Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Свойства микотоксинов и методы их определения 13
1.1 Микотоксины и их свойства 13
1.1.1 Афлатоксины 14
1.1.2 Охратоксин А 15
1.1.3 Зеараленон 15
1.1.4 Патулин 16
1.2 Методы определения МИКОТОКСИНОВ 18
1.2.1 Хроматографические методы определения микотоксинов 18
1.2.2 Иммунохимические методы определения МИКОТОКСИНОВ 26
1.2.3 БИОСЄНСОРЬІ ДЛЯ определения МИКОТОКСИНОВ 28
1.2.3.1 Ферментные сенсоры 28
1.2.3.2 Иммуносенсоры для определения МИКОТОКСИНОВ 32
1.2.3.3 Аптасенсоры для определения микотоксинов 36
1.2.4. Свойства некоторых ферментов и биосенсоры на их основе 38
1.2.4.1. Холинэстераза и биосенсоры на ее основе 38
1.2.4.2 L-цистеиндесуфгидраза и ее использование в биосенсорах 42
1.2.4.3. Щелочная фосфатаза и биосенсоры на ее основе 43
1.2.4.4 Тирозиназа и биосенсоры на ее основе 46
Глава 2 Нанотрубки как модифицирующий материал поверхности электродов 51
2.1. Свойства углеродных нанотрубок 51
2.2. Функционализация углеродных нанотрубок 52
2.3. Ферментные электроды на основе углеродных нанотрубок 55
Глава 3. Постановка задачи, аппаратура, объекты исследования и условия эксперимента 58
3.1. Постановка задачи 58
3.2 Аппаратура и объекты исследования 60
3.3. Реактивы и приготовление растворов 61
3.4. Получение гомогенатов из растительных материалов 63
3.4.1 Получение гомогената из зерновой культуры 63
3.4.2 Получение гомогената из грибов и бананов з
3.5. Подготовка углеродных нанотрубок для модификации электродов 64
3.6. Изготовление амперометрических биосенсоров на основеиммобилизованных ферментов 65
3.7. Обработка экспериментальных данных 67
3.7.1. Расчет кинетических параметров ферментативных реакций 67
3.7.2. Определение констант связывания иммунного комплекса антиген-антитело 69
3.7.3. Определение процента перекрестного реагирования 70
Глава 4. Аналитические возможности амперометрических биосенсоров в определении некоторых микотоксинов 71
4.1. Аналитические возможности холинэстеразного биосенсора в определении микотоксинов 71
4.1.1. Природа формирования аналитического сигнала холинэстеразного биосенсора 71
4.1.2. Изучение влияния афлатоксина В1, зеараленона и охратоксина А на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы 72
4.1.3. Холинэстеразные биосенсоры на основе модифицированных углеродными нанотрубками электродов 75
4.2. Оценка возможности использования цистеиндесульфгидразы как ферментного препарата в биосенсорах для определении микотоксинов 83
4.2.1. Природа формирования аналитического сигнала 84
4.2.2. Влияние афлатоксина В1, охратоксина А и зеараленона на каталитическую активность иммобилизованной цистеиндесульфгидразы 85
4.2.2. Влияние микотоксинов на модифицированные МУНТ цистеиндесульфгидразные сенсоры 88
4.3. Оценка аналитических возможностей биосенсоров на основе иммобилизованной щелочной фосфатазы в определении микотоксинов 91
4.3.1. Природа формирования аналитического сигнала 91
4.3.2. Влияние патулина, афлатоксина В1, зеараленона и охратоксина А на иммобилизованную щелочную фосфатазу 93
4.3.3 Влияние МУНТ на аналитические характеристики биосенсора на основе щелочной фосфатазы 96
4.4. Биосенсоры на основе тирозиназы 101
4.4.1. Природа формирования аналитического сигнала тирозиназного биосенсора 101
4.4.2. Изучение влияния зеараленона на каталитическую активность иммобилизованной тирозиназы 104
4.4.2.1. Действие зеараленона на иммобилизованную тирозиназу 104
4.4.2.2 Модификация электродов композитом - МУНТ - хитозан: влияние на аналитические возможности 104
4.4.2.3. Модификация электродов композитом - ОУНТ - хитозан: влияние на аналитические возможности 105
4.5 Кинетические параметры реакций ферментативного превращения субстратов в присутствии микотоксинов 107
4.6. Разработка иммуноферментного сенсора для определения афлатоксина В1 111
4.6.1. Аналитические возможности иммуноферментного сенсора 112
4.6.2 Аналитические возможности иммуноферментного сенсора, модифицированного углеродными нанотрубками для определения афлатоксина В1 115
Глава 5 Определение микотоксинов в пищевых продуктах 116
5.1. Определение АФВ1 и зеараленона в зерновых культурах 117
5.2. Определение патулина в яблоках 121
Заключение 122
Выводы 126
Литература 128
- Методы определения МИКОТОКСИНОВ
- Функционализация углеродных нанотрубок
- Получение гомогената из грибов и бананов
- Холинэстеразные биосенсоры на основе модифицированных углеродными нанотрубками электродов
Введение к работе
Актуальность темы. Микотоксины в настоящее время составляют одну из наиболее опасных групп токсичных соединений, представляющих угрозу здоровью населения. Поскольку эти соединения могут находиться во многих продуктах питания, поэтому вполне обоснован интерес исследователей к разработке современных способов их определения. Важность их контроля обусловлена высоким уровнем загрязнения, обнаружением все новых микотоксинов, расширением групп продуктов питания и кормов, загрязненных микотоксинами.
В последнее время достаточно активно разрабатываются различные биохимические, в том числе, иммунохимические методы определения микотоксинов. Такие методы анализа являются удобным инструментом для первичного скрининга больших партий продукции, благодаря своей простоте, экспрессности и относительно невысокой стоимости. Среди них следует отметить работы по использованию различных биосенсоров для решения данной аналитической задачи. Однако примеры работ по применению биосенсоров для определения микотоксинов пока немногочисленны.
В настоящее время значительное внимание уделяется разработке сенсорных устройств, которые позволяют проводить экспрессное определение токсичных соединений в полевых условиях и не требуют высококвалифицированного персонала. Особенно это актуально для Республики Вьетнам, жаркий и влажный климат в которой способствует развитию плесневых грибов, которые являются источником микотоксинов.
Цель исследования заключалась в разработке новых амперометрических биосенсоров на основе иммобилизованных ферментов, относящихся к классам гидролаз, лиаз, оксидоредуктаз и модифицированных многослойными и однослойными углеродными нанотрубками планарных электродов для высокочувствительного определения некоторых микотоксинов, оценка и сопоставление их аналитических возможностей, а также использование полученных результатов для контроля содержания микотоксинов в пищевых продуктах.
Для решения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
> найти наилучшие условия модификации поверхности электродов углеродными
нанотрубками (УНТ) в сочетании со способами иммобилизации ферментов;
> выявить основные факторы, оказывающие влияние на протекание ферментативных и
электрохимических реакций, выбрать условия функционирования разрабатываемых
биосенсоров, найти условия получения максимального аналитического сигнала;
^ определить кинетические параметры ферментативной реакции с участием
рассматриваемых ферментов в присутствии их эффекторов;
^ сопоставить аналитические возможности разработанных биосенсоров на основе
электродов модифицированных и немодифицированных УНТ с целью выбора условий и рекомендаций по наиболее оптимальному определению микотоксинов;
^ разработать иммуноферментный сенсор для селективного определения отдельных
микотоксинов, выявив для этого возможности использования фермента из гомогенатов растительных тканей (тирозиназы) в качестве метки;
> использовать полученные результаты для разработки способов (методик)
определения микотоксинов амперометрическими биосенсорами в пищевых продуктах.
Научная новизна работы. Предложены новые варианты амперометрических биосенсоров на основе модифицированных многослойными и однослойными углеродными нанотрубками планарных платиновых электродов и иммобилизованных ферментов (холинэстеразы, щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы, тирозиназы) для определения микотоксинов. Найдены условия модификации поверхности планарных электродов УНТ, обеспечивающие получение максимального аналитического сигнала в присутствии определяемых микотоксинов. Предложены наилучшие сочетания ферментативной и электрохимической реакций для наиболее чувствительного определения отдельных микотоксинов.
Впервые установлено, что афлатоксин В1 (АФВ1), охратоксин А (ОТА), зеараленон (ЗЕА) и патулин проявляют свойства ингибиторов щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы, а ОТА, ЗЕА и патулин являются ингибиторами
холинэстреразы. Выявлено активирующее действие ОТА на L-цистеиндесульфгидразу в определенном интервале концентраций.
В каждом конкретном случае на основании кинетических параметров (кажущейся константы Михаэлиса, максимальной скорости реакции) установлен тип ингибирования.
Разработан иммуноферментный сенсор для определения АФВ1, основанный на совместной иммобилизации антител против афлатоксина В1 и гомогената из грибов, как источника тирозиназы и использовании иммобилизованной тирозиназы для оценки степени протекания биоспецифических взаимодействий. Тирозиназа использовалась в таком качестве впервые. Оценены значения констант связывания образующихся иммунных комплексов антиген (АФВ1) - антитело.
Использование гомогенатов растительных тканей, как источника ферментных препаратов позволило создать модели новых биосенсоров для определения микотоксинов.
Практическая значимость. Предложены простые и удобные способы модификации поверхности электродов УНТ в сочетании с иммобилизацией ферментных препаратов, позволяющие получить модели биосенсоров с улучшенными аналитическими характеристиками. Модификация поверхности электродов обеспечила практически во всех случаях более высокую чувствительность определений микотоксинов.
Разработаны способы определения микотоксинов с помощью предложенных биосенсоров на основе иммобилизованных холинэстеразы, щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы. Предложены методики определения микотоксинов в пищевых продуктах (соках, орехах), крупах, зерновых культурах и фуражном зерне, кормах для животных с погрешностью определения Sr не больше 0.076 на уровне и ниже ПДК.
Разработанный иммуноферментный сенсор позволяет селективно определять АФВ1 в присутствии других микотоксинов. Методики определения микотоксинов характеризуются высокой чувствительностью, экспрессностью, воспроизводимостью аналитического сигнала, доступностью, позволяют работать с малыми объемами исследуемых растворов и реагентов и могут быть использованы для скрининга микотоксинов в пищевых продуктах.
Применение в качестве ферментных препаратов гомогенатов из растительных тканей делает процесс получения биосенсоров недорогим и доступным широкому кругу потребителей.
Сделаны практические рекомендации по использованию разработанных биосенсоров для контроля качества пищевых продуктов.
На защиту выносятся:
Лабораторные модели разработанных амперометрических биосенсоров на основе модифицированных УНТ электродов и иммобилизованных ферментов (холинэстеразы, щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы) и способы получения модифицированных УНТ электродов как основы соответствующих биосенсоров.
Результаты изучения действия микотоксинов (АФВ1, ОТА, ЗЕА и патулина) на каталитическую активность холинэстеразы, щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы в составе биосенсоров.
Аналитические возможности разработанных биосенсоров для определения микотоксинов: совокупность факторов влияющих на величину аналитического сигнала, аналитические и метрологические характеристики.
Результаты изучения кинетики ферментативных реакций в присутствии микотоксинов.
Новые способы (методики) определения микотоксинов с помощью разработанных биосенсоров, включая иммуноферментный сенсор с тирозиназой в качестве метки, на фоне сложных органических матриц.
Степень достоверности и апробация работы
Представленные в работе выводы и заключения получены в результате анализа большого объема экспериментального материала с применением современных физико-химических методов исследования и определения на сертифицированном оборудовании. Регистрируемые параметры являются воспроизводимыми, а результаты определения, полученные с применением разных биосенсоров согласуются между собой и с литературными сведениями. Наличие
модифицирующих покрытий и морфология рабочей поверхности биосенсоров охарактеризованы данными электронной сканирующей микроскопии.
Результаты исследований были доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и изложены в соответствующих материалах: III Всероссийского симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» с международным участием (Краснодар, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), II Международной научно-практической конференции "Современные проблемы безопасности жизнедеятеьности: теория и практика" (Казань, 2012), XI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета " Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2012), VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа "ЭМА - 2012" (Уфа-Абзаково, 2012), 11 Международной конференции по холинэстеразам (Казань, Россия, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (Казань, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев - 2013 » (Санкт-Петербург, 2013), 2 Съезда аналитиков России (Москва, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи (в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК) и 8 тезисов докладов.
Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты получены лично автором. Автор также принимал участие в обработке, обсуждении и обобщении полученных результатов, оценке кинетических параметров, интерпретации и систематизации результатов эксперимента.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 148 стр. машинописного текста, содержит 29 таблиц и 15 рисунков. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 166 ссылок.
Методы определения МИКОТОКСИНОВ
Степень достоверности и апробация работы: Представленные в работе выводы и заключения получены в результате анализа большого объема экспериментального материала с применением современных физико-химических методов исследования и определения на сертифицированном оборудовании. Регистрируемые параметры являются воспроизводимыми, а результаты определения, полученные с применением разных биосенсоров согласуются между собой и с литературными сведениями. Наличие модифицирующих покрытий и морфология рабочей поверхности биосенсоров подтверждены данными ЭСМ.
Результаты исследований были доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и изложены в соответствующих материалах: III Всероссийского симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» с международным участием (Краснодар, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), II Международной научно-практической конференции "Современные проблемы безопасности жизнедеятеьности: теория и практика" (Казань, 2012), XI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2012), VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа "ЭМА -2012" (Уфа-Абзаково, 2012), 11 Международной конференции по холинэстеразам (Казань, Россия, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (Казань, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев - 2013» (Санкт-Петербург, 2013), 2 Съезд аналитиков России (Москва, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи (в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК) и 8 тезисов докладов.
Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, представленные в диссертации получены лично автором. Автор также принимал участие в обработке и обсуждении полученых результатов, оценке кинетических параметров, интерпретации и систематизации результатов эксперимента.
Работа выполнялась в соответствии с планами научно-исследовательских работ Казанского (Приволжского) федерального университета по теме «Развитие теоретических и прикладных основ методов определения малых количеств биологически активных веществ» (№ 0120107141), при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 13-03-01101-а) и регионального гранта № 12-03-97031-р-Поволжье_ а).
Структура и объем работы: Диссертация изложена на 148 стр. машинописного текста, содержит 29 таблиц и 15 рисунков. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 166 ссылок.
Во введении отмечены актуальность и необходимость проводимых исследований, задачи и цель работы, сформулированы научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.
В первых двух главах представлен обзор литературы, посвященный, свойствам микотоксинов и методам их определения (глава 1), а также свойствам и применению углеродных нанотрубок для модификации электродов (глава 2).
В третьей главе обоснована поставка задачи, описаны используемые приборы и реактивы, основные условия проведения эксперимента, приготовление растворов, способы расчетов кинетических и иммунологических характеристик. Четвертая глава посвящена вопросам разработки новых амперометрических биосенсоров, включая биосенсоры на основе модифицированных УНТ электродов. Уделено внимание сопоставлению аналитических характеристик разработанных биосенсоров. Представлены результаты разработки иммуноферментного сенсора для определения АФВ1 с использованием тирозиназы в качестве метки.
В пятой главе представлены результаты практической реализации полученных результатов: предложены методики определения микотоксинов в пищевых продуктах, кормах для животных. Апробация предложенных методик проведена на конкретных объектах разного происхождения (Россия, Вьетнам).
В заключении обобщены полученные результаты и сделаны рекомендации по их практическому использованию. Обсуждаются некоторые проблемные вопросы разработки и применения амперометрических биосенсоров при определении токсикантов в пищевых продуктах.
Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю доктору химических наук, профессору Медянцевой Э.П., научному консультанту академику РАЕН и МАНВШ, доктору химических наук, профессору Будникову Г.К.
Функционализация углеродных нанотрубок
УНТ стали предметом интенсивного исследования, благодаря использованию в качестве модификаторов электродов для передачи электрических сигналов или датчиков при определении концентраций химических или биологических материалов. Они демонстрируют уникальные электронные и механические свойства, а также химическую устойчивость, т.е. электропроводность, высокую механическую жесткость, небольшой вес, электронно - спиновый резонанс, электрохимическое действие, пьезосопротивление, контактное сопротивление, теплопроводность, люминесценцию, оптико-механический привод и возможность функционализации УНТ. УНТ способны снизить ПрО, повысить чувствительность, уменьшить перенапряжение, противостоять загрязнению поверхности [97]. Свойства УНТ сильно зависят от структуры, метода синтеза, модификации поверхности электрода и ориентации УНТ. Стабильность электрода зависит от подготовки, структуры и предварительной обработки электрода. В результате, существует несколько направлений в электрохимии, связанных с изготовлением различных архитектур электродов. К таким архитектурам относятся литье пленки из УНТ и ее полимерных композитов, пасты из УНТ и ее полимерных композитов, индивидуальные УНТ и массивы УНТ [98].
Структура нанотрубокК настоящему времени синтезировано большое количество типов УНТ [99]. Наиболее распространенными являются ОУНТ, состоящие из одной плоской атомной сетки графита (графена), бесшовно свернутой в цилиндрическую трубку, и МУНТ, включающие от 2 до 50 коаксиально вложенных графеновых цилиндров или конусов, расстояние между которыми составляет -0.34 нм. На концах закрытых УНТ находятся «шапочки» конической или полусферической формы, которые в отличие от боковых поверхностей содержат не только шести-, но и пятичленные углеродные циклы. Как правило, в МУНТ больше дефектов, чем в однослойных. Дефекты графеновых слоев, судя по экспериментальным и расчетным данным, могут существенно влиять на электронные, механические и химические свойства нанотрубок [100].
Адсорбционные свойства нанотрубок. Одной из замечательных особенностей УНТ являются их уникальные сорбционные характеристики. Поскольку УНТ — двумерные структуры, вся их масса заключена в графеновом слое. Это определяет аномально высокую удельную поверхность нанотрубок (максимальное теоретически возможное значение 1300 м .г"1 для одной стороны графенового листа) и обусловливает особенности их электрохимических и сорбционных свойств [99].
Адсорбционные свойства УНТ зависят от трех факторов. Во-первых, от количества адсорбционных мест. Из-за сильных Ван-Дер-Ваальсовых взаимодействий нанотрубки объединяются в жгуты. Однако следует учитывать, что не все пространство жгутов равнодоступно молекулам, поскольку существуют предпочтительные места их локализации. Во-вторых, открытые концы УНТ могут влиять на адсорбционную емкость образца. Установлено, что закрытые нанотрубки, концы которых заблокированы функциональными группами, вносят меньший вклад в общую адсорбцию, чем открытые. Поэтому для улучшения сорбционных характеристик необходимо обрабатывать УНТ с целью открыть их концы. В-третьих, недостаточная чистота образцов наноматериалов может ограничить места адсорбции.
Функционализация углеродных нанотрубок Функциализация играет важную роль при получении композитов, поскольку обеспечивает более сильное взаимодействие наполнителя с матрицей и таким образом улучшает механические свойства материала [96]. Различают два вида функциализации - с присоединением функциональных групп либо к открытым кончикам трубки, либо к ее боковым поверхностям. Понятно, что к открытым кончикам, где имеются свободные связи, или к «шапочкам» трубок присоединение происходит легче. Зато к боковой поверхности присоединяется намного больше групп.
По прочности связи процессы присоединения к УНТ делят на две группы: с образованием прочных ковалентных связей и без образования таких связей (за счет гидрофобного взаимодействия, образования водородных связей). Ковалентное связывание происходит при химических и электрохимических реакциях. Используя УНТ как катод или анод электрохимической ячейки, можно провести восстановление или окисление молекул на поверхности трубки и обеспечить ковалентную связь образовавшихся радикалов с поверхностью.
Основными видами химической ковалентной функциализации являются реакции окисления, фторирования и амидирования, хотя существуют и другие.
Реакции кислотных функциональных групп. Разработанные методы химической модификации и функционализации УНТ открыли этим материалам дорогу в биологию и медицину. Наиболее распространенный метод модификации - обработка кислотами. Однако, хотя использование сильных окислителей эффективно, оно вводит в УНТ дефекты, что нежелательно, поскольку может привести к ухудшению электрических и механических свойств.
Нефункционализированные УНТ обладают сильными гидрофобными свойствами и плохо смешиваются с водой. УНТ, очищенные кислотами, имеют много дефектов и содержат гидрофильные группы, такие как -ОН и -СООН, которые позволяют улучшить растворимость УНТ в воде.
ХЗ является биоматериалом, используемым как гидрофильный биополимер. Контролируемое сочетание УНТ с биосовместимым ХЗ позволяет создавать новые наноматериалы с комбинированными свойствами. ХЗ имеет три вида функциональных групп: аминокислоты, первичные и вторичные гидроксильные группы в участке глюкозамина, а функционализированные УНТ имеют в своем составе карбоксильные и гидроксильные группы. Совместимость и прочное взаимодействие между наполнителями МУНТ и матрицей значительно усиливают дисперсию, а также поверхностное сцепление, что значительно улучшает механические свойства матрицы [101].
В работе [102] разработан метод нековалентного модифицирования УНТ с ХЗ, не нарушающий исходную поверхность нанотрубок. МУНТ диспергировали в растворе ХЗ в уксусной кислоте (рН = 2) ультразкуковой обработкой в течение 10 мин., затем в течение часа размешивали. При этом макромолекулы ХЗ адсорбировались на поверхности УНТ и действовали как полимерное катионное ПАВ, способное устойчиво диспергировать УНТ в кислых водных растворах. В полученный раствор по каплям добавляли разбавленный аммиачный раствор. С увеличением рН ионизированный ХЗ деионизируется и становиться нерастворимым в водных средах, образуя покрытие на поверхности УНТ. Смесь нагревали до 60С и вводили глутаральдегид для образования поперечных связей («сшивания») ХЗ, осажденного на поверхности. Если поверхность исходных нанотрубок гладкая, то в результате декорирования на ней образуются выпуклости ХЗ. Благодаря сочетанию уникальных свойств УНТ и биосовместимого ХЗ, приведшему к огромному увеличению механической прочности композитных покрытий, такие декорированные УНТ могут иметь широкое применение в химии, биологии и медицине как биосенсоры и поставщики генов, а также лекарственных средств в организм.
Получение гомогената из грибов и бананов
На вольтамперограммах электроокисления раствора цистеина в отсутствие цистеиндесульфгидразного биосенсора наблюдается пик при потенциале 0.7 В (рисунок 6, кривая 3). Пик имеет хорошо выраженную форму, что указывает на влияние процессов адсорбции на электрохимический процесс. Коэффициент Семерано (Algl/AlgV), где V - скорость изменения потенциала, составляет величину 0.79, что подтверждает адсорбционную природу наблюдаемого сигнала. В отсутствие цистеиндесульфгидразного биосенсора наблюдается наибольшее значение тока, поскольку в этом случае все молекулы цистеина могут участвовать в соответствующей электрохимической реакции.
В присутствии же цистеиндесульфгидразного биосенсора ток окисления цистеина уменьшается по сравнению со значением тока окисления цистеина в отсутствие иммобилизованного фермента (см. рисунок 6, кривая 2). Это связано тем, что часть субстрата вступает в реакцию ферментативного превращения и распадается на аммиак, сероводород и пируват-ион. Оставшаяся же часть не вступившего в ферментативную реакцию цистеина подвергается электрохимическому окислению.
Афлатоксин В1. При добавлении к раствору цистеина АФВ1 наблюдается пик, ток которого больше по величине тока окисления цистеина в присутствии иммобилизованного фермента, но меньше тока окисления цистеина в отсутствие фермента. Это указывает на ингибирующее действие АФВ1 на L-ЦДГ. Линейная зависимость между током и концентрацией АФВ1 наблюдается в области концентраций от 1x10" до 1x10" моль/л. В этих условиях с„ составляет 8x10"9 моль/л. Наибольшая степень ингибирования при действии на фермент - субстратную систему цистеин - L-ЦДГ составляет для АФВ1 89±2%. Аналитические характеристики цистеиндесульгидразного биосенсора в присутствии АФВ1 приведены в таблице 10 (позиция 1) [138, 139].
Охратоксин А. При добавлении к раствору субстрата ОТА в присутствии цистеиндесульфгидразного биосенсора наблюдаемый эффект зависит от изучаемой области концентраций. Оказалось, что в диапазоне концентраций ОТА от 1х10"5 до 1 хЮ"6 моль/л ток окисления цистеина имеет меньшее значение, чем в присутствии иммобилизованного фермента в отсутствие эффектора. Это факт может иметь место только в том случае, если L-ЦДГ проявляет повышенную каталитическую активность и превращает в продукты ферментативной реакции большую часть субстрата, чем в отсутствие ОТА. Поскольку в этом случае остается меньше цистеина, не подвергшегося ферментативному превращению, то и ток окисления меньше по величине. Таким образом, L-ЦДГ проявляет в присутствие определенной концентрации ОТА активирующее действие. Можно предположить, что в результате конформационных превращений после взаимодействия ОТА с участками, близко расположенными к активным центрам фермента, увеличивается число доступных каталитически активных центров для взаимодействия с субстратом [140].
В области концентраций ОТА от 1x10" до 5x10" моль/л наблюдается ингибирующее действие, выражающееся уже в увеличении тока по сравнению с действием самого фермента, что отражает специфику действия L-ЦДГ.
Аналитические характеристики цистеиндесульфгидразного биосенсора в присутствие ОТА приведены в таблице 10 (позиция 1) [140, 141].
Максимальная степень ингибирования при действии на фермент -субстратную систему цистеин - L-ЦДГ составляет для ОТА от (95±2)%, значение сн - на уровне пикомолярных концентраций.
Зеараленон. В присутствие зеараленона наблюдается ток, больший по величине тока окисления цистеина в присутствии иммобилизованного фермента, но меньший тока окисления цистеина в отсутствие фермента. Это указывает на ингибирующее действие ЗЕА на L-ЦДГ при Е=0.7 В во всем интервале рабочих концентраций от 1x10" до 1x10" моль/л. Степень ингибирования при действии на фермент - субстратную систему цистеин - ЦДГ составляет для зеараленона (93±1) %.
Уравнение регрессии представлено в таблице 10, позиция 1. Правильность определения микотоксинов в указанных диапазонах концентраций с помощью цистеиндесульфгидразного биосенсора оценена способом "введено-найдено" (таблицы 11-13). Процент открытия изменяется в диапазоне от 115 до 90%. Аналитические характеристики биосенсоров на основе цистеиндесульфгидразы для определения микотоксинов
Холинэстеразные биосенсоры на основе модифицированных углеродными нанотрубками электродов
Ранее на кафедре аналитической химии был разработан способ получения иммуноферментных сенсоров (ИФС) с использованием в качестве ферментной метки ХЭ [145]. Причем ХЭ оказалась весьма удобным ферментом для регистрации степени протекания иммунохимической реакции, что позволило разработать иммуноферментные сенсоры для определения разных по биологическому действию веществ [159].
Разработанный подход имеет определенный универсальный характер, единственным условием является отсутствие ингибирующего (активирующего) взаимодействия между определяемым компонентом и ферментом. Однако каталитическая же активность ХЭ, как было установлено (см. раздел 4.1.), изменяется в присутствии изучаемых микотоксинов, которые проявляют свойства ингибиторов.
В рамках данной работы проведено исследование по выявлению возможности использования ферментов разных классов для этих целей. Однако в большинстве случаев наблюдался ингибирующий (в отдельном случае активирующий) эффект в результате действия исследуемых микотоксинов на каталитическую активность иммобилизованных ферментов. В то же время эти результаты позволили предложить новые амперометрические биосенсоры для их определения (см.раздел 4.1 - 4.4).
Изучение действия АФВ1 на тирозиназу показало, что этот микотоксин не вызывает ингибирующего эффекта на используемый ферментный препарат, поэтому представилось возможным разработать иммуносенсор для определения АФВ1.
Разработанный ИФС представляет собой платиновый печатный электрод, на поверхности которого проводили со-иммобилизацию тирозиназы и иммунореагента (Ат против АФВ 1).
Установлено, что при соиммобилизации Ат с тирозиназой в присутствии АФВ1 наблюдается уменьшение аналитического сигнала, что, возможно, связано с образованием комплекса Ат - Аг, который оказывает стерические препятствия при подходе субстрата к активному центру фермента. Это приводит к тому, что в ферментативном процессе участвует меньшее количество молекул субстрата по отношению к контрольному опыту и величина аналитического сигнала снижается. Нельзя исключить и то, что иммунный комплекс может оказывать аллостерическую регуляцию каталитической активности фермента.
Наибольшего ингибирующего эффекта, и, следовательно, возможности проводить регистрацию аналитического сигнала с меньшей погрешностью, удалось достичь при использовании Ат в разведении 1:5. Разведение антител 1:1, 1:10, 1:20 обеспечивали более узкий интервал определяемых концентраций (1хЮ"6 -lxlO-10) и соответственно более низкие степени ингибирования: от (89.2±0.5) до (60.0±0.5)%. Вследствие лучших аналитических характеристик, которые демонстрировал ИФС, основанный на разведение Ат 1:5, именно данная концентрация Ат была выбрана для проведения последующих иммуноопределений. Аналитические характеристики ИФС для определения
Схема действия ИФС на основе иммобилизованных Ат против АФВ1 и тирозиназы включает: совместно иммобилизованные фермент (тирозиназа) и антитела (1), антиген в растворе - АФВ1 (2), образующийся иммунный комплекс и варианты подхода субстрата к активной поверхности фермента (3). Следует отметить, что тирозиназу при разработке соответствующего ИФС для оценки степени протекания биоспецифических взаимодействий использовали впервые.
Правильность результатов определения АФВ1, полученных с использованием разработанного ИФС, подтверждена методом "введено-найдено" (таблица 23).
Графическая обработка экспериментальных данных в координатах Скэтчарда позволяет определить константы образования иммунных комплексов. График Скэтчарда (рисунок 13) может быть аппроксимирован двумя прямыми, что указывает на преимущественное наличие двух популяций антител. Это позволило рассчитать константы связывания иммунных комплексов [Ат-АФВІ], которые составляют: Ка1 = (6.9+0.2)х1010 и Ка2= (2.7+0.1)х109моль" . Константы связывания образующихся комплексов АФВ1-Ат показывают, что в изученных условиях имеет место достаточно прочное связывании между антителами и определяемым компонентом, что обеспечивает упешное протекание иммунологической реакции и эффективность иммуноферментного анализа.
Изучение действия АФВ1 на ИФС с тирозиназной ферментной меткой, иммобилизованной совместно с Ат в разведении (1:5) показало, что АФВ1 оказывает ингибирующее действие в области концентраций от 1 х 10"6 до 5 10"12 моль/л. Для АФВ1 на модифицированном МУНТ в хитозане ИФС сн составила 9x10"13 моль/л. Аналитические характеристики ИФС, модифицированного МУНТ представлены в таблице 22.
Правильность результатов определений АФВ1, полученных с использованием разработанного ИФС, модифицированного УНТ подтверждена методом "введено-найдено" (таблица 23).
Процент перекрестного реагирования для разработанного ИФС составляет для ОТА (9.6±0.3)%, для ЗЕА - (34±0.2)%, для патулина - (2.1±0.2)%. Полученные значения процентов перекрестного реагирования показывают, что определение АФВ1 возможно в присутствии ОТА и патулина, в то же время присутствие ЗЕА в образцах может привести к завышенным результатам.
