Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Глава 1. Ферментативные методы определения анионов 10
Определение фторид-ионов 12
Определение цианид-ионов 16
Определение фосфат-ионов 20
Определение тиоцианаг-ионов 26
Определение сульфид-ионов 27
Определение нитрат-ионов 28
Определение сульфит-ионов 29
Определение сульфат-ионов 31
Определение оксалат-ионов 32
Определение формиаг-ионов 36
Определение салицилаг-ионов 36
Глава 2. Применение флуориметрического метода для определения 39
среднеокисляемых субстратов пероксидазы - катехоламинов и их
метаболитов
Определение катехоламинов и их метаболитов по их собственной 41 флуоресценции
Определение катехоламинов и их метаболитов по флуоресценции 43 их производных
2.3. Хемилюминесцентное определение катехоламинов и их 48
метаболитов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 53
Глава 3. Исходные вещества, посуда, аппаратура, обработка результа- 53
тов измерений, методика эксперимента
Исходные вещества 53
Посуда, аппаратура 54
Методики эксперимента 55
Обработка результатов измерений 61
Глава 4. Ковалентная иммобилизация пероксидазы хрена на 63
модифицированных силикагелях - средство повышения её
стабильности и чувствительности методик определения ингибиторов
4.1. Выбор носителя для ковалентной иммобилизации пероксидазы 63
4.2. Оптимизация условий ковалентной иммобилизации пероксидазы 61 на модифицированных силикагелях
4.3 Свойства препаратов пероксидазы, иммобилизованной на 72 модифицированных силикагелях
4.4. Оптимизация условий проведения индикаторной реакции 75
окисления о-дианизидина пероксидом водорода для контроля
активности и стабильности иммобилизованной пероксидазы
4.5. Кинетические параметры индикаторной реакции, проводимой с 77
участием пероксидазы, иммобилизованной на модифицированных
силикагелях
Глава 5. Влияние неорганических анионов на каталитическую 85 активность иммобилизованной пероксидазы
Влияние фторид-ионов на каталитическую активность 85 иммобилизованной пероксидазы
Влияние цианид-ионов на каталитическую активность 89 иммобилизованной пероксидазы
Влияние тиоцианат-ионов на каталитическую активность нативной 91 и иммобилизованной пероксидазы
Совместное влияние неорганических анионов на каталитическую 94 активность иммобилизованной пероксидазы
Совместное влияние фторид- и цианид-ионов на 95 каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы
Совместное влияние цианид- и тиоцианат-ионов на 96 каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы
Глава 6. Определение неорганических анионов в водах и 98 биологических жидкостях с использованием иммобилизованной пероксидазы
Определение фторид-ионов в питьевых и минеральных водах 99
Определение цианид- и тиоцианат-ионов в крови 102
Определение тиоцианат-ионов в слюне 105
Глава 7. Применение нативной пероксидазы хрена для определения 106 катехоламинов и их метабоблитов
7.1 Ферментативное окисление допамина и гомованилиновой кислоты 107
в водных и водно-органических средах
7.1.1. Определение допамина по его собственной флуоресценции 109
и по его пероксидазному окислению в присутствии ДМСО
7.1.2. Определение гомованилиновой кислоты по ее перокси- 112
дазному окислению
7.2 Получение флуоресцирующих производных катехоламинов и их 115
метаболитов в присутствии пероксидазы
Выбор фермента для его применения в процессах 117 дериватизации катехоламинов
Оптимизация условий получения флуоресцирующих 126 производных катехоламинов и их метаболитов с дифенилэтилсндиамином и бензиламином
7.2.3. Разработка ферментативных методик определения 132
катехоламинов и их метаболитов по их флуоресцирующим
производным
7.3. Пути повышения чувствительности определения катехоламинов и 133 их метаболитов по их флуоресцирующим производным ферментативным методом
7.3.1. Определение катехоламинов и их метаболитов в средах 134
прямых мицелл ПАВ
Определение катехоламинов и их метаболитов с 143 использованием метода лазерной флуориметрии
Определение гомованилиновой кислоты в моче по 144 флуоресценции ее производного
Глава 8. Определение пероксидов в водных, водно-органических и 145 мицеллярных средах с использованием нативной пероксидазы
8.1. Определение органических пероксидов и пероксида водорода в 147
водных и водно-органических средах по пероксидазному окислению
ими флуоресцеина
8.2. Влияние ПАВ на катализируемую пероксидазой реакцию 154
окисления флуоресцеина пероксидом водорода и органическими
пероксидами в водных и водно-органических средах
8.3 Определение /я/?ет-бутилгидропероксида в оливковом масле 157
ВЫВОДЫ 161
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 163
Введение к работе
Актуальность работы. В последние годы большое внимание исследователей-аналитиков по-прежнему уделяется проблемам экологического мониторинга, конгроля качества пищевых продуктов и лекарственных средств и клинической диагностики. В связи с этим актуальна задача высокочувствительного определения неорганических и органических токсикантов (ионов тяжелых металлов, анионов, фенолов, ядохимикатов) и физиологически активных органических соединений (витаминов, гормонов) в объектах окружающей среды и медицины. В настоящее время разработано большое количество инструментальных методов определения таких соединений, однако все они не лишены недостатков с точки зрения чувствительности, селективности, простоты и длительности определения. Для решения этих проблем одним из перспективных направлений является применение биологических катализаторов - ферментов, поскольку большинство токсичных и физиологически активных веществ является либо их субстратами либо эффекторами. В то же время разработка ферментативных методик определения этих веществ часто ограничена малой доступностью, сложностью выделения, ограниченной субстратной специфичностью или низкой стабильностью препаратов ферментов.
Пероксидаза из корней хрена (ПХ) относится к одним из наиболее изученных и доступных ферментов класса оксидоредуктаз, обладающих групповой субстратной специфичностью и высокой каталитической активностью. Вследствие этого пероксидазу хрена широко используют для разработки ферментативных методик определения большого числа органических и неорганических веществ, являющихся ее субстратами и эффекторами. Однако перспективы дальнейшего использования ПХ в химическом анализе ограничены низкой стабильностью и активностью нативного фермента в агрессивных и органических средах. Одним из путей решения этой проблемы может быть переведение нагивного биокатализатора
Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической химии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова И.А. Веселовой за участие в постановке задач и обсуждении результатов.
в иммобилизованное состояние или включение в состав прямых и обращенных мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ). Варьирование природы и свойств носителя для иммобилизации фермента и природы ПАВ позволяет создавать препараты ферментов с заданными свойствами. Это позволяет расширить круг определяемых соединений за счет ограниченно растворимых в воде и средне окисляемых субстратов ПХ, сохранить активность ферментов в агрессивных средах, обеспечить стабильность биокатализаторов в среде органических растворителей, повысить чувствительность методик определения субстратов-флуорофоров за счет усиления аналитического сигнала. Все вышесказанное свидетельствует о далеко не исчерпанных возможностях использования пероксидазы хрена в целях химического анализа и перспективности проведения исследований в этой области.
Цель работы заключалась в разработке подходов к расширению возможностей использования нативной и иммобилизованной пероксидазы из корней хрена при определении ее ингибиторов (неорганических анионов), средне окисляемых субстратов-восстановителей (катехоламинов и их метаболитов) и ограниченно растворимых в воде субстратов окислителей (органических пероксидов).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
получить стабильные и активные препараты пероксидазы хрена, иммобилизованной на модифицированных силикагелях, выяснить чувствительность иммобилизованной ПХ к действию неорганических анионов (фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов), разработать спектрофотометрические чувствительные и селективные методики их определения в пищевых продуктах и биологических жидкостях;
изучить возможность применения нативной пероксидазы для определения ее средне окисляемых субстратов - катехоламинов и их метаболитов с флуориметрическим контролем скорости индикаторных реакций, проводимых в водной, водно-органической средах и в присутствии ПАВ;
показать возможность применения нативной ПХ для определения ее ограниченно растворимых в воде субстратов-окислителей (на примере трет-бутш-
гидропероксида, 2-бутанонпероксида) в среде органических растворителей и прямых мицелл ПАВ.
Научная новизна. Получены активные и стабильные во времени препараты фермента ПХ, иммобилизованной на силикагелях, модифицированных тиоцианатными, изотиоцианатными, эпоксидными и амино-группами с различной длиной углеводородного радикала, связывающего молекулы фермента с носителем. Установлено, что характер влияния ингибиторов (фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов) на каталитическую активность иммобилизованной ПХ зависит от конформационной подвижности активного центра фермента и от времени инкубирования иммобилизованного биокатализатора с ингибитором.
Предложено применение нативной ПХ в среде ДМСО и прямых мицелл цетилтриметиламмоний бромида (ЦТМА) в качестве более эффективного катализатора процессов дериватизации ее средне окисляемых субстратов -катехоламинов (допамина, адреналина, серотонина, добутамина, метилдопы) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) с 1,2-л*езо-дифенил-этилендиамином (ДЭД) и бензиламином (БА) по сравнению с неорганическими катализаторами. Показано, что проведение процессов дериватизации катехоламинов и их метаболитов с БА в присутствии ПХ, включенной в состав прямых мицелл ЦТМА, обеспечивает стабилизацию интенсивно флуоресцирующих дериватизатов. Этот эффект использован для улучшения метрологических характеристик ферментативных методик определения гормонов (адреналина и допамина) и их метаболитов (гомованилиновой кислоты).
Показано, что введение 85 об.% ДМСО в катализируемую ПХ реакцию окисления флуоресцеина пероксидом водорода и органическими пероксидами, приводит к значительному усилению его хемилюминесценции вследствие увеличения концентрации растворенного кислорода, что в свою очередь повышает выход реакции образования синглетного кислорода под действием пероксидазы.
Практическая значимость работы. На основе полученных препаратов пероксидазы хрена, ковалентно иммобилизованной на модифицированных силикагелях, разработаны методики определения ее неорганических ингибиторов (фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов). Методики апробированы в анализе питьевых вод и биологических (кровь, слюна) объектов. Разработаны
высокочувствительные и селективные методики определения ряда катехоламинов (допамина, адреналина, добутамина, метилдопы) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) - субстратов-восстановителей пероксидазы с использованием ее ассоциатов с катионным ПАВ — цетилтриметил-аммонийбромидом (ЦТМА). Методика определения гомованилиновой кислоты апробирована в анализе биологической жидкости (моче). Разработаны высокочувствительные методики определения ограниченно растворимых в воде субстратов-окислителей пероксидазы — органических пероксидов (трет-бутил-гидропероксида, 2-бутанонпероксида) в средах с высоким содержанием полярного органического растворителя ДМСО, которые были использованы в анализе водонерастворимого объекта - оливковом масле. Автор выносит на защиту:
способы получения высокостабильных и активных препаратов ПХ, ковалентно иммобилизованной на силикагелях, модифицированных тиоцианатными, изотиоцианатными, эпоксидными и амино-группами, а также флуоресцирующих производных катехоламинов (допамина, адреналина) и их метаболитов;
результаты изучения кинетики окисления пероксидом водорода о-дианизидина и катехоламинов (допамина и адреналина), катализируемого иммобилизованной и нативной пероксидазой соответственно;
сведения о химизме процессов дериватизации катехоламинов с лгезо-1,2-дифенил-этилендиамином и бензиламином, катализируемой нативной пероксидазой;
данные о влиянии параметров среды (рН, природы ПАВ и состава растворителя) на эффективность взаимодействия ПХ с ее субстратами и ингибиторами;
- методики определения ингибиторов (неорганических анионов), субстратов-
восстановителей (катехоламинов и их метаболитов) и субстратов-окислителей
(органических пероксидов), апробированные в анализе реальных объектов:
биологических жидкостей, питьевых вод, пищевых продуктов.
