Введение к работе
Актуальность проблемы: Углекислый газ и образующиеся при реакции С02 с водой угольная кислота, бикарбонаты и карбонаты, которые в совокупности именуются углекислотой, присутствуют в разных соотношениях практически во всех природных водных системах. Все биологические жидкости, включая цитоплазму живых клеток и внеклеточные среды, являются бикарбонатными водными системами. Углекислота, образующаяся в организме при окислении органических соединений, играет важную роль в регуляции разнообразных биологических процессов. Так, при дефиците в организме углекислоты, подавляется дыхание как на уровне целого организма [Haldane J., 1927 and Henderson Y., 1938; Агаджанян H.A. и др., 1995], так и на клеточном уровне [Bicz W., 1960; Palet A. et al., 1991]. Углекислота влияет на активность многих ферментов, экспрессию генов, систему кровообращения, иммунные реакции [Коган А.Х. и др., 2006]. Биологические эффекты углекислоты столь многообразны, что представителей семейства углекислоты можно считать универсальными регуляторами метаболизма.
Механизмы действия углекислоты на клеточном и молекулярном уровнях изучены в настоящее время недостаточно. Углекислота играет важную роль в поддержании кислотно-щелочного баланса в биологических системах, но механизм ее действия не сводится только к этому фактору. Лишь в последнее время стали появляться работы, свидетельствующие о существенном влиянии углекислоты, в частности, бикарбоната на процессы с участием активных форм кислорода (АФК). Коганом А.Х. с соавт. [1995] было обнаружено, что углекислота служит универсальным регулятором свободнорадикального гомеостаза клеток и тканей у живых организмов. Она влияет на активность супероксиддисмутаз, ксантиноксидазы и других ферментов, участвующих в процессах обмена АФК [Fridovich I. et al., 1976, 2004], на неферментативные окислительные процессы, протекающие в водных системах in vitro и in vivo [Medinas D.B. et al., 2007]. Влияние представителей семейства углекислоты на свободнорадикальные процессы обусловлено тем, что они реагируют с АФК и превращаются в относительно долгоживущие и селективно действующие на свои мишени карбонатные радикалы и пероксикарбонаты [Augusto О. et al., 2002]. Появляется все больше доказательств того, что как АФК, так и свободнорадикальные реакции с их участием служат универсальными регуляторами процессов жизнедеятельности на разных уровнях организации живых систем, а патогенное действие АФК связано с нарушениями регуляции их обмена [Ramasarma Т., 1990; Thannickal V.J. and Fanburg B.L., 2000; Droge W., 2002; Voeikov V.L., 2001, 2007]. Поэтому изучение модулирующей роли углекислоты в действии АФК весьма актуально.
Каждая форма углекислоты имеет свои физико-химические свойства, и одним из важных факторов, обеспечивающих многообразие биологических эффектов, служит изменение их соотношения за счет изменения рН водной среды. Однако вода может и непосредственно участвовать в реализации модулирующего действия углекислоты на процессы с участием АФК. В настоящее время появились как экспериментальные [Pollack G., 2003-2010], так и теоретические [Del Giudice Е. and Preparata G., 1995] обоснования возможности расщепления воды на радикалы в мягких условиях, что должно сопровождаться развитием в ней окислительно-восстановительных процессов. Действительно, при действии на воду факторов весьма низкой интенсивности (звук, механическое перемешивание воды, замораживание-оттаивание, воздействие низкочастотными электромагнитными полями) вода служит источником АФК [Домрачев и др., 1992; Воейков В.Л. и др. 1996; Ikeda S. et al., 1999; Брусков В.И. и др. 2001; Wentworth P., Jr. et al., 2001; BelovolovaL. V. et al., 2009]. Учитывая чрезвычайно важную роль, которую играет углекислота как в биологических, так и в других природных водных системах, изучение реакций с участием АФК в водных растворах бикарбонатов может открыть дополнительные возможности для понимания механизмов влияния углекислоты на широкий спектр биологических процессов, что позволит эффективно управлять ими.
Цель данной работы заключалась в исследовании свойств и динамики свободно-радикальных реакций, непрерывно протекающих в водных растворах бикарбонатов, а также влияния разных физико-химических факторов на эти реакции.
Основными задачами исследования являлись:
Выявление присутствия супероксидных радикалов в растворах бикарбонатов с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием спинового зонда тайрона (4,5-дигидроксибензол-1,3-дисульфокислоты) и изучение зависимости сигнала ЭПР от концентрации бикарбонатов, рН, влияния физических (освещение) и химических факторов.
Изучение продукции АФК хемилюминесцентным методом в бикарбонатных растворах в ответ на внесение в них солей двухвалентного железа в присутствии и в отсутствие люминесцентного зонда люминола (ЛМ).
Исследование хемилюминесцентным методом с использованием АФК-зондов ЛМ и люцигеїшна (ЛЦ) продукции АФК в бикарбонатных и других буферных водных растворах, активировашшх внесением в них перекиси водорода в низких концентрациях.
Изучение влияния различных факторов (температуры, рН и др.), про- и антиоксидантов и слабых воздействий (космо-физические факторы, гидратированные фуллерены в малых и сверхмалых концентрациях) на параметры сопровождающихся
хемилюминесцсіщией (XJI) свободнорадикальных процессов в бнкарбоиатных водных растворах.
Основные положения, выносимые на защиту:
В водных растворах бикарбонатов спонтанно происходит образование супероксидного радикала, стационарный уровень которого возрастает с увеличением концентрации бикарбоната от 5 до 100 мМ. Интенсивность сигнала тайрона (ЭПР-зонда на супероксидный радикал) возрастает при освещении раствора белым и синим (Я-=455 нм) светом и максимальна при рН около 9,0. Сигнал отсутствует в дистиллированной воде и в растворах Ва(ОН)2 в этом диапазоне рН, что свидетельствует о специфической роли бикарбоната в продукции супероксидного радикала в воде.
При внесении в водные растворы бикарбонатов солей Fe(II) или K3[Fe(CN)6] в микромолярных концентрациях регистрируется вспышка ХЛ, интенсивность которой возрастает в присутствии люминесцентного зонда на АФК - ЛМ. Интенсивность ХЛ максимальна при значениях рН водных растворов 8,8-9,0. Интенсивность ХЛ снижается в присутствии тайрона — ловушки супероксидных радикалов и при добавлении каталазы, что свидетельствует о продукции супероксидного радикала и перекиси водорода в водных растворах бикарбонатов.
При внесении в водные растворы бикарбонатов Н202 в субмиллимолярных концентрациях в присутствии ЛМ они становятся длительными источниками ХЛ, которая не затухает в герметично закрытых и изолированных от света сосудах в течение многих месяцев. Интенсивность ХЛ возрастает при внесении в реакционные смеси FeS04 в микромолярных концентрациях или пероксидазы и подавляется в присутствии каталазы и тайрона, что свидетельствует об участии Н2О2 и супероксидного радикала в процессах, сопровождающихся ХЛ. В присутствии ЛЦ интенсивность ХЛ ниже, чем в присутствии ЛМ, и она затухает быстрее, но ее интенсивность вновь возрастает при повторном внесении ЛЦ в «затухший» раствор.
Гидратированные фуллерены (HyFn) в концентрациях выше 10 нМ снижают интенсивность вспышки ХЛ, индуцированной внесением Fe(II) в водные растворы бикарбонатов, а в концентрациях ниже 1 нМ усиливают ХЛ. В водных растворах бикарбонатов, активированных перекисью водорода, HyFn в диапазоне концентраций 10"11 - 10'20 М повышали интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ. При этом зависимость эффекта от дозы HyFn имеет нелинейный полимодальный характер с максимумами в области сверхмалых доз (10"16 - 10'15 М) и "мнимых" концентраций (<10'19 М).
Предложена гипотеза, позволяющая объяснить большинство полученных результатов с учетом особой роли водной среды в осуществлении незатухающих
свободнорадикальных реакций в растворах бикарбонатов. Вода рассматривается, как двухфазная система, в которой одна из фаз может служить донором электронов.
Научная новизна исследования:
Впервые обнаружено спонтанное образование супероксидного радикала в водных растворах бикарбонатов, зависящее от концентрации бикарбоната и усиливающееся при освещении.
Впервые обнаружено, что при внесении в водные растворы бикарбонатов солей двухвалентного железа развивается вспышка ХЛ, интенсивность которой возрастает в присутствии ЛМ. Интенсивность ХЛ максимальна в районе рН 8,8-9,0, что совпадает с максимумом сигнала ЭПР для водных растворов бикарбонатов.
Впервые обнаружено, что в водных растворах бикарбонатов, активированных перекисью водорода, развивается ЛМ-зависимая ХЛ, которая не затухает в герметично закрытых и изолированных от света сосудах в течение многих месяцев.
Впервые установлено, что гидратированные фуллерены в сверхмалых и «мнимых» концентрациях, повышают интенсивность устойчивой ЛМ-зависимой ХЛ водных растворов бикарбонатов, активированных перекисью водорода.
Впервые показано, что ЛМ в микромолярных концентрациях может выступать в роли усилителя ХЛ в течение чрезвычайно длительного времени (месяцы и годы), что свидетельствует о существовании механизма усиления им интенсивности излучения, сопровождающего свободнорадикальные реакции, который отличается от общепринятого.
Теоретическая и практическая значимость исследования: Теоретическая значимость работы определяется тем, что она вносит определенный вклад в понимание механизмов участия углекислоты в биологических и других природных процессах, что даст возможность целенаправленно влиять на них.
Поскольку активированные перекисью водорода водные растворы бикарбонатов являются стабильными источниками ХЛ, не затухающей длительное время, и обладают чувствительностью к действию низкоинтенсивных физических и химических факторов, появляется возможность использовать их в качестве тест-систем для регистрации физических полей и исследования свойств препаратов, представляющих собой растворы биологически активных веществ в сверхмалых дозах.
Апробация работы: Материалы диссертации доложены на IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (2008 г., ИБХФ РАН, Москва), Международном научном конгрессе: Наука. Информация. Сознание (2008 г.), XIII Международном Научном Конгрессе по Электрофотонике (2009 г.), VIII International Crimean Conference (2009, Sudak, Crimea, Ukraine), X Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (ОМИП-2009,
МЭИ, г. Москва), The 26-th Progress In Electromagnetics Research Symposium (PIERS) (2009, Moscow), V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (2009 г., Санкт-Петербург, СПб ГУ), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (2010 г., ИБХФ РАН, Москва).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в научных журналах и 12 тезисов докладов на международных конференциях.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 109 страницах печатного текста, содержит 2 схемы и 35 рисунков. Состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», « Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Литература». Библиографический список состоит из 126 ссылок, в том числе 31 источников на русском языке.
