Введение к работе
Актуальность. Важной задачей химического анализа является определение микроколичеств таких токсичных ионов металлов, как ртуть(ІІ), кадмий(ІІ), а также висмуга(Ш) в самых разных объектах -окружающей среды, продуктах питания, медицинских препаратах.
В связи с этим одна из актуальных проблем аналитической химии -разработка высокочувствительных, селективных и в то же время простых и экспрессных методов определения указанных выше ионов металлов и некоторых их соединений, таких, например, как ртутьорганические соединения.
В этих целях целесообразно использовать биологические катализаторы - ферменты. Их высокая каталитическая активность дает возможность определять очень малые количества многих веществ, в том числе и ионов металлов.
Следует отметить при этом, что определите многих веществ,-влияющих на каталитическую активность ферментов, - их эффекторов, к которым в большинстве случаев и относятся ионы металлов, не является селективным. Одним из способов повышения не только чувствительности, но и селективности методов определения ионов металлов является использование одновременно с ионами металлов некоторых органических эффекторов.
Для разработки ферментативных методов определения ртути(ІІ), кадмия(ІІ), висмута(Ш) была выбрана пероксидаза хрена, так как это доступный, относительно дешевый, промытленно выпускаемый фермент. Было показано ранее, что ртуть(ІІ), кадмий(ІІ), висмут(ІІІ) оказывают интибярующее влияние на лсроксидазу, усиливающееся в присутствии некоторых серосодержащих соединений.
Иммобилизованная пероксидаза для определения эффекторов ранее не использовалась. В то же время известно, что иммобилизация ферментов позволяет удешевить и упростить анализ, создавать на основе иммобилизованных ферментов тест-устройства.
Цель настоящей работы - на основе изучения индивидуального и совместного действия ионов ртуги(И), кадмия(П), висмута(Ш),
і
ртутьорганических соединений и серосодержащих веществ на нативную пероксидазу разработать высокочувствительные и селективные методы определения указанных выше соединений; разработать также тест-методы определения ртути(Н) с использованием иммобилизованной пероксидазы. Научная новизна заключается в том, что
- на примере пероксидазного окисления ароматических диаминов
показана целесообразность изучения совместного действия двух
эффекторов (ионов ртути(ІІ), кадмия(ІІ), висмута(ИІ) или
ртутьорганических соединений с одной стороны и серосодержащих веществ с другой стороны) на каталитическую активность фермента в целях разработки чувствительных и селективных методов их определения;
установлено, что характер действия одного и того же эффектора (иона металла или ртутьорганического соединения) в зависимости от природы второго эффектора (серосодержащего вещества) может быть различным. Так, различные серосодержащие соединения могут усиливать ингибирующее действие металлов; ионы металлов в свою очередь могут изменять характер действия серосодержащего вещества, выступающего в роли второго субстрата пероксидазы; а введение в ферментативную систему метилртути приводит к либеративному эффекту, т.е. к ослаблению иітібирующсго действия на пероксидазу ряда серосодержащих соединений;
различное действие серосодержащих соединений использовано для повышения чувствительности и селективности определения ионов ртути(ІІ), кадмия(ІІ), висмута(ІІІ);
изучено влияние на пероксидазу разных форм ртути(ІІ), в частности, ртутьорганических соединений, в реакциях окисления ароматических диаминов в отсутствие и присутствии серосодержащих веществ; разработаны методы определения метил-, этил- и фенилртути;
предложен новый способ иммобилизации пероксидазы хрена с использованием хитозана;
-иммобилизованная пероксидаза использована для
высокочувствительного определения ртути(ІІ);
- для высокочувствительного и селективного определения ионов желеаа(Ш) использовано его реактивирующее действие на апофермент пероксидазы хрена.
Практическую ценность имеют разработанные с использованием реакций пероксидазного окислеїшя о-дішшзидіша, о-фешілендиаміша, о-толидюіа, 3,3',5,5'-'гетраметилбснзидіша фермешатшшые методы:
определения ртута(ІІ) (Ся=0,1ш,/мл) и кадмия(Ц) (С,л=0,05мкг/мл) по их ингибирующему действию на каталитическую активность пероксидазы в присутствии тиомочевины и диэтилдитиокарбамшгата натрия (ДЭДТК Соответственно;
определеїшя ішсмута(Ш) и ртугьорганических соедшшпиі по их действию на продолжительность индукционного периода в присутствии ДЭДТК и нативной пероксидазы с С„ 0,05 мкг/мл и 0,05 -0,1 мкмоль/л соответственно;
полуколичественного определения на уровне 0,1 мкмоль/л металртути по ее либеративному действию на ингибиторы пероксидазы -фенилтиомочешпгу и датютреитол;
определения ряда органических кислот (Сн=10 пмоль/л-0,01ммоль/л), цистеина (0,=0,1 мкмоль/л), хлористого тиофсяола (Сн=Ю,1іскмоль/л), а также фторид- и циашад-ионов с С„ 500 и 0,8 нмоль/л соответствашо по их ингибирующему действіпо на активность пероксидазы;
определения ионов железа(Ш) (Сн=10 пг/мл) по его реактивирующему действию на катишгуїо псроксидазу хрена, предварительно кнгабировашіую салициловой кислотой;
- определения ионов ртути(ІІ) (С„= 0,1 пг/мл - 0,01 нт/мл) по их
ішгибирующему действию на псроксидазу, иммобилнзовашг/ю в хотозанс
в ячейках полистирольного планшета и из бумагах.
Разработаны методики определения микроколичеств ионов ртути(ІТ) на уровне ПДК с использовашіем нативной пероксидазы в природной воде в присутствии больших количеств жслсзз(ІІІ); кадмия(ІІ) в почве; ионов желсза(ІІІ) в особо чистой воде.
На основе пероксидазы, иммобилизованной в хитозане в ячейках полистирольного планшета, создано и промышлетшо выпускается тест-устройство для определения микроколичеств ртути(ІІ) в природных водах.
Автор выносит на защиту:
-
Результаты изучения индивидуального и совместного действия на процесс лероксидазного окисления о-дианизидина ионов ртути(ІІ), хадмия(П), висмута(ІІІ), ртутьоргаїшческих соединений и серосодержащих ингибиторов. Механизмы индивидуального влияния на фермент указанных выше веществ и предположения о причинах их совместного действия.
-
Ферментативные методы:
- определения ионов ртути(ІІ)і кадмия(ІІ), основанные на их
ингабирующем действии на активность нативной пероксидазы в реакции
окисления ароматических аминов в присутствии тиомочевины и ДЭДТК с
0,0,01 нг/мл и 0,05 мкг/мл соответственно;
- определения висмута(Ш) и глутьорганических соединений (метил-,
этил- и фенилртути) по изменешпо величины индукционного периода в
присутствии ДЭДТК ( 0,=0,05 мкг/мл; 0,1; 0,5; 1 мкмоль/л
соответственно);
- определения (10 гшоль/л - 0,01 ммоль/л) органических кислот,
цистеина (Сл=0,1 мкмоль/л), хлористого тиофенола (Сн= 0,1 мкмоль/л),
фторид- (0,5 мкмоль/л) и цианид- (0,8 нмоль/л) ионов по их
штібирукядему действию на псроксвдазу;
- тест-метод определения микроколичеств ртути(ІІ) по се
ингибируюіцему действию на псроксвдазу, иммобилизованную в ячейках
полистирольного планшета ( Сн= 0,1 - 50 пг/мл ) и на бумаге (Сц = 0,01-
0,04 нг/мл).
-
Ферментативные методики определения: ртути(ІІ) в подземной воде; кадмия(И) в почве; железа(ІІІ) в особо чистой воде.
-
Способ иммобилизации пероксидазы в хитозан с использованием носителей - полистирола и бумаг.
5. Тест-устройство для определения микроколичеств ртути(ІІ) в
природных водах.
Апробация работы. Основные результаті,! работы доложены на IV Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (г. Москва, 1991 г), Вссроссиііской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-94" (г. Краснодар, 1994 г), II Международном симпозиуме по аналитическим наукам (Швейцария, Монтрё, 1994 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 рзбот в виде статей и тезисов. Получен патент РФ и положительное решение на заявку на патент.
Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава I),
экспериментальной части (главы И-К), выводов и списка литературы.
Диссертационная работа изложена на страшщах машинописного
текста, содержит 97 рисунков, 31 таблицу и библиографию из 166 названий.
