочего раствора, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10 мин., добавляли 0,2 мл реактива Фолина, тщательно перемешивали и через 30 мин. измеряли оптическую плотность при 750 нм на КФК-3. Для определения содержания белка в исследуемых образцах строили калибровочный график следующим образом: в 6 пробирок помещали соответственно по 0,04; 0,08; 0,16; 0,24; 0,32; 0,40 мл раствора альбумина и дистиллированной водой доводили до 0,4 мл. Дальнейшую обработку вели так же, как исследуемых образцов. Полученные величины оптической плотности откладывали на оси ординат, а концентрацию белка - на оси абсцисс. По калибровочному графику определяли количество белка в исследуемом объекте
Физико-химические свойства липазы из Rhizopus j aponicus 1403
Ферментативная реакция протекает, как правило, в три стадии: образование фермент-субстратного комплекса, превращение этого комплекса в фермент-продукт и стадию диссоциации продукта. Воздействие температуры на реакцию в целом является результатом влияния на каждую из этих стадий, но особое место занимает реакция образования продукта.
Зависимость каталитической активности липазы Rhizopus japonicus от температуры представлена на рис. 5. Для фермента характерно проявление наиболее высокой каталитической активности в диапазоне температур 30-37 С с максимумом при 37 "С, что подтверждается данными литературы (К.Д. Дав-ранов и др., 1978). Наличие диапазона оптимальных температур реакции гидролиза триглицеридов свидетельствует о том, что скорость распада фермент-субстратного комплекса для липазы, выделенной из Rhizopus japonicus 1403, не изменяется при температурах 30-37 С (ЕЛ Рубан, 1977).
Изменение каталитической активности фермента при воздействии на молекулу последнего различных концентраций ионов водорода объясняется изменением состояния ионизации отдельных компонентов системы, а именно кислых и основных групп фермента, ответственных за осуществление акта катализа. Для большинства лштолитических ферментов, рН-оптимум которых лежит в диапазоне 4,0-7,0, характерно присутствие в активных центрах карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот и имидазольной группы гистидина, ответственных за осуществление кислотно-основного катализа. Именно в интервале значений рН 4,0-7,0 указанные функциональные группы проявляют высокую реакционную способность и способствуют увеличению скорости гидролиза триглицеридов.
Установлено, что максимальное значение скорости гидролиза субстрата проявляется при рН 6,5, при этом ветви кривой не симметричны друг другу. Данный эффект подтверждает факт, что влияние ионов водорода отражается как на протолизе реакционных групп активного центра, так и на структуре каталитического подцентра фермента. Полученные данные согласуются с результатами ряда авторов (К.Д. Давранов, 1989; S. Patkar et al., 1998; S. Herrgard et al, 2000). В условиях насыщения фермента субстратом падение каталитической активности по обе стороны оптимума рН может быть обусловлено понижением насыщения фермента субстратом за счет уменьшения сродства триглицеридов к функциональным группам субстратсвязывающего подцентра, а также влиянием рН на стабильность липазы, которая, по нашим данным, необратимо инактивируется при рН=5,5 и рН=7,0.
К числу факторов, определяющих протекание ферментативных реакций, относится концентрация субстрата. При исследовании зависимости удельной активности липазы от концентрации трибутирина показано (рис. 7), что она не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Кривая V(S) характеризуется сигмоидной формой, что позволяет сделать предположение о наличии четвертичной структуры в молекуле липазы Rhizopus japonicus. Установлено, что оптимальная концентрация трибутирина для липазы Rhizopus japonicus составляет 1,75 10" моль/л. Для характеристики реакции гидролиза трибутирина были определены следующие кинетические параметры: Кт и Vmax., значения которых, определенные методом Лайнуивера-Берка, составили 3,22 10" моль/л и 71,42 мкмоль/мин соответственно. В результате проведенных экспериментов выявлены оптимальные условия функционирования нативной липазы из Rhizopus japonicus 1403. Следующей задачей наших исследований была идентификация функциональных групп аминокислотных остатков, играющих ключевую роль в проявлении каталитических свойств изучаемого фермента. Главной особенностью ферментативной реакции является то, что она протекает в составе активного комплекса, образованного в результате связывания субстрата с активным центром фермента. Активный центр является весьма сложной структурой, которая может составлять существенную часть молекулы фермента. Часто он имеет форму "щели", в которой размещается субстрат и удерживается в ней боковыми группами аминокислот, локализованными в стенках "щели". В других случаях активный центр распространяется на значительную часть молекулы фермента и может включать субстратсвязывающие группы, относящиеся к разным участкам главной цепи (Д. Бейли, Д. Оллис, 1989). В последние годы активный центр ферментов, действующих на полимерные субстраты, рассматривают как центр, состоящий из отдельных участков — «сайтов». Каждый «сайт» связывает мономерный остаток полимерного субстрата. В формировании активного центра ферментов принимают участие отдельные аминокислотные остатки, содержащие разнообразные по реакционной способности функциональные группы (гистидина, лизина, аргинина, триптофана и др.)
