Содержание к диссертации
Введение
1 Аналитический обзор 8
1.1 Структура и классификация фенольных соединений растительного происхождения 8
1.2 Методы определения фенольных соединений 11
1.2.1. Качественные методы определения фенольных соединений 11
1.2.2 Титриметрические методы определения фенольных соединений 13
1.2.3 Спектроскопические методы определения фенольных соединений 15
1.2.3.1 Колориметрические методы определения фенольных соединений 15
1.2.3.2 ИК-спектроскопическое определение фенольных соединений 19
1.2.4 Электрохимические методы определения фенольных соединений 22
1.3 Хроматографические методы определения фенольных соединений 24
1.3.1 Тонкослойная хроматография при определении фенольных соединений..25
1.3.2 Электрофоретическое определение фенольных соединений 32
1.3.4 Определение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 36
1.3.4.1 Особенности разделения фенольных соединений методом ВЭЖХ 36
1.3.4.2 Детектирование фенольных соединений при их ВЭЖХ определении. 39
1.3.5 Газовая хромато-масс-спектрометрия при определении фенольных соединений 45
1.4 Выводы к аналитическому обзору и постановка исследования 49
2 Экспериментальная часть и обсуждение результатов 59
2.1 Материалы и методы исследования 59
2.1.1 Исходные реактивы, материалы и используемая аппаратура 59
2.1.2 Приготовление рабочих растворов 62
2.1.3 Приготовление экстрактов лекарственных растений 63
2.1.4 Определение влажности растительного сырья 64
2.1.5 Определение суммы дубильных веществ методом перманганатометрии..64
2.2 Разделение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 65
2.2.1 Выбор оптимальной колонки для разделения фенольных соединений 65
2.2.2 Выбор состава подвижной фазы для разделения фенольных соединений.69
2.2.2.1 Выбор режима элюирования 69
2.2.2.2 Влияние органических добавок на разделение фенольных соединений 74
2.2.2.3 Влияние рН подвижной фазы на разделение фенольных соединений 76
2.2.3 Влияние температуры на хроматографическое разделение фенольных соединений 77
2.2.4 Параметры идентификации и количественного определения фенольных соединений методом ВЭЖХ 82
2.3 Разделение фенольных соединений методом газовой хромато-масс-спектрометрии 86
2.3.1 Выбор оптимальных условий разделения фенольных соединений методом газовой хромато-масс-спектрометрии 86
2.3.2 Оптимизация техники силилирования фенольных соединений 92
2.4 Определение фенольных соединений в лекарственных растениях 95
2.4.1 Оценка содержания фенольных соединений в лекарственных растениях.95
2.4.2 Фракционирование и экстракция лекарственного растительного сырья...98
2.4.3 Идентификация фенольных соединений в водных экстрактах лекарственных растений методом ОФ-ВЭЖХ 100
2.4.4 Определение фенольных соединений в водных экстрактах лекарственных растений методом ОФ-ВЭЖХ 106
2.4.5 Сорбционное извлечение фенольных соединений для анализа лекарственных растений методом ГХ-МС 108
2.4.6 Идентификация фенольных соединений в лекарственных растениях методом ГХ-МС 114
2.5 Идентификация и определение фенольных соединений в тысячелистнике обыкновенном 116
2.6 Оценка стабильности фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях в процессе их хранения 127
Выводы 134
Список использованной литературы 137
Приложение А 162
- Электрохимические методы определения фенольных соединений
- Выбор оптимальной колонки для разделения фенольных соединений
- Выбор оптимальных условий разделения фенольных соединений методом газовой хромато-масс-спектрометрии
- Идентификация и определение фенольных соединений в тысячелистнике обыкновенном
Введение к работе
Актуальность работы
Качество лекарственного растительного сырья, содержащего фенольные соединения и флавоноиды, в России регламентируется фармакопейными статьями, в которых установлены требования по содержанию дубильных веществ, эфирных масел, проазуленов, показатели влажности, зольности и т.д. Определение в фотоматериалах фенольных соединений и флавоноидов осуществляется методами титриметрии и спектрофотометрии, которые позволяют оценить суммарное содержание веществ, в то время как для медицины в большинстве случаев интерес представляют данные о концентрации индивидуальных фенольных соединений.
В этом отношении актуальная задача идентификации и определения индивидуальных фенольных соединений, как правило, решается с помощью методов хроматографии, позволяющих получить информацию о качественном составе растительного сырья. Поэтому перспективным направлением является разработка оригинальных методик определения фенольных соединений с учетом разнообразия их структуры и свойств. Представляет также несомненный научный и практический интерес зависимость содержания фенольных соединений в лекарственных растениях от условий их произрастания и хранения.
Диссертационная работа выполнена в рамках грантов РФФИ рюга 06-03-96660 «Обоснование и разработка обобщенных показателей качества растительных материалов для оценки состояния экосистем» и 09-03-96529 «Теоретическое и экспериментальное обоснование обобщенного показателя качества пищевой и сельскохозяйственной продукции - антиоксидантной активности».
Целью настоящей работы является разработка методик идентификации и определения индивидуальных фенольных соединений в лекарственных растениях методами хроматографии и хромато-масс-спектрометрии.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:
- разработка ВЭЖХ-методики идентификации и определения
различных фенольных соединений в фитоматерилах;
- оптимизация условий идентификации фенольных соединений в
лекарственных растениях методом газовой хромато-масс-
спектрометрии;
разработка схемы идентификации и определения фенольных соединений в лекарственном растительном материале;
оценка содержания фенольных соединений в лекарственных растениях в зависимости от условий произрастания и хранения.
Научная новизна
Разработан методический подход к идентификации и определению фенольных соединений и флавоноидов в фитоматерилах, а также схема анализа, позволяющая проводить оценку их содержания в зависимости от условий произрастания и хранения лекарственных растений.
Практическая значимость работы
Предложена оригинальная схема идентификации и определения фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях.
Разработанные и оптимизированные хроматографические методики определения фенольных соединений в лекарственных растениях позволяют осуществлять контроль качества фитоматериалов на этапах их сбора, переработки, хранения и обращения.
Электрохимические методы определения фенольных соединений
Для получения информации о содержании фенольных соединений используют также электрохимические методы, основным преимуществом которых является высокая скорость анализа. Вместе с тем, электрохимические методы зарекомендовали себя как методы определения антиоксидантной активности.
Для получения информации о наличии фенольных соединений в образце растительного происхождения чаще всего используют циклическую вольтамперометрию. Kilmartin Р.А. и Hsu Ch.F. [75] с помощью вольтамперометрии определяли содержание основных фенольных веществ в зелёном, чёрном чае и чае оолонг. Измерения проводили с помощью потенциостата с использованием в качестве электрода сравнения хлорсеребряного электрода, а в качестве рабочего - стеклоуглеродный электрод. Катехины чая окислялись при потенциале 50-300 мВ. Окисление полифенольных соединений сопровождается появлением анодного тока. Измеряли потенциал окисления. Установлено, что чем ниже потенциал окисления, тем меньше антиоксидантная способность фенольного соединения. Потенциал окисления галлокатехинов находится в диапазоне 74-109 мВ, в то время как катехинов, содержащих катехол, в диапазоне 165-188 мВ, эпигаллокатехингаллата - 200 мВ.
Бельгийские ученые [76] предложили несколько способов определения танинов: прямая потенциометрия, потенциометрическое титрование Си + с ЭДТА и потенциометрическое титрование ацетатом меди. Однако из-за образования нескольких различных комплексов танина с Си2+ и выпадения осадка при потенциометрическом титровании Си с ЭДТА отсутствует четкий потенциометрический скачок, поэтому этот способ не пригоден для определения танина в водных растворах. При использовании потенциометрического титрования ацетатом меди получение точных данных о количестве танина в растворе возможно только в случае линейной зависимости между количеством меди в осадке и танином. В образцах индийского и китайского чая было определено содержание чайного танина методом прямой потенциометрии.
Durliat Н. и Comtat М. предложили проводить оценку показателя суммы фенольных соединений потенциометрическим титрованием хлоридом титана (III). По мнению исследователей, этот метод не подходит для определения танинов в вине, так как после окончания титрования происходит постепенное восстановление фенольных соединений [77].
По методу, описанному в работе [78], в грейпфрутовом соке было установлено содержание нарингина. Определение проводили с помощью катодной инверсионной вольтамперометрии, основанной на образовании и накоплении комплексов нарингин - ртуть на поверхности электрода с последующим восстановлением поверхности. Электродный отклик оценивали по отношению к различным условиям, в том числе учитывали рН электролита, концентрацию аналита, потенциал накопления и время концентрирования. Установлен диапазон определяемых концентраций нарингина (0.1-40 мг/л).
Испанские исследователи [79] с помощью дифференциальной импульсной вольтамперометрии на стеклоуглеродном электроде определяли фенольные антиоксиданты. Данный метод экспрессен и надежен, а также селективен по отношению к коричным кислотам и флавонолам. Метод показал удовлетворительные результаты при анализе фруктов и фруктовых соков на содержание флориздина и арбутина.
В Казанском государственном университете была разработана вольтамперометрическая методика определения кверцетина и рутина в фармацевтических препаратах [80]. В качестве рабочего электрода использовали платиновый электрод. Предполагается, что в кислой среде в первую очередь окисляются гидроксильные группы ароматического кольца С флавоноидов.
В работе [81] методом дифференциальной импульсной вольтамперометрии изучали взаимодействие меди (II) с дубильной кислотой. Потенциометрическое поведение кверцетина, рамнетина и кемпферола изучено в работе [82].
Группой российских учёных [83] предложен простой, экспрессный метод колориметрического определения суммы антиоксидантов, представленных фенольными соединениями. Суть метода заключается в окислении фенольных веществ электро-генерированным бромом. Методика была успешно апробирована при анализе экстрактов зверобоя, подорожника, пустырника и боярышника.
Все вышеперечисленные методики позволяют определять только суммарное содержание фенольных соединений, тогда как для фармакологов в большинстве случаев важен компонентный состав фенольных соединений в лекарственных растениях. Для этих целей используют хроматографические методы, позволяющие получить сведения об индивидуальных веществах в фотоматериалах и составить их, так называемый, «фенольный» профиль [84]. Среди хроматографических методов выделяют тонкослойную хроматографию, капиллярный электрофорез, жидкостную и газовую хроматографию. На рис. 5 представлены основные схемы определения фенольных соединений методами хроматографии [85].
Выбор оптимальной колонки для разделения фенольных соединений
В последнее время при анализе продуктов питания, фармацевтических препаратов и биологических жидкостей на содержание фенольных соединений все большее распространение получает метод капиллярного электрофореза (КЭ) и мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии (МЭКХ). По некоторым данным [84] этот метод по частоте использования при определении фенольных веществ растительного происхождения уступает только высокоэффективной жидкостной хроматографии. Некоторые исследователи утверждают [100], что КЭ более селективен по сравнению с ВЭЖХ. По мнению СТ. da Costa [101], преимуществом КЭ является низкий расход элюента для анализа.
Метод капиллярного электрофореза при определении фенольных соединений основывается на способности отрицательно заряженных веществ противостоять электроосмотическому потоку в капилляре. Таким образом, первыми элюируются нейтральные фенольные соединения, затем слабо диссоциирующие (флавоноиды) и сильно диссоциирующие соединения (фенолкарбоновые кислоты) [102].
В качестве подвижной фазы в капиллярном электрофорезе используют боратный буфер, а в мицеллярной электрокинетической хроматографии -раствор додецилсульфата натрия [100].
Авторы работ [85, 103] приводят пример использования КЭ и МЭКХ для разделения смеси 13 флаваноидов. В капиллярном электрофорезе использовали различные буферные системы, варьировали в широком интервале уровень рН, однако не удалось подобрать оптимальные условия для разделения фенольных соединений. Удовлетворительные результаты были получены с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии, что, по-видимому, связано со строением соединений, стериохимией кольца С, числом гидроксильных групп, образованием комплексов флавоноидов с боратным буфером и т.д. В работе [104] для оценки качества зеленого чая по содержанию основных флаваноидов предложено использование боратного буфера с добавлением додецилсульфата натрия (рН 8.4). Авторы акцентируют внимание на том, что рН элюента должен тщательно контролироваться, так как при значениях рН ниже 8.4 буферная емкость снижается, а при более высоких значениях возможно появление эффекта затягивания пика. Применение капиллярного электрофореза для оценки содержания фенольных соединений в черном и зеленом чае описано также в работе [105]. Авторами впервые предложена методика одновременного определения теафлавинов и катехинов чая. Экспериментально доказано, что использование подвижной фазы, содержащей боратный и фосфатный буферные растворы и додецилсульфат натрия, не позволяет обнаружить теафлавины в образцах. С другой стороны, использование элюента, в состав которого входит только борная кислота, не обеспечивает достаточного разделения этих веществ.
Показана возможность применения капиллярного электрофореза для определения флавоноидов в лекарственных растениях [106]. На основе полученных данных сделан вывод о природе антирадикальной активности ряда флавоноидов травы Solidaginis и листьев Morus nigra.
Простой вариант определения фенольных соединений в оливковом масле предложен в работе [48]. Примечательно то, что авторы предлагают в качестве элюента использовать боратный буфер с рН на уровне 9.5, однако, согласно данным литературы [84], фенольные соединения крайне не стабильны в щелочной среде. В некоторых случаях при увеличении рН буфера увеличивается степень ионизации молекул фенольных соединений и отрицательно заряженные соединения мигрируют к аноду, а не к катоду.
В работе [102] с помощью капиллярного электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии исследовали экстракты череды, календулы, пажитника и расторопши. В экстракте пажитника была обнаружена галловая кислота в количестве 0.1 мг/г и хлорогеновая кислота в календуле, расторопше и череде в количестве 0.5-0.8 мг/г. зз Китайскими учёными была предложена простая методика КЭ для определения эскулина и эскулотина в Cortex fraxini [107]. При изучении влияния уровня рН на разделение варьировали рН буферного раствора в диапазоне 4.5-8.5. Выбор диапазона обусловлен тем, что при значениях рН ниже 3.1 полностью ионизируются все исследуемые соединения, а в диапазоне 3.1-4.5 они разделяются лишь частично. При определении оптимального значения рН учитывали также влияние этого показателя на УФ сигнал ионизируемого соединения. Помимо УФ детекторов в капиллярном электрофорезе для обнаружения фенольных соединений используют электрохимические детекторы, более селективные, чувствительные, обеспечивающие высокую стабильность и воспроизводимость результатов. Wu Т. с сотрудниками [108] методом КЭ с амперометрическим детектором удалось обнаружить ряд флаваноидов в соке грейпфрута. Авторами было изучено влияние ряда параметров на эффективность разделения фенольных соединений: потенциал рабочего электрода, рН буферного раствора, напряжение и др. В работе [109] описано одновременное определение флаваноидов и антрахинонов в Chrysanthemum с помощью КЭ с амперометрическим детектором. В экстракте растения были обнаружены эмодин, апигенин, кэмпферол, лютеолин, реин. Пределы детектирования этих фенольных соединений находятся в диапазоне 1.0-2.1 г/мл.
Выбор оптимальных условий разделения фенольных соединений методом газовой хромато-масс-спектрометрии
Способы обнаружения фенольных веществ методом обращено-фазовой ВЭЖХ довольно разнообразны. Чаще всего их идентификацию и количественное определение осуществляют с помощью УФ-спектрофотометрических, электрохимических и масс-спектрометрических детекторов.
УФ-спектрофотометрическое детектирование. Спектрофотометри-ческое детектирование на основе диодной матрицы - наиболее распространенный способ идентификации и количественного определения фенольных соединений. Спектры поглощения различных классов фенольных соединений в ультрафиолетовой и видимой областях весьма специфичны: с их помощью возможно определение класса вещества и в дальнейшем его идентификация. Так, для флавонов характерны полосы в области 250-270 и 335-355 нм, для флаванолов - 250-260 и 360-380 нм, для изофлавонов - 250-260 и 300-330 нм, флаванонов - 280-290 и 320-330 нм, флаван-3-олов - 220-230 и 280 нм и для флаванонолов - 290-300 и 340-350 нм [5, 103].
Однако, несмотря на широкое распространение УФ-спектрофотометрического способа детектирования, с его помощью не всегда возможна достоверная идентификация фенольных веществ. Особенно это касается соединений, концентрация которых в пробе очень мала. Сложности при идентификации характерны и для флаванолов и их гликозидных форм. Гликозиды являются слабыми хромофорами, поэтому существенных отличий между гликозидной формой и гликозидом в спектре не наблюдается [103]. Известно также, что для некоторых фенольных соединений нижний предел обнаружения в ВЭЖХ-УФ может составлять до 10 нг [100]. Флуориметрическое детектирование. По чувствительности и точности УФспектрофотометрический детектор уступает флуориметрическому детектору. По утверждению ряда учёных [86, 141], преимуществом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием является возможность разделения олигомерных форм фенольных соединений и флаваноидов. Для оценки содержания процианидинов в порошке какао и шоколаде использовали ВЭЖХ-ФД [141]. Устанавливали длину волны возбуждения 276 нм и излучения - 316 нм.
В работе [142] для определения процианидинов использовали обращено-фазовый вариант ВЭЖХ. Детектирование осуществляли при 322 нм (длина волны возбуждения 276 нм). Предел определения процианидинов составил 12-16 мкг/л.
Интересный способ идентификации и определения предложен в работе [143]. Paulke А. с коллегами разработали ВЭЖХ-ЭХ методику для определения кверцетина, тамарикцетина и изорамнетина в экстракте зверобоя. В качестве подвижной фазы использовали смесь метанол -ацетонитрил - хлорацетатный буферный раствор. К элюату добавляли нитрат алюиминия. Образовавшиеся комплексные соединения алюминия с кверцетином, тамарикцетином и изорамнетйном детектировали при 485 нм (длина волны возбуждения 422 нм). Предел обнаружения для кверцетина составил 119 нг/г.
Gomez- Alonso S. с соавторами [144] удалось с помощью комбинированного метода ВЭЖХ-УФ-ФД обнаружить винограде и вине 9 гидроксикоричных кислот, 7 флаван-3-олов, 12 флаванолов, 2 стильбена и 15 процианидинов [144].
Электрохимическое детектирование. В некоторых случаях идентификация фенольных соединений с помошью ВЭЖХ-УФ может быть затруднена. Альтернативой спектрофотометрическим детекторам является электрохимический детектор. В работе [136] представлены результаты определения фенольных соединений в клубнике с помощью хроматографической системы, оснащенной кулонометрическим детектором. Для обнаружения соединений использовали матричный детектор, состоящий из восьми пористых графитовых электродов и палладиевых электродов сравнения.
Французские ученые [145] для обнаружения фенольных соединений также использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию с кулонометрическим детектором. Детектирование осуществляли с помощью аналитической ячейки, состоящей из двух пористых графитовых рабочих электродов, палладиевого электрода сравнения. Фенольные кислоты, за исключением кумаровой, салициловой и 4-гидроксибензойной кислот, характеризовались низким потенциало"м в области 100-400 мВ. Установлено, что чем больше заместителей в ароматическом кольце фенольного соединения, тем ниже его электрохимический потенциал.
По данным Robards К. и Antolovich М. [145], ВЭЖХ-ЭД позволяет одновременно идентифицировать до 27-ми фенольных соединений, при этом предел обнаружения составляет 1-10 нг/мл. Масс-спектрометрическое детектирование. Для идентификации и оценки содержания лабильных нелетучих фенольных соединений используют жидкостную хромато-масс-спектрометрию. Обычно в жидкостной хромато-масс-спектрометрии идентификацию фенольных соединений в анализируемой пробе осуществляют по параметрам удерживания стандартных веществ [147-148]. Однако, при отсутствии стандартных растворов фенольных соединений их идентификация возможна при сравнении масс-спектров (молекулярных и фрагментных ионов) неизвестных веществ с данными литературы, полученными в аналогичных условиях (способ и режим ионизации) [48, 51, 150]. Структуры фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях и продуктах питания в ЖХ-МС устанавливают посредством ионизации распылением в электрическом поле (или электроспрей, ЭС, ESI) и химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД, APCI). Ионизацию осуществляют как в отрицательном, так и в положительном режиме. Е. de Rijke [103] сообщает о возможности идентификции фенольных соединений с помощью ЖХ-МС на основе матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации (МАЛДИ, MALDI). По мнению W. Vermerris [6], наравне с ионизацией электрораспылением метод МАЛДИ незаменим при идентификации фенольных соединений. Суть данного метода состоит в лазерном облучении аналита, закрепленного на твердой матрице, и ионизации его фотонами. Достоинством метода является его сверхчувствительность (до фемтомоль вещества) и низкая фрагментация [151]. Химическая ионизация при атмосферном давлении основана на ионизации аэрозоля элюата под действием разряда или за счет взаимодействия молекул анализируемых веществ с Р-электронами [151]. Американские учёные с помощью ВЭЖХ-МС на основе химической ионизации при атмосферном давлении идентифицировали ряд фенольных соединений в клюкве [128].
Идентификация и определение фенольных соединений в тысячелистнике обыкновенном
Как видно из аналитического обзора, существует множество различных способов качественного и количественного определения фенольных соединений и флавоноидов в фотоматериалах. Качественные методы, как правило, в настоящее время используются для предварительной оценки содержания фенольных соединений или для контроля их экстракции.
Количественные методы определения фенольных соединений можно разделить на титриметрические, спектрофотометрические, электрохимические и хроматографические. Метод перманганатометрии очень прост в реализации, однако по данным авторов [28, 38], дает завышенные данные о содержании фенольных соединений в лекарственных растениях, что обусловлено окислением веществ не только фенольной природы, метод также не обеспечивает достоверности и воспроизводимости результатов из-за неопределенности конечного продукта. Спектрофотометрические методики экспрессны и просты в использовании, тем не менее, для определения фенольных соединений необходимо знать спектральные характеристики индивидуальных веществ и проводить предварительное разделение компонентов анализируемой смеси из-за близкого расположения максимумов поглощения. Широкие возможности для определения фенольных соединений открывают электрохимические методы. Согласно A. Blasco с соавторами [79], эти методы позволяют дифференцировать классы фенольных соединений (например, флавоноиды и фенолкабоновые кислоты). Помимо этого, с помощью электрохимических методов определяют антиоксидантную активность лекарственных растений, содержащих фенольные соединения. Однако с учетом необходимости анализа лекарственных растений на содержание индивидуальных фенольных соединений, титриметрические, спектрофотометрические и электрохимические методы не пригодны к использованию. Они позволяют определять суммарное содержание фенольных соединений и флавоноидов, с другой стороны, для фармакологии интерес представляют индивидуальные фенольные соединения. Хроматографические методы наиболее полно отвечают поставленной задаче определения индивидуальных фенольных соединений. Кроме того, с их помощью можно получать информацию о качественном составе растительного сырья без выделения веществ. Основными преимуществами тонкослойной хроматографии являются простота, экспрессность, доступность материалов и оборудования для анализа. По мнению Zhang Q. и Ye М. [91], тонкослойная хроматография обладает ограниченными возможностями разделения, однако успешно применяется как сканирующий метод (метод «отпечатков пальцев»). В последние годы тонкослойная хроматография вытесняется более точными и чувствительными методами - газовой, жидкостной хроматографией и капиллярным электрофорезом.
Капиллярный электрофорез используют при определении фенольных кислот и флавоноидов в фотоматериалах. Достоинствами метода являются высокая чувствительность метода, воспроизводимость результатов, высокая скорость анализа, низкий расход элюента. Однако эффективность разделения сложных образцов, содержащих фенольные соединения различных классов, с помощью электрофореза значительно ниже, чем в случае жидкостной хроматографии.
Одним из самых надежных методов определения индивидуальных фенольных соединений является высокоэффективная жидкостная хроматография. Благодаря возможности варьирования различных параметров жидкостная хроматография позволяет разделять фенольные соединения различных классов в пищевых продуктах, алкогольных и безалкогольных напитках, лекарственных растениях. Разделение осуществляют на колонках, заполненных силикагелем с привитыми группами С8, С12, С16, С18 и в редких случаях используют нормально-фазовый вариант [110-145]. Разделение веществ максимально при элюировании подвижной фазой состава вода - ацетонитрил (или метанол) - слабая кислота - соль слабой кислоты [87, 122, 144]. Ввиду сложности состава исследуемого образца чаще всего применяют градиентный режим элюирования.
Развитие приборно-аппаратурной базы в последние годы сделало возможным исследование лекарственных растений и пищевых продуктов с применением хроматографов, оснащенных высокоточными насосами, обеспечивающими стабильность хроматографического процесса, системами отбора проб, позволяющими осуществлять отбор даже микрообъемов образца (0.1 мкл), термостатами колонок с регулированием температуры до 0.1 С, обеспечивающими стабильность термодинамического процесса. Для обнаружения фенольных соединений в основном используют спектрофотометрические детекторы на основе диодной матрицы, позволяющие идентифицировать фенольные соединения не только по параметрам удерживания, но и спектральным характеристикам. Несмотря на высокую чувствительность, электрохимические детекторы используются реже [136, 145]. При отсутствии стандартов фенольных соединений альтернативой ВЭЖХ является жидкостная хромато-масс-спектрометрия (ЖХ-МС), с помощью которой возможно определение структуры фенольных соединений. Различные варианты ВЭЖХ-определения фенольных соединений систематизированы в табл. 3.
С помощью газовой хроматографии достигается разделение даже оптических изомеров фенольных соединений и агликонов флавоноидов. При анализе методом газовой хроматографии для увеличения стабильности веществ при воздействии температуры и увеличения летучести фенольные соединения дериватизируют, чаще всего силилирующим агентом БСТФА. Разделение осуществляют на капиллярных колонках с фенилзамещенным метилполисилоксаном в диапазоне 40-350С [161-174]. Газовая хромато-масс-спектрометрия предоставляет широкие возможности для идентификации неизвестных фенольных соединений и при отсутствии стандартных веществ или невозможности установления структуры методом жидкостной хроматографии позволяет идентифицировать фенольные соединения при использовании встроенных в программную оболочку хроматографа библиотек масс-спектров. Основные результаты определения фенольных соединений и агликонов флаваноидов обобщены в табл. 4.
