Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературных данных 10
1.1. Основы метода капиллярного электрофореза 10
1.1.1. Поверхность раздела кварц — водный раствор электролита 12
1.1.2. Двойной электрический слой 12
1.1.3. Кварцевый капилляр в электрическом поле 13
1.1.4. Зона пробы в капилляре 14
1.1.5. Основные варианты капиллярного электрофореза 17
1.1.5.1. Капиллярный зонный электрофорез 17
1.1.5.2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография 18
1.1.6. Сравнительные характеристики капиллярного электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии 20
1.1.7. Аппаратура 23
1.1.7.1. Общая схема прибора 23
1.1.7.2. Зарубежные коммерческие системы капиллярного электрофореза 24
1.1.7.3. Отечественные системы капиллярного электрофореза 25
1.1.7.4. Методы детектирования в капиллярном электрофорезе 27
1.2. Эффективность, чувствительность, разрешение и селективность метода капиллярного электрофореза 34
1.3. Объекты для анализа методом капиллярного электрофореза, подготовка пробы 48
Глава 2. Общая характеристика объектов и методов исследования 57
2.1. Объекты исследования 57
2.2. Методы исследования 64
Глава 3. Исследование факторов, влияющих на разделение пестицидов ряда хлорфеноксикарбоновых кислот и симметричных триазинов в зонном и мицеллярном вариантах капиллярного электрофореза 70
3.1. Факторы, влияющие на разделение хлорфеноксикарбоновых кислот в режиме капиллярного зонного электрофореза 72
3.2. Факторы, влияющие на разделение хлорфеноксикарбоновых кислот в варианте мицеллярной электрокинетической хроматографии 84
3.3. Исследование параметров разделения гербицидов класса симм-триазинов методом зонного и мицелллярного электрофореза 92
Глава 4. Изучение влияния макроциклических реагентов, мицеллообразователя и органических модификаторов на разделение некоторых бифункциональных производных карбоновых кислот в режиме зонного и мицелллярного капиллярного электрофореза 100
4.1. Разделение позиционных изомеров нитро-, амино-, хлор- и гидроксибензойных кислот в режиме свободного и модифицированного зонного электрофореза 100
4.1.1. Параметры разделения позиционных изомеров в режиме свободного зонного электрофореза 101
4.1.2. Влияние добавок органических растворителей на разделение позиционных изомеров нитро-, амино-, хлор- и гидроксибензойных кислот 103
4.1.3. Влияние макроциклических реагентов как модификаторов ведущего электролита на параметры разделения позиционных изомеров 108
4.1.3.1. Физико-химическая модель, описывающая процессы комплексообразования макроцикл аиалит; расчет констант устойчивости образующихся комплексов 109
4.1.3.2. Роль а- и р-циклодекстринов в электрофоретическом разделении позиционных изомеров 111
4.1.3.3. Влияние 4,13-диаза-18-краун-6 и криптанда [2.2.2] на разделение позиционных изомеров в капиллярном зонном электрофорезе 121
4.1.4. Влияние добавок додецилсульфата натрия в присутствии и отсутствии Р-циклодекстрина на разделение позиционных изомеров замещенных бензойных кислот 124
4.2. Разделение позиционных изомеров замещенных бензойных кислот в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии 127
4.3. Электрофоретическое разделение аминокислот методами капиллярного электрофореза 131
Глава 5. Практические приложения 141
5.1. Анализ гербицидов класса хлорфеноксикарбоновых кислот в природных, питьевых и очищенных сточных водах с помощью капиллярного электрофореза 141
5.1.1. Оценка мешающего влияния гуминовых кислот 142
5.1.2. Использование твердофазной экстракции для концентрирования пробы 144
5.1.3. Анализ пестицидов класса хлорфеноксикарбоновых кислот методом ВЭЖХ, сопоставление полученных результатов с капиллярным электрофорезом 146
5.2. Схема анализа гербицидов ряда симм-триазинов в природных и питьевых водах 150
5.2.1. Условия электрофоретического разделения 150
5.2.2. Подготовка пробы к анализу 150
5.3. Прямое определение аминокислотного состава кормов, комбикормов и комбикормового сырья методом капиллярного зонного электрофореза в присутствии (3-ЦД 151
5.4. Энантиомерное разделение хиральных метаболитов карбамазепина с использованием замещенных у циклодекстринов как компонентов ведущего электролита 155
Выводы 158
Список использованной литературы 160
Принятые сокращения 176
- Методы детектирования в капиллярном электрофорезе
- Факторы, влияющие на разделение хлорфеноксикарбоновых кислот в режиме капиллярного зонного электрофореза
- Роль а- и р-циклодекстринов в электрофоретическом разделении позиционных изомеров
- Прямое определение аминокислотного состава кормов, комбикормов и комбикормового сырья методом капиллярного зонного электрофореза в присутствии (3-ЦД
Методы детектирования в капиллярном электрофорезе
Некоторые характеристики детектирующих систем, используемых в КЭ, представлены в табл. 1.4. Указанные пределы детектирования позволяют оценить чувствительность детектора, при этом необходимо учитывать, что предел обнаружения определяется большим числом параметров, включая объем вводимой пробы, эффективность разделения, температурные эффекты, физико-химические свойства анализируемых веществ (квантовый выход, молярный коэффициент поглощения и т.п.) и многие другие [46].
Детектирование в системах капиллярного электрофореза может осуществляться различными способами:
непосредственно в капилляре в части, близкой к выходному концу, в режиме реального времени {on-capillary, on-columri) [42, 47-51]. В зоне детектирования с внешней стенки капилляра снимают защитное полиамидное покрытие. Этот способ характерен для большинства коммерческих систем капиллярного электрофореза;
непосредственно на выходном конце капилляра (end-capillary, end-column) [48],
вне системы КЭ (off-capillary, off-column, при этом, как правило, детектор представляет собой отдельный самостоятельный прибор (например, масс-спектрометр) и соединен с системой капиллярного электрофореза интерфейсом) [52].
В капиллярном электрофорезе используют те же принципы детектирования, что и в ВЭЖХ. Важным преимуществом КЭ перед ВЭЖХ, помимо плоского профиля ЭОП, является отсутствие соединительных гидравлических линий между узлами инжектор - капилляр и капилляр -детектор, которые приводят к уширению зоны вещества за счет внеколоночного размывания.
Некоторые характеристики детекторов, применяемых в КЭ, представлены в табл.1.4.
Основными принципами детектирования в КЭ являются:
ультрафиолетовое - видимое УФ-В (прямое и косвенное) [12, 13, 41, 42, 47, 54],
флуоресцентное (прямое и косвенное), включая индуцированную лазером флуоресценцию [19, 48, 49],
масс-спектрометрическое [52, 55],
кондуктометрическое [56],
амперометрическое (прямое и косвенное) [57, 58],
радиометрическое [51],
рефрактометрическое [50, 59].
Наиболее распространенным вариантом детектирования является УФ/В, основанное на поглощении веществом УФ- или видимого света. Фотометрические детекторы в КЭ, как и в ВЭЖХ, подразделяют на:
а) детекторы с фиксированной длиной волны: источники света с линейчатым спектром (ртутная лампа (253,7 нм), кадмиевая лампа (228,8 нм) и цинковая лампа (214 нм). Это наиболее простые и недорогие системы;
б) детекторы с изменяемой длиной волны: источниками света служат дейтериевые и вольфрамовые лампы (рабочий диапазон длин волн 190 — 350 нм и 340 - 850 нм, соответственно).
в) детекторы на диодной матрице ДМД [39]. В таких детекторах матрица фотодиодов постоянно регистрирует сигналы в ультрафиолетовой и видимой частях спектра (УФ-В-детекторы), обеспечивая запись в режиме сканирования. Данные, полученные одновременно на различных длинах волн, обрабатываются с помощью компьютеров, выделяющих сигнал на оптимальной длине волны и вычитающих фон. Применение детекторов на диодной матрице обеспечивает получение аналитических данных с гораздо большей степенью достоверности. Например, при определении гомогенности пика (однородности, peak purity) осуществляется спектральный контроль в максимуме и по обоим склонам пика [40]. Если пик однороден, то все три спектра будут идентичны. Для данного вещества отношение высот пиков на электрофореграммах, записанных при двух различных длинах волн, есть величина постоянная. Гомогенность пика можно проверить также при сравнении параметров удерживания анализируемого вещества, полученных при двух разных длинах волн (для ДМД обе электрофореграммы могут быть получены в ходе одного анализа). Идентификацию пика проводят путем сравнения времен удерживания и спектров стандарта и компонента проанализированной пробы.
Для соединений, анализируемых с помощью КЭ и не поглощающих в УФ-диапазоне, существует возможность регистрации методом косвенного УФ-детектирования [53]. В этом случае в состав ведущего электролита вводят небольшое количество хромофора - вещества, поглощающего на требуемой длине волны. Так, в случае определения анионов поглощающий ион тоже должен быть анионом, например, хромат-ион, фталат-ион [60], а при определении катионов чаще всего используют катионы ароматических аминов, в частности, ион протонированного бензимидазола [47]. Так как ионная сила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне, где находится непоглощающий ион, уменьшается концентрация поглощающего иона. Обмен происходит строго эквивалентно, на электрофореграмме наблюдаются обратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациям определяемых ионов. Косвенное УФ-детектирование является универсальным вариантом детектирования, т.к. позволяет регистрировать все присутствующие в анализируемом растворе компоненты.
Флуоресцентное детектирование используют для регистрации веществ, обладающих собственной флуоресценцией или тех, для которых возможно получение флуоресцирующих производных [19, 41, 48, 49, 61]. Среди известных люминофоров — ортофталевый диальдегид, дансилхлорид, фенилизотиоцианат. Метод отличается высокой селективностью, а его чувствительность на 2-3 порядка превышает возможности УФ-детектирования. Необходимо обращать внимание на явление тушения флуоресценции и предотвращать его возникновение (если детектирование не проводят по косвенному варианту, в основе которого лежит тушение люминесценции ведущего электролита) [61]. Флуоресцентное детектирование требует применения импульсных источников света, в качестве которых используются ксеноновые лампы, а также более дорогие лазерные системы: аргон-ионные, гелий-кадмиевые, гелий-неоновые и другие [53].
К электрохимическим методам детектирования в КЭ относят амперометрический (прямое и косвенное определение), кондуктометрический и потенциометрический. Амперометрическое детектирование для КЭ впервые было предложено в 1987 г. для анализа катехоламинов [62] и может быть использовано для обнаружения электрохимически активных веществ. В основе метода лежит измерение тока, протекающего в электрохимической ячейке при происходящих на рабочем электроде реакциях окисления или восстановления; величина этого тока прямо пропорциональна концентрации анализируемого соединения. Подавляющее большинство амперометрических исследований в КЭ проводят по окислению, например, при анализе ароматических гидроксисоединений, ароматических аминов, индолов, меркаптанов [53, 66]. Детектирование по восстановлению практически не используют из-за мешающего влияния растворенного кислорода. Недостаток амперометрического детектирования — отравление рабочего электрода ввиду сильной сорбции промежуточных продуктов окислительно-восстановительных реакций поверхностью электрода, как следствие — снижение его активности [62]. Замена угольного электрода медным позволяет увеличить срок службы рабочего электрода в неимпульсной схеме амперометрического детектирования [63].
Кондуктометрическое детектирование традиционно используют в анализе ионов, ввиду отсутствия у последних собственного поглощения и люминесценции. При появлении в зоне детектирования анализируемого иона электропроводность раствора меняется. Одна из проблем этого вида детектирования связана с возникновением помимо фоновой электропроводности электролита некоторой электропроводности в зоне вещества, которая может быть решена использованием подавительной схемы детектирования [64]. В результате ионного обмена буферный противоион образует слабо диссоциирующие кислоту (анализ анионов) или основание (анализ катионов), при этом снижается общая проводимость буферного раствора, но возрастает разница между электропроводностью пробы и буфера. Подавительная техника практически не используется при анализе катионов из-за необходимости работы с низкими значениями рН электролитов, а, следовательно, малыми скоростями ЭОП и затруднениями в транспортировке пробы в зону детектирования. Более того, эта схема приводит к экстраколоночному размыванию зон компонентов, что ограничивает эффективность разделения.
Широкие возможности для использования в качестве детектора в КЭ имеет масс-спектрометр [52, 53, 55, 65]. Он в достаточной мере чувствителен и универсален (регистрируются все вещества, имеющие молекулярные массы в рабочем диапазоне масс этого детектора). Особая привлекательность данного способа детектирования связана с возможностью получения качественной характеристики анализируемого вещества: заряженные фрагменты, полученные при расщеплении пробы (обычно заряд аналита равен +1), анализируются масс-спектрометром с последующим формированием масс-спектра (зависимость интенсивности сигналов от величины отношения массы к заряду (m/z)) для каждого фрагмента. Встроенная и легко дополняемая библиотека спектров позволяет идентифицировать анализируемые компоненты в сложных смесях.
Факторы, влияющие на разделение хлорфеноксикарбоновых кислот в режиме капиллярного зонного электрофореза
Способность определяемых хлорфеноксикарбоновых кислот в нейтральных и щелочных растворах существовать в виде органических анионов позволяет использовать для их разделения классическую схему анализа (рис. 2.1, детектор у катода), принятую в КЭ [8, 12, 38]. В этом случае происходит разделение ФКК на основании различий их электрофоретической подвижности в присутствии достаточно сильного ЭОП (скорость ЭОП пропорциональна рН ведущего электролита), в результате чего «медленные» анионы мигрируют против своей электрической природы к катоду. Селективность разделения в зонном варианте КЭ по сравнению с ВЭЖХ не всегда достаточна вследствие малых различий в электрофоретической подвижности разделяемых компонентов. При анализе смеси, содержащей 5 ФКК (2,4-ДМ, 2,4-ДП, 2,4,5-Т, 2,4-Д, ФУК) и продукт их деградации в водной среде (2,4-ДХФ), мы исследовали важнейшие факторы, влияющие на параметры разделения этих пестицидов в зонном варианте:
рН (аммиачно-ацетатный буфер (рН=4.8) и боратный буфер (рН=9.2)) и концентрацию ведущего электролита (от 10 до 50 мМ),
геометрические характеристики капилляра (внутренний диаметр 50 и 75 мкм, эффективная длина от 50 до 60 см),
условия ввода пробы (время ввода от 15 до 120 сек при постоянном давлении ввода 30 мбар и величину рабочего напряжения от +15 до +25 кВ),
добавление в состав ведущего электролита макроциклических реагентов (а- и Р-циклодекстринов от 1 до 10 мМ; 4,13-диаза-18-краун-6 (3 мМ) и криптанда [2.2.2] (3 мМ)), а также органических растворителей (метанола и ацетонитрила от 10 до 20 %, объемн.).
Варьирование рН и концентрации ведущего электролита является в капиллярном зонном электрофорезе наиболее эффективной и простой возможностью влиять на параметры разделения системы, в первую очередь, на скорость ЭОП. Так, при уменьшении рН и увеличении концентрации ведущего буфера наблюдается снижение скорости ЭОП, связанное с уменьшением электрокинетического потенциала ( -потенциала). В среде боратного (рН=9.2) и аммиачно-ацетатного (рН= 4.8) буферов мы провели электрофоретическое разделение смеси гербицидов ряда хлорфеноксикарбоновых кислот и продукта их разложения. Из табл. 3.2 видно, что щелочная среда более предпочтительна, поскольку позволяет достигать большей эффективности при меньшем времени анализа.
Необходимо отметить, что величина рН ведущего электролита определяет не только скорость электроосмотического потока, но и форму нахождения анализируемых компонентов в растворе. Так, в среде аммиачно-ацетатного буфера (рН= 4.8) 2,4-дихлорфенол (рКа= 7.9) находится в нейтральной форме и выходит в зоне ЭОП (рис. 3.1, пик 1).
На примере боратного буфера было исследовано влияние концентрации ведущего электролита на разделение смеси ФКК. При увеличении концентрации буферного раствора наблюдался рост общего времени анализа, небольшое увеличение в разрешении пиков и значительное - силы тока в капилляре (от 20 до 100 мкА). В то же время эффективность разделения компонентов смеси снижалась по мере роста концентрации ведущего буфера: например, для 2,4-Д с 453000 т.т. при 10 мМ до 268000 т.т. при 50 мМ, что можно объяснить дополнительным уширением зон индивидуальных компонентов за счет продольной диффузии и температурных эффектов. Полученные данные согласуются также с теоретическими представлениями [72], согласно которым скорость ЭОП снижается при увеличении концентрации электролита (рис. 3.2).
Изучение влияния характеристик капилляра на разделение ФКК в режиме зонного электрофореза проводилось с помощью немодифицированных кварцевых капилляров с внутренним диаметром 50 100 мкм, внешним диаметром 365 мкм и общей длиной 50-70 см, защищенных снаружи полиимидным покрытием. Методом зонного электрофореза на двух капиллярах равной длины (эффективная длина 50 см) и внутренних диаметров 50 и 75 мкм при идентичности других условий анализа нами проведено разделение смеси, включающей пять важных гербицидов класса ФКК и 2,4-дихлорфенол (в дальнейшем названной нами рабочей смесью ФКК). Электрофореграммы представлены нарис. 3.3.
Разделение оказалось более эффективным на капилляре с меньшим внутренним диаметром, что связано с ослаблением радиального профиля градиента температуры, а значит, и с меньшим уширением пиков. Однако к недостаткам использования капилляров малых внутренних диаметров можно отнести уменьшение чувствительности УФ-детектирования из-за снижения длины оптического пути [53] и малый ресурс работы вследствие засорения капилляра. Поэтому все дальнейшие исследования проводили, используя кварцевый капилляр с внутренним диаметром 75 мкм.
Для ввода пробы в капилляр пользовались гидродинамическим (пневматическим) способом, при котором объем пробы можно регулировать изменением времени ввода и реже варьированием величины давления. Закрепив давление РВВода=30 мбар, варьировали время пневматического ввода от 15 до 120 с. Удовлетворительному разрешению всех пиков (R 1,25) соответствовали времена ввода 15 и 30 с, при дальнейшем увеличении времени ввода наблюдали явление объемной перегрузки системы разделения: уширение зон индивидуальных компонентов и связанные с этим трудности разделения соседних пиков. Зависимость эффективности разделения ФКК от времени пневматического ввода представлена на рис. 3.4.
Известно, что разрешение пиков в КЭ возрастает при повышении рабочего напряжения [8, 39, 72]. Тем не менее, главной причиной ограниченного использования высоких разностей потенциалов при анализе методом КЭ являются большие токи, возникающие в капилляре [113]. В диапазоне напряжений от +15 до +25 кВ нами проведен анализ смеси хлорфеноксикарбоновых кислот. Основные параметры разделения представлены в табл. 3.3. Оптимальным оказалось рабочее напряжение +20 кВ, при котором наблюдается достаточное разрешение пиков за приемлемое время анализа (15 мин), рис. 3.5. Величина тока при этом напряжении достигает 75 мкА, что вполне допустимо для прибора с воздушным охлаждением капилляра. При напряжении +25 кВ величина тока достигает значения 105 мкА, и, несмотря на лучшие характеристики разделения (табл. 3.3), этот режим не может быть рекомендован для анализа, поскольку наблюдается нестабильность базовой линии вследствие недостаточного охлаждения раствора в капилляре.
При высочайшей эффективности ( сотни тысяч т.т.) капиллярный зонный электрофорез характеризуется недостаточной селективностью разделения. Так, в природных водах при анализе гербицидов класса ФКК необходимо определять 2-метил-4-хлорфеноксиуксусную кислоту (2М-4Х), которая имеет близкую к 2,4-Д электрофоретическую подвижность, что существенно затрудняет их разделение в режиме зонного электрофореза. Мы включили в состав исследуемой смеси ФКК интересующий нас гербицид 2М-4Х. Для разделения использовали как аммиачно-ацетатный, так и боратный буферы (рН=4.8 и 9.2, соответственно). В обоих случаях разделение 2М-4Х и 2,4-Д оказалось невозможным.
Один из путей повышения селективности разделения в КЭ связан с введением в состав ведущего электролита добавок макроциклических реагентов [13], органических растворителей [20] и ПАВ [12, 47] (табл. 1.5). Известно, что макроциклы, имеющие как гидрофобную (ЦД), так и гидрофильную внутренние полости (краун-эфиры, криптанды), способны образовывать комплексы по типу «гость-хозяин» с веществами неорганической и органической природы, включая катионные, анионные и нейтральные субстраты. Существенную роль в процессе комплексообразования играет тип и концентрация макроцикла. Нами были приготовлены ведущие электролиты на основе боратного буфера (рН= 9.2) с добавками индивидуальных макроциклов (МЦ): а- и Р-ЦД, 4,13-диаза-18-краун-6 и криптанда [2.2.2], концентрации МЦ варьировали в диапазоне 1-10 мМ. Особая привлекательность 4,13-диаза-18-краун-6 и криптанда [2.2.2] для КЭ заключается в их высокой растворимости в водных системах, тогда как циклодекстрины, особенно Р-ЦД, мало растворимы в воде, что ограничивает диапазон концентраций этих добавок. На рис. 3.6 приведены электрофореграммы смеси ФКК в присутствии 2-МЄТИЛ-4-хлорфеноксиуксусной кислоты, полученные на буферных растворах с макроциклами. Как видно из рис. 3.6, добавки а-ЦД, 4,13-диаза-18-краун-6 и криптанда [2.2.2] не оказывают влияния на разделение пары 2,4-Д и 2М-4Х. Так же, как в буфере без макроциклов оба компонента на электрофореграмме образуют один пик. При этом макроциклы с гидрофильной внутренней полостью существенно уменьшают скорость ЭОП, особенно краун-эфир (втрое), что приводит к увеличению общего времени разделения и снижению эффективности. При использовании ЦД в составе рабочего буферного электролита оказалось, что влияние а- и Р-ЦД на параметры разделения анализируемой смеси существенно различается. Так, добавки а-ЦД никак не сказываются на времени миграции, эффективности и разрешении компонентов анализируемого раствора (рис. 3.6, в). Тогда как введение в состав электролита Р-ЦД приводит к инверсии порядка выхода компонентов, снижению времени миграции некоторых аналитов и повышению эффективности (рис. 3.6, г).
Таким образом, введение 2 мМ Р-ЦД в состав ведущего электролита уменьшает время миграции 2,4,5-Т и, особенно, 2,4-дихлорфенола, что, по-видимому, связано с включением соответствующих аналитов в полость ЦД и образованием комплексов по типу «гость-хозяин». Увеличение эффективности в присутствии Р-ЦД является независимым свидетельством формирования таких комплексов, т.к. перемещаясь со скоростью ЭОП, нейтральные Р-ЦД с включенными внутрь полости анионами способствуют более эффективному их массопереносу. Отрицательный результат для а-ЦД скорее всего связан с меньшим, чем у р-ЦД, размером полости, что затрудняет комплексообразование. В случае же макроциклов с гидрофильными внутренними полостями (4ДЗ-диаза-18-краун-6 и криптанда [2.2.2]) отсутствие их влияния на селективность разделения исследуемой смеси гербицидов может быть связано именно с полярным характером полости.
Органические растворители при их введении в состав буферного электролита способны повлиять на параметры разделения многокомпонентной смеси вследствие изменения вязкости раствора и сольватационных эффектов [20, 22]. Нами были изучены добавки метанола и ацетонитрила (10 %, объемн.) в боратный буфер на примере разделения смеси ФКК, табл. 3.4. Полученные результаты показали незначительные уменьшения подвижности ЭОП при введении органических модификаторов, при этом метанол практически не влияет на разрешение и эффективность, а присутствие ацетонитрила в буфере снижает оба параметра разделения. При введении в анализируемый раствор компонента 2М-4Х получили одинаковый для обеих органических добавок вид электрофореграммы (рис. 3.7): 2М-4Х и 2,4-Д полностью не разделяются.
Роль а- и р-циклодекстринов в электрофоретическом разделении позиционных изомеров
Напомним, что усеченные конусы молекул циклодекстринов имеют гидрофобную внутреннюю полость и гидрофильную внешнюю часть за счет реакционноспособных вторичных ОН-групп. При использовании ЦД как компонентов ведущего электролита происходит включение объемных гидрофобных фрагментов анализируемых веществ в полость ЦД и взаимодействие вторичных гидроксильных групп макроцикла с полярными группами компонента. При этом возможность образования комплексов включения определяется, главным образом, стерическими факторами (соответствием размеров анализируемой молекулы (иона) и полости макроцикла), а также гидрофобными взаимодействиями, образованием водородных связей и эффектами сольватации.
Мы использовали добавки индивидуальных а- и р-ЦД в диапазоне концентраций 1-10 мМ, основой ведущего электролита являлся боратный буфер (10 мМ,рН=9.2).
Оказалось, что для позиционных изомеров нитробензойных кислот добавки как а-, так и Р-ЦД привели к полному разделению компонентов, начиная с концентрации 2 мМ, при этом для {З-циклодекстрина параметры разделения в 2 раза выше, чем для a-ЦД (табл. 4.2).
Уменьшение времен миграции для п- и о-нитробензойных кислот можно объяснить, принимая во внимание следующие положения. В режиме свободного зонного электрофореза (без ЦД) анионы нитробензойных кислот перемещаются к катоду вместе с ЭОП, имея близкие электрофоретические подвижности. После введения циклодекстринов в состав буфера вязкость раствора не меняется, скорость ЭОП остается неизменной, при этом а- или р-циклодекстрины будучи нейтральными соединениями движутся со скоростью электроосмотического потока в одном с ним направлении (рис. 4.5).
Анионы кислот, включенные внутрь полости ЦД, имеют большие ионные радиусы и, следовательно, меньшие электрофоретические подвижности, чем свободные анионы, что определяет для комплексных форм меньшие времена миграции. При этом, чем больше соответствие между размерами макроцикла и аниона, тем выше стабильность образовавшегося комплекса включения, и тем ближе анион выходит к зоне ЭОП. Следует учитывать, что анионная форма изучаемых карбоновых кислот в присутствии ЦД может быть стабилизирована не только за счет формирования комплексов включения, но и образованием водородных связей между внешними гидроксильными группами макроцикла и анионным центром, а также участием соответствующих функциональных групп аналита. Как видно из табл. 4.2, порядок выхода позиционных изомеров (п-, м-, о- ) одинаков для обоих циклодекстринов, входящих в состав рабочего буфера, причем для Р-ЦД времена миграции всех трех изомеров меньше. Следовательно, й-нитробензойная кислота сильнее всего удерживается полостью ЦД, а среди используемых макроциклов более прочные комплексы с позиционными изомерами нитробензойных кислот образует Р-ЦД.
При увеличении концентрации циклодекстринов в буфере от 2 до 10 мМ растет эффективность, причем для Р-ЦД значительнее, что является независимым свидетельством образования более прочных комплексов с этим макроциклом. Циклодекстрины с включенными внутрь полости анионами нитробензойных кислот способствуют более эффективному их массопереносу.
С целью повышения селективности разделения были опробованы ведущие электролиты, содержащие одновременно два различных циклодекстрина. Из литературы известно [77], что такой прием может как улучшать параметры разделения, так и ухудшать их. Мы использовали боратные буферные растворы, в которые одновременно вводили а- и Р-ЦД при различных соотношениях концентраций в диапазоне 1-10 мМ. Оказалось, что такие системы уступают электролитам с добавками индивидуальных циклодекстринов как по эффективности, так и по селективности разделения (табл. 4.3).
При изучении влияния добавок индивидуальных циклодекстринов на разделение позиционных изомеров аминобензойных кислот, было обнаружено, что введение в буферную систему уже 1 мМ Р-ЦД приводит к полному разделению всех трех изомеров, тогда как для а-ЦД подобный эффект наблюдали лишь при 10 мМ (рис. 4.6).
С ростом концентрации макроциклов увеличивается разрешение между пара- и л еиш-изомерами (с 0.74 без ЦД до 1.25 для а-ЦД и 4.27 для р-ЦД) и снижается между мета- и орто- (с 2.04 без ЦД до 1.26 для а-ЦД и 1.79 для Р-ЦД), что согласуется с константами устойчивости образующихся комплексов (табл. 4.4). Стабильность комплексов включения позиционных изомеров аминобензойных кислот с а- и р-ЦД убывает в ряду: пара- мета- орто.
На основании полученных результатов можно утверждать, что Р-ЦД образует с аминобензойными кислотами более прочные комплексы, чем а-ЦД, особенно в случае пара-изомера.
Разделение о- и я-хлорбензойных кислот в режиме свободного зонного электрофореза не представляется возможным, рис. 4.1. Однако, при введении в состав ведущего электролита уже 1 мМ а- или Р-ЦД наблюдается полное разделение интересующих компонентов смеси. С ростом концентрации ЦД происходит увеличение разрешения и снижение времени миграции пара-изомера, причем эта тенденция более выражена для а-ЦД (рис. 4.7)
Следовательно, а-ЦД удерживает хлорбензойные кислоты более прочно, чем р-ЦД, возможно, вследствие стерических факторов. Для napa-изомера наблюдается та же тенденция, что и в случае нитро- и аминобензойных кислот: он удерживается в фазе циклодекстринов сильнее, чем орто-изомер, и на электрофореграмме выходит первым.
Разделение о- и и-гидроксибензойных кислот возможно в отсутствие макроциклов (рис. 4.1). Порядок выхода компонентов обращен по сравнению с изучаемыми в данной главе системами, а именно: пара-изомер следует за орто-. Это связано с тем, что в условиях анализа (рН=9.2) я-гидроксибензойная кислота существует в форме двухзарядного аниона, а о-гидроксибензойная - однозарядного (рКа в табл. 2.3), что и определяет их электрофоретические подвижности. Использование Р-ЦД как компонента ведущего электролита привело к увеличению разрешения компонентов вследствие более заметного снижения времени миграции о-гидроксибензойной кислоты по сравнению с ияра-изомером (рис. 4.8). В случае с а-ЦД параметры разделения практически не изменились. Константы устойчивости комплексов ЦД с гидроксибензоиными кислотами, рассчитанные нами и взятые для сравнения из литературы, приведены в табл. 4.5.
Из табл. 4.5 видно, что стабильность комплексов включения позиционных изомеров гидроксибензойных кислот снижается в ряду орто-изомер ларо-изомер независимо от типа используемого ЦД, при этом (3-ЦД образует более прочные комплексы, чем а-ЦД. Кроме того, отмечается хорошая корреляция при сопоставлении полученных нами результатов с литературными данными. Из [122] известно также, что м-гидроксибензойная кислота, не исследуемая нами, образует самые нестойкие комплексы с Р-ЦД. При этом отмечено, что максимальная стабильность комплексов включения гидроксибензойных кислот с Р-ЦД ( 900 МГ1) достигается в том случае, если «гостем» является нейтральная форма кислот, а не анионная (как в нашем случае). Тем не менее, мы считаем, что разделение позиционных изомеров гидроксибензойных кислот в виде анионов предпочтительнее с точки зрения большей эффективности при меньшем времени анализа: для определения нейтральных форм аналитов при рН 3.5 потребуется переход к мицеллярному варианту КЭ, к тому же скорость ЭОП в кислой среде будет существенно меньше, чем в щелочной, что приведет к увеличению времени анализа.
Таким образом, при разделении производных бензойных кислот, содержащих NCV, NH2-, СІ- и ОН-группы, в присутствии нейтральных ос-и Р-цикло декстринов установлено [147, 148]:
wapa-изомеры сильнее других удерживаются полостью макроцикла в случае нитро-, амино- и хлорбензойных кислот, opmo-moMQp в случае гидроксибензойных кислот (справедливо для обоих типов ЦД — а- и р-);
среди используемых типов ЦД более прочные комплексы с позиционными изомерами образуют: р-ЦД - с амино-, нитро-и гидроксибензойными кислотами, а-ЦД - с хлорбензойными;
с ростом концентрации каждого из ЦД, наряду с селективностью, как правило, увеличивается эффективность (например, табл. 4.2), особенно в случае изомеров, прочно удерживаемых полостью ЦД. Перемещаясь в направлении ЭОП, циклодекстрины с включенными внутрь полости анионами кислот способствуют более эффективному их массопереносу;
Использование буферов, содержащих одновременно а- и Р-ЦД (так называемые двойные ЦД-системы), приводило к снижению селективности по сравнению с одиночными ЦД-системами.
Все исследования, проведенные нами с использованием ЦД, не затрагивали важного свойства этих макроциклов, связанного с наличием в их молекулах ассиметричных атомов углерода, что позволяет применять циклодекстрины для разделения оптических изомеров [80, 123-128]. На примере энантиомеров гидроксикарбамазешшов, проявляющих антиэпилептические свойства, нами проведены хиральные разделения методом зонного электрофореза в присутствии замещенного у-ЦД (глава 5, практические приложения).
Прямое определение аминокислотного состава кормов, комбикормов и комбикормового сырья методом капиллярного зонного электрофореза в присутствии (3-ЦД
Количественный анализ аминокислот в кормах необходим для оценки их качества, стабильности и питательной ценности. Аминокислоты в кормах присутствуют как в свободном виде, так и в связанном (последние определяют после гидролиза белков). Общее содержание и компонентный состав аминокислот нормируется типом корма (комбикорм, рыбная мука, жмых, шрот, кормовые дрожжи, премикс), однако, наиболее часто контроль ведется по лизину, метионину, треонину и цистину.
Традиционными методами контроля являются хроматографические: градиентное элюирование в режиме ОФ-ВЭЖХ и ионообменная хроматография при использовании аминокислотного анализатора. Оба варианта определения характеризуются сложным и дорогостоящим оборудованием, обязательной стадией получения производных, длительностью анализа.
Нами предложен электрофоретический принцип разделения и определения аминокислот в кормах [146]. Вследствие бифункциональности исследуемых компонентов, их можно анализировать в форме катионов, анионов, а также нейтральных соединений. Показано, что при использовании зонного варианта КЭ определение аминокислот предпочтительнее в форме анионов (в щелочной среде). Недостаточная селективность разделения в режиме капиллярного зонного электрофореза может быть повышена при использовании макроциклического реагента -3-циклодекстрина - как компонента буферного электролита. Определение нейтральных форм аминокислот (с предварительной стадией дериватизации) в режиме МЭКХ не входило в нашу задачу. Условия оптимального электрофоретического разделения в зонном варианте представлены на рис. 4.16 (внизу).
Нижние границы определяемых содержаний четырех технологически важных аминокислот в пробах составили: лизин и треонин - 0.2 % (или 0.2 мг аминокислоты / 100 мг пробы), метионин и цистин -0.1%, объем пробы 100 мг.
Подготовка пробы включает в себя следующие стадии:
проведение кислотного гидролиза (на 100 мг пробы берут 10 мл 6М НС1) в течение 8 ч при температуре 110С;
фильтрование полученного гидролизата через беззольный фильтр «синяя лента»;
отбор аликвотной порции гидролизата (1 мл) и упаривание досуха (обдув теплым воздухом);
растворение сухого остатка в 1 мл дистиллированной воды и центрифугирование полученного раствора. Далее проводили анализ подготовленной пробы с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105»: ведущий электролит тетраборат натрия 10 мМ, рН =9.2 с добавкой 10 мМ Р-ЦД; ввод пробы: 450 мбарс; напряжение: +20 кВ, температура охлаждающей жидкости: +25С, детектирование: 190 нм.
Был проанализирован аминокислотный состав проб с высоким (рыбная мука) и низким содержанием (подсолнечные шрот и жмых, комбикормовые смеси) определяемых компонентов. Результаты анализа приведены в табл. 5.3.
Для серии образцов были проведены сличительные эксперименты, в которых были использованы три метода: КЭ, ОФ-ВЭЖХ и ионная хроматография (аминокислотный анализатор). Полученные результаты (табл. 5.4) позволили сделать вывод о возможности применения капиллярного зонного электрофореза для экспрессного определения лизина, метионина, треонина и цистина в пробах с высоким и низким содержанием аминокислот. На основе данной методики подготавливается проект ГОСТа по определению технологически важных аминокислот методом капиллярного электрофореза.
