Содержание к диссертации
Введение
1. Основные сведения об длкогольдегидрогеназе из печени лошади 6
1.1. Структура алкогольдегидрогеназы из печени лошади 8
1.2. Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы из печени лошади 18
1.3. Коферментная функция НАДГ" (НАДН) 21
1.4. Механизм действия алкогольдегидрогеназы из печени лошади 26
2. Эффекторы алкогольдегидрогеназы из печени лошади 36
2.1. Влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ ионов тяжелых металлов и органических реагентов, взаимодействующих с сульфгидрильными (SH-) группами фермента 37
2.2. Влияние неорганических анионов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из печени лошади 38
2.3. Влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ органических реагентов, образующих комплексные соединения с каталитическим цинком фермента 42
2.4. Влияние жирных кислот и их амидов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из печени лошади 46
2.5. Влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ ацетилирующих реагентов 49
2.6. Влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ аналогов субстрата и кофермента 52
2.7. Влияние на каталитическую активность АДГ лекарственных препаратов 54
3. Способы получения и реактивации различных апоферментов 56
4. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика эксперимента, обработка результатов измерений 64
4.1. Исходные вещества 64
4.2. Посуда, аппаратура 67
4.3. Методика эксперимента 68
4.4. Обработка результатов измерений 69
5. Обоснование выбора фермента и индикаторной реакции; оптимизация условий ее проведения 69
6. Влияние на каталитическую активность адг из печени лошади неорганических ингибиторов 76
6.1. Влияние ионов тяжелых металлов на каталитическую активность АДГ из печени лошади 76
6.2. Тип ингибирования алкогольдегидрогеназы из печени лошади ртутью(И) 90
6.3. Определение ртути(11), серебра(1), цинка(П) и олова(ІУ) по их ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу из печени лошади 94
6.4. Влияние некоторых неорганических анионов на каталитическую активность АДГ из печени лошади 96
7. Влияние на каталитическую активность адг из печени лошади органических производных ртути и олова 99
7.1. Влияние метилртути на каталитическую активность АДГ из печени лошади 100
7.1.1 Определение метидртути по ее ингибиругощему действию на алкогольдегидрогеназу из печени лошади 103
7.1.2. Чип ингибирования алкогольдегидрогеназы метилртутью 105
7.2. Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади метил-, диметил- и триметилолова 110
7.2.1. Тип ингибирования алкогольдегидрогеназы метилоловом 115
8. Влияние на каталитическую активность адг различных органических веществ 118
8.1. Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади карбоновых кислот 11.8
8.1.1. Влияние на АДГ из печени лошади предельных неразветвленных одноосновных карбоновых кислот (Сз-С]б) 120
8.1.2. Возможные причины влияния жирных кислот на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из печени лошади 129
8.1.3. Тип ингибирования алкогольдегидрогеназы из печени лошади масляной кислотой 133
8.1.4. Влияние некоторых двухосновных карбоновых кислот на активность АДГ из печени лошади 135
8.1.5. Влияние некоторых жирных кислот на активность АДГ из пекарских дрожжей 140
8.1.6. Определение янтарной кислоты в лекарственных растениях 145
8.2. Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади ряда аминокислот 149
8.2.1 Определение пролина, триптофана и гистидина по их ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу из печени лошади 156
8.2.2. Тип ингибирования алкогольдегидрогеназы триптофаном 158
8.3. Влияние азотсодержащих органических соединений на каталитическую активность АДГ из печени лошади 160
8.3.1 Определение азотсодержащих соединений по их ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу из печени лошади 171
8.3.2. Возможные причины влияния азотсодержащих органических соединений на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы 174
9. Получение и реактивация апофермента адг из печени лошади 180
9.1. Выбор лиганда и условий для получения апоалкогольдегидрогеназы из печени лошади 180
9.2. Изучение влияния цинка(П) на псевдоапо-алкогольдегидрогеназу из печени лошади, полученную с использованием 1,10-фенантролина 187
9.3. Влияние ионов металлов на псевдоапо-алкогольдегидрогеназу из печени лошади, полученную в присутствии 1,10-фенантролина 190
9.4. Получение истинного апофермента алкогольдегидрогеназы и его реактивация ионами цинка и кобальта 198
9.4.1 Получение апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием 1,10-фенантролина 199
9.4.2. Получение апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием 2,6-дипиколиновой кислоты 204
Заключение 208
Выводы 209
- Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы из печени лошади
- Влияние неорганических анионов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из печени лошади
- Посуда, аппаратура
- Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади метил-, диметил- и триметилолова
Введение к работе
Актуальность. Сочетание высокой чувствительности и селективности ферментативных методов анализа с экслрессностью и простотой их аппаратурного оформления и методики эксперимента обусловливает все более активное привлечение этих методов для решения задач мониторинга окружающей среды и определения улътрамалых количеств веществ в разных отраслях промышленности, медицине и биохимии.
Исследования, проведенные на кафедре аналитической химии МГУ, наглядно показали, что перспективным приемом направленного изменения метрологических характеристик ферментативных методов определения неорганических и органических веществ, а также расширения круга применяемых для этой цели биокатализаторов является использование препаратов одних и тех же ферментов, выделенных из разных источников. Различная чувствительность таких препаратов ферментов к действию одних и тех же эффекторов позволяет разрабатывать методики их определения с отличающимися аналитическими характеристиками и, следовательно, целенаправленно выбирать определенные препараты ферментов для решения конкретных задач.
Вышесказанное свидетельствует об актуальности настоящего исследования, целью которого является сопоставление возможностей использования алкогольдегидрогеназ, выделенных из различных источников -печени лошади и пекарских дрожжей, в химическом анализе для определения их неорганических и органических ингибиторов и металла-кофактора - Zn(Il).
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
-» исследовано влияние на каталитическую активность
алкогольдегидрогеназы (АДГ) из печени лошади неорганических (ионов тяжелых металлов) и металлоорганических (метилпроизводных ртути и олова) соединений;
—> изучено действие на активность алкогольдегидрогеназы из печени лошади органических соединений различных классов (одно- и двухосновных насыщенных неразветвленных карбоновых кислот, аминокислот и
азотсодержащих гетероциклических соединений; -> с целью разработки методики определения кофактора (Zn(0)) изучена возможность получения апо-АДГ из печени лошади и ее реактивации ионами металла-кофактора и других металлов;
-» на основе сравнительного анализа полученных результатов и литературных, данных о влиянии тех же соединений на каталитическую активность АДГ из пекарских дрожжей выявлены ингибиторы, для определения которых целесообразно использовать алкогольдегидрогеназу из одного или другого источника.
Научная новизна заключается в том, что
—> установлены степени и тип ингибирующего действия на каталитическую активность АДГ из печени лошади ряда ионов тяжелых металлов, в частности Hg(II), Ag(I), Zn(II) и Sn(TV),
—> выявлено ингибирующее влияние на АДГ из печени лошади металлоорганических соединений - метилпроизводных ртути(И) и олова(1У); показано, что ингибирование АДГ из печени лошади ртуть- и оловоорганическими соединениями реализуется по аналогичному типу;
—> установлено, что высшие одно- и двухосновные карбоновые кислоты ингибируют только АДГ из печени лошади; а низшие жирные кислоты ингибируют (по полностью конкурентному типу) активность обеих АДГ;
—> показано ингибирующее действие на АДГ из печени лошади ряда аминокислот (гистидина, триптофана, про ли на, цистеина), а также азотсодержащих гетероциклических соединений (1,10-фенантролина, 1,2,3-бензотриазола, 2,6-дипиколиновой кислоты и 2,2'-дипиридила);
—> на примере ионов ртути(П), метилртути и триптофана продемонстрирована идентичность механизмов действия ионов металлов, металлоорганических соединений и аминокислот на активность алкогольдегидрогеназ, выделенных из печени лошади и пекарских дрожжей;
-> на примере определения ряда наиболее эффективных ингибиторов
фермента (некоторых жирных кислот, ионов металлов, аминокислот,
азотсодержащих гетероциклических соединений) показана
целесообразность применения алкогольдегидрогеназы из печени лошади в химическом анализе; —> изучена возможность получения апо-алкогольдегидрогеназы из печени лошади с использованием различных комплексообразующих реагентов и ее реактивации ионами металлов;
—> высказаны предположения о структурных особенностях АДГ, выделенных из различных источников, обусловивших их разную чувствительность к действию одних и тех же ингибиторов.
Практическую значимость имеют разработанные на основе ингибирующего действия на АДГ из печени лошади методики определения
-> ртути(П) и цинка(П) в водах на уровне ПДК (сц = 0.05 мкг/мл, sr - 0.02);
-> метилртути (сн = 1 мкМ, sr = 0.03);
—> аминокислот - пролина, триптофана, гистидина (сн - 0.01 мМ, sr - 0.06,
0.05 и 0.06 соответственно); -> 1,2,3-бензотриазола (сн = 0.5 мкМ, sr = 0.03) и 2,6-дипиколиновой кислоты
(сн = 1 мкМ,5л = 0.05); — жирных кислот: одноосновных - пропионовой (сц = 0.5 мМ, sr - 0.01),
масляной (сн = 0.7 мМ, $г = 0.02), валериановой (сн = 0.05 мМ, sr = 0.02),
капроновой (сн = 0-05 мМ, sr - 0.03), пеларгоновой (сн = 0.01 мМ, sr = 0.02),
каприновой (сн ~ 5 мкМ, sr = 0.03),
и двухосновных - янтарной (сн = 0.1 мМ, sr = 0.02), глутаровой (сн = 0.05
мМ, sr = 0.03), себациновой (сн = 1 мкМ, sr = 0.03).
Автор выносит на защиту:
—> результаты изучения влияния на каталитическую активность АДГ из
печени лошади в реакции окисления этанола
никотинамидадениндинуклеотидом различных неорганических и металлоорганических соединений с целью разработки методик определения наиболее эффективных ингибиторов, для получения сведений о различиях в доступности сульфгидрильных групп ферментов,
—> выделенных из различных источников - печени лошади и пекарских дрожжей;
—> результаты исследования влияния различных жирных кислот и аминокислот на активность АДГ из печени лошади, обосновывающие целесообразность применения этого фермента в химическом анализе;
—> результаты изучения влияния на активность АДГ из печени лошади
различных азотсодержащих гетероциклических соединений,
демонстрирующие различную доступность и химическую форму металла-кофактора двух алкогольдегидрогеназ;
-> данные о получении и реактивации апофермента АДГ из печени лошади, характеризующие значительно большую доступность т.н. структурного цинка в молекуле этого фермента по сравнению с АДГ из пекарских дрожжей;
—> сравнительный анализ возможностей использования алкогольдегидрогеназ, выделенных из печени лошади и пекарских дрожжей, для определения различных неорганических и органических соединений.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VII Всероссийской конференции "Органические реагенты в аналитической химии" (Саратов, 1999), Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000), VII Международном симпозиуме "Kinetics in Analytical Chemistry" (Румыния, 2001), Конференции молодых ученых "Ломоносов-2002", Международной конференции "Biocatalysis. Fundamentals and Application" (Москва, 2002), Международном форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2003), Международном симпозиуме "Euroanalysis XIII" (Испания, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 7 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 237 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (главы 1-3), экспериментальной части (главы 4-9), заключения, выводов, списка литературы,
включающего 231 наименование, и приложения; содержит 63 рисунка, 50 таблиц, 1] схем.
Обзор литературы
Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы из печени лошади
АДГ обладает весьма широкой субстратной специфичностью. Фермент катализирует превращение большого количества первичных и вторичных, а также ароматических, циклических и алифатических спиртов (табл. 2). Однако третичные спирты (такие, как трет-бутанол и трет-пентапол), изопропанол и полициклические спирты субстратами этого фермента не являются. АДГ катализирует окисление не только перечисленных соединений, но и витамина А, н-нитробензилового спирта, этиленгликоля [16]. Алифатические и ароматические альдегиды, ароматические кетоны восстанавливаются в присутствии АДГ крайне медленно [16] (табл. 3). АДГ из печени лошади не является специфичным ферментом по отношению к таким оптически активным субстратам, как бутан-2-ол, октан-2-ол и гексан-Зол [39]. Для объяснения подобного явления авторы провели ряд экспериментов по исследованию кинетики окисления НАД+ (+) и (-)-изомеров н-алкилкарбинолов. Показано, что константа Михаэлиса в реакции окисления спиртов уменьшается с увеличением длины алкильной цепи в их ряду, т.е. сродство гидрофобного центра (комплекса АДГ-НАД ) к алкильной группе возрастает с увеличением размера последней. Недостаточно высокая специфичность АДГ из печени лошади по отношению к вторичным спиртам может быть объяснена тем, что оба заместителя у асимметрического атома углерода в таких спиртах являются простыми алкилами, и гидрофобный центр фермента способен соединяться с различными по размеру алкильными группами. По-видимому, это и обеспечивает реакционноспособную ориентацию фермента как для (+), так и (-)-изомеров. На субстратную специфичность АДГ влияют не только стерические факторы или различное сродство алкильных групп к гидрофобному центру, но и различные кислотные свойства спиртов. Так, первичные спирты обладают более кислотными свойствами, чем вторичные, вследствие чего последние являются лучшими субстратами фермента и окисляются намного быстрее. Кроме того, различие в скорости превращения первичных и вторичных спиртов обусловлено различным механизмом их окисления. Так, скорость окисления первичных спиртов определяется скоростью диссоциации комплекса {АДГ-НАДН}. Скорость окисления же вторичных спиртов лимитируется стадией образования тройного комплекса {АДГ-НАД+ субстрат}.
Доказательством этого является тот факт, что 2-метил-пропан-1-ол с разветвленной цепочкой углеродных атомов является худшим субстратом для АДГ из печени лошади по сравнению с пропан-1-олом. В то же время в ряду неразветвленных спиртов константа Михаэлиса уменьшается с ростом длины углеродной цепи субстрата. Вследствие этого, бутан-2-ол - лучший субстрат, чем пропан-2-ол [40]. 1.3. Коферментная функция НАД+ (НАДН) Известно, что коферментами в реакции, катализируемой АДГ из печени лошади, являются р-НАД и диамино-НАД+; при этом активность ТПН (трифосфопиридиннуклеотид) составляет лишь одну сотую активности (3-НАД ; а-НАД+ коферментом не является. Согласно данным табл. 4, АДГ проявляет наибольшую специфичность по отношению к 3-изобутириловым и тиоамидным аналогам. Относительная активность АДГ из печени лошади с различными аналогами НАД " может меняться в зависимости от концентраций реагентов в реакционной смеси. Из табл. 5 видно, что минимальное значение константы Михаэлиса процесса окисления НАД+ соответствует рН 8.0, в то время как для реакции восстановления НАДН минимальное Км достигается при рН 7.0 [41]. Роль никотинамидадениндинуклеотида как кофермента в катализируемых АДГ реакциях окисления (восстановления) субстратов была показана в работе [34]. Авторы установили, что образование комплекса между АДГ и НАД (или НАДН) стабилизирует связывание неионизованного спирта (или альдегида) посредством гидрофобных кофермент-субстратных взаимодействий, в результате чего наблюдается синергизм связывания кофермента и субстрата. Кристаллографическим методом получены доказательства дегидратации обширной области активного центра фермента в процессе образования тройного комплекса, что подтверждает, в свою очередь, предположение об определяющей роли гидрофобных взаимодействий при связывании АДГ как с субстратом, гак и с коферментом. Согласно рис. 9 [34], кофермент формирует систему переноса водорода, включающую гидроксильную группу спирта, связанного с каталитическим цинком, через водородные связи с участием Ser-48 (аминокислотного остатка в активном центре фермента), имидазольного кольца His-51 и никотинового фрагмента кофермента [42,43]. Таким образом молекула воды, связанная с Ser-48, является кислотно-основным катализатором и выступает в качестве донора протонов для кофермента [44]. При восстановлении альдегидов подобное явление не наблюдается. В работе [34] утверждается также, что совместное действие каталитического цинка в активном центре фермента и НАД+ обеспечивает присоединение субстрата преимущественно в виде алкоголят-иона, в то время как вода, связанная с каталитическим цинком, остается ненонизованной в субстрат-связывающих центрах фермента.
Авторами работы [32] показано, что кофермент ответственен за депротонирование системы "каталитический цинк - связанная с ним вода" (рис. 10). Авторами [45] была изучена коферментная функция семи аналогов НАД+, модифицированных по никотиновой группе, с АДГ из печени лошади. Индивидуальные эффекты замещения и взаимодействий между аналогами НАД+, ферментом, ДМСО и ионами цинка были изучены с помощью расчетных методов. Показано, что реакционная способность аналогов НАД4" коррелирует с геометрией размещения их пиридиновой части в активном центре фермента. В работе [46] были получены 5-мети л- и З-циано-5-мстил-никотинамидадениндинуклеотиды. Было изучено их взаимодействие с АДГ из печени лошади и показано, что с этими аналогами кофермента биокатализатор не проявляет своей активности. Авторами был сделан вывод о невозможности участия в катализе аналогов НАД, содержащих заместитель в положении 5. Как показано в работе [47], АДГ из печени лошади, в отличие от прочих дегидрогеназ проявляет существенно меньшую (в 3-4 раза) каталитическую активность с НАД, модифицированным полиэтиленгликолем. Авторами отмечается, что причинами этого явления следует считать не только стерические затруднения, возникающие при введении в молекулу кофермента громоздкого заместителя, но и внесение существенных изменений в структуру каталитически активных комплексов с ферментом и субстратом, а также в процесс переноса гидрид-иона. Существует большое количество схем, отражающих механизм действия АДГ из печени лошади. Рассмотрим некоторые из них. В работе [39] предложен механизм "тройного комплекса" или "одиночного смещения" (схема 1), согласно которому и субстрат, и кофермент одновременно связываются с ферментом, и перенос гидрид-иона происходит непосредственно внутри тройного комплекса. Следует отметить, что данный механизм имеет три частных случая (табл. 6). Один из частных случаев - механизм "быстрого равновесия произвольного порядка", в котором двойные и тройные комплексы находятся в равновесии, а скорость-лимитирующим является процесс взаимопревращения тройных комплексов. Если скорость-лимитирующим является процесс распада не тройных, а двойных комплексов, то механизм реакции идентичен тому, который впервые для АДГ из печени лошади предложили Теорелл и Чане [48]. Этот механизм, как видно из табл. 6, справедлив при условии, когда к «к,кг и Авторы [39] приводят доказательства в пользу каждого варианта механизма действия алкогольдегидрогеназы. Например, катализ алкогольдегидрогеназой в системах этанол - ацетальдегид и бутанол -бутиральдегид происходит по механизму Теорелла - Чанса [40]. Вонг и Хайнс [49] предложили другой вариант механизма принудительного порядка (схема 2). Согласно их гипотезе, существование комплексов {фермент-субстрат} может быть наглядно доказано методом изотопного обмена, а также частичным субстратным ингибированием фермента. Однако образование таких комплексов не является скорость-лимитирующим процессом в катализируемой АДГ реакции.
Влияние неорганических анионов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из печени лошади
Известно, что АДГ из печени лошади ингибируют галогениды [20,68,69], цианид- [20,65], перхлорат-, сульфат-, тиосульфат-, тиоцианат-, нитрат- и сульфит-ионы [20]. По-видимому, их ингибирующее влияние связано с тем, что они препятствуют присоединению НАД4" и НАДН к АДГ. Для подтверждения этой гипотезы авторы работы [68] изучили взаимодействие хлорид-иона с НАДН и комплексами {Е-НАДН}, {Е-НАД } и {Е-НАДН-изобутирамид}. Установлено, что хлорид-ионы при их концентрации до 1М не вызывают изменений в интенсивности флуоресценции двойных комплексов. Однако интенсивность флуоресценции НАДН в присутствии хлорид-ионов увеличивалась на 10-20%, На основании этого авторы [68] сделали вывод, что фермент содержит несколько различных центров присоединения хлорид-ионов, и поэтому последние способны приводить к конформационным изменениям в молекуле белка. Однако имеющиеся в литературе сведения о характере влияния хлорид-ионов на каталитическую активность фермента весьма противоречивы. Так, в работе [68] показано, что скорость реакции окисления этанола НАД-, катализируемой АДГ из печени лошади, увеличивается втрое в присутствии 50 мМ раствора хлорид-ионов. При этом сведения, имеющиеся в других работах [70,71] указывают либо на обратный эффект, либо на полное его отсутствие. Так, к примеру, авторами [69] показано, что хлорид-ионы не оказывают влияния на каталитическую активность АДГ из печени лошади вплоть до их концентрации ТОМ. В работе [72] отмечается понижение каталитической активности АДГ из печени лошади в присутствии род анид-иона в диапазоне концентраций 0.2-0.5М. Авторы предполагают, что причиной такого эффекта может быть изменение конформации молекулы фермента при присоединении SCN", усиливающееся с ростом концентрации последнего. При этом выдвигается гипотеза, что роданид-ион связывается не с каталитическим ионом цинка (II), а с остатком Arg-47 анион-связывающего центра. Весьма подробно действие нескольких неорганических анионов (табл.8) изучено в работах [70,71]. Было показано, что присоединение этих ионов к АДГ из печени лошади предотвращает ассоциацию фермента как с НАД ", так и с НАДН, что, по мнению авторов, является неоспоримым доказательством образования этими ионами комплекса с каталитическим цинком. Интересно, что образование тройных комплексов {АДГ-кофермент-ингибитор} возможно в присутствии цианат-, фторид- и бромид-ионов, но не наблюдается в случае крупных бидентантных лигандов.
Таким образом, если небольшие заряженные ингибиторы способны координироваться с каталитическим цинком, то при ассоциации с коферментом цинк способен связывать небольшие монодентантные лиганды (в том числе имидазол), но не крупные бидентантные. Тем не менее, и те, и другие проявляют большее сродство к свободному цинку активного центра Авторы [65] исследовали ингибирующее влияние на каталитическую активность фермента комплексных анионов Pt(CN)42 и Au(CN)2 и показали, что в диапазонах концентраций (0.2-2.0) мМ и (0.4-10) мМ эти ионы взаимодействуют с субъединицей фермента в соотношениях 1:1 и 2:1 соответственно. Причем Pt(CN)42 и Au(CN)2 конкурируют с коферментом (НАДГ), аденозином, АДФ-рибозой, аденозинмонофосфатом и СП за связывание с ферментом. По всей видимости, ингибирующее влияние Pt(CN)4a и Au(CNV определяется их связыванием с областью фермента, занятой фосфатными группами кофермента. Авторы полагают, что в аминокислотной последовательности белка именно Arg-47 является частью связывающего центра, притягивающего отрицательно заряженные части кофермента, но имеющего также сродство к анионам различного размера и формы, например Pt(CN)42", Au(CN)2", СГ и CH2ICOO . Известно также, что у ранил оксалат, этилртутьтиосалицилат и Hg(CN)42 уменьшают каталитическую активность фермента при концентрациях 1, 0.1 и 0.3 мМ соответственно [29]. В литературе отмечается ингибирующее действие на АДГ азида натрия [63] по бесконкурентному типу в реакции восстановления пропиональдегида, и по конкурентному типу в обратной реакции - окисления пропан-1-ол а. Авторами [73] было показано, что координирование цианид-иона каталитическим цинком ослабляет связывание фермента с НАДН в 50 раз, и примерно в такой же степени укрепляет связь АДГ-НАД\ При этом авторы подчеркивают, что взаимодействие СЬГ не следует описывать в рамках образования ковалентно-связанного аддукта цианида и НАД+. Таким образом, следует отметить, что в литературе имеются сведения о влиянии неорганических анионов на каталитическую активность АДГ только из одного источника - печени лошади. При этом многие данные носят поверхностный, а зачастую и противоречивый характер. Упоминающийся в некоторых статьях диапазон концентраций, в которых проявляется влияние анионов, не представляет интерес с аналитической точки зрения. органических реагентов, образующих комплексные соединения с каталитическим цинком фермента Уменьшение скорости реакции, катализируемой АДГ из печени лошади, в присутствии органических реагентов, образующих устойчивые комплексные соединения с ионом цинка, наглядно демонстрирует роль последнего в активном центре фермента.
К сожалению, работы, в которых упоминаются те или иные ингибиторы фермента, носят, как правило, чисто теоретический характер. В них авторы используют ингибиторы АДГ для кристаллографических исследований структуры биокатализатора, выяснения особенностей переноса водорода и гидрид-иона, для изучения роли цинка и связанной с ним воды в катализе и в других целях, не связанных с аналитическим аспектом применения эффекторов. В связи с этим столь важные аспекты, как определение параметров ингибирования, фактически не затрагиваются. Известно, что на активность фермента влияют 1,10-фенантролин [20,65,74], имидазол [75], диметилсульфоксид [76], 2,6-дипиколиновая кислота [77], холиновая кислота (производное холина - витамина В4) [78], 2,2 -дипиридил [79], аурамин О ([имидокарбонил]-бис[М,М-диметиланилин]) [79], пиразол [80], 8-гидроксихинолин, ЭДТА, диэтилдитиокарбаминат, этилендиамин, оксалат-ион [36], а также различные акридины и берберины [81]. Степень ингибирования фермента большинством реагентов не зависит от времени их совместного инкубирования. Исключение составляет 1,10-фенантролин, ингибирующий эффект которого от времени инкубирования зависит и может быть нивелирован либо добавлением ионов Cu(II), Zn(II) или НАД4", либо разбавлением реакционной смеси. Анализ литературных данных показывает, что наиболее полно изучено ингибирующее действие 1,10-фенантролина, как на АДГ из печени лошади, так и на дрожжевой фермент. Известно, что 1,10-фенантролин ингибирует АДГ из печени лошади быстро, но обратимо [82], в то время как в случае АДГ из дрожжей при тех же условиях наблюдается медленное необратимое [83] падение каталитической активности. Авторы [84] выяснили, что 1,10-фенантролин конкурирует с окисленной и восстановленной формами кофермента за каталитический цинк фермента из печени, однако с субстратом (со спиртом либо альдегидом) он практически не конкурирует. В случае дрожжевого фермента, реагент оказывается конкурентным не только по отношению к НАД4" и НАДН, но и к спирту [85]. Установлено, что 1,10-фенаитролин образует комплекс с цинком, входящим в активный центр обоих ферментов, в соотношении 1:1 [85,86]. При этом уменьшение концентрации этанола приводит к увеличению степени ингибированяя ферментов, а понижение концентрации анетальдегида - к падению степени ингибирования. В работе [86] проведено детальное изучение связывания 1 ДО-фснантролина как со свободными ионами цинка, так и с цинком АДГ из печени лошади. Было показано, что образуется "смешанный" комплекс состава {АДГ-2п2-фенантролинг}, т.е. цинк не удаляется реагентом из активного центра фермента полностью, а лишь координирует его в строго стехиометрическом соотношении, блокируя таким образом активный центр фермента.
Посуда, аппаратура
При определении ультрамалых количеств веществ большое внимание следует уделять материалу и чистоте используемой посуды. В работе использовали градуированные стеклянные пробирки и мерные колбы с притертыми пробками, которые предварительно очищали концентрированной нерепганной азотной кислотой, обрабатывали паром в течение 10-15 мин и тщательно промывали деионизованной водой. Оптическую плотность растворов во времени измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-2 или спектрофотометре Shimadzu UV-2201 ("Shimadzu", Япония). рН буферных растворов измеряли с помощью рН-милливольтметра ("Эконикс-эксперт", Россия) с точностью ±0.005. Для отбора малых количеств растворов ( 1 мл) использовали микродозаторы фирмы "Biohit" (Финляндия). Начальную скорость процессов контролировали спектрофотометрическим методом, так как в процессе окисления этанола НАДЦ образуется НАДН, поглощающий в УФ-области спектра ( .,,, =315 нм). Скорость неферментативного окисления этанола кислородом и НАД4- при всех изученных концентрациях реагентов составляла не более 1% от скорости ферментативной реакции, т.е. была пренебрежимо мала. Скорость индикаторной реакции контролировали следующим образом. В пробирку с притертой пробкой вводили последовательно необходимые количества соответствующего буферного раствора (трис-НС1-, фосфатного либо пирофосфатного), эффектора (либо воды в отсутствие эффектора), растворов НАД+, этанола и АДГ. Общий объем смеси составлял 1.5 мл, что соответствует объему кюветы с 1=0.3 см. В момент смешения растворов включали секундомер и измеряли оптическую плотность реакционного раствора на КФК-2 =315 нм, 1-0.3 см) каждые 15 с (начиная с 15-оЙ с) в течение 2 мин. Величина оптической плотности реакционного раствора прямо пропорциональна времени протекания реакции ъ течение первых 1-2 мин, поэтому в работе использовали дифференциальный вариант кинетического метода анализа [114]. При необходимости инкубирования АДГ с эффектором в пробирку с притертой пробкой вводили растворы АДГ и эффектора и включали секундомер. Через определенный промежуток времени смесь вносили в пробирку, содержащую буферный раствор, растворы НАД" и этанола.
Далее эксперимент проводили, как указано выше. Все измерения проводили при комнатной температуре без специального термостатирования, поскольку ранее при изучении температурной зависимости скорости ферментативной реакции выяснено, что при повышении температуры на 10С скорость реакции изменяется всего на 2%. Результаты измерений обрабатывали с применением методов математической статистики. Применяли следующие обозначения: х - среднее для ряда в п вариант, х - п ; V - дисперсия, V = п—\ 1( - )а я-1 . S S - стандартное отклонение, S = &т - относительное стандартное отклонение, sr х Предел обнаружения веществ (сП1;п) определяли как наименьшую концентрацию, при которой по данной методике можно обнаружить статистически значимое присутствие компонента в анализируемом объекте. Предел обнаружения рассчитывали по формуле с = 3 о где s0 - стандартное отклонение контрольного опыта, S - коэффициент чувствительности, равный тангенсу угла наклона градуировочного графика. Нижнюю границу определяемых содержаний (сн) характеризовали минимально определяемой концентрацией при заданной вероятности Р = 0.95, n=3,sr 0.33. Глава 5. Обоснование выбора фермента и индикаторной реакции; оптимизация условий ее проведения Во введении было указано, что использование препаратов ферментов, выделенных из различных источников, позволяет разрабатывать методики определения субстратов, эффекторов, кофакторов ферментов с различными метрологическими характеристиками и, следовательно, целенаправленно выбирать тот или иной препарат для решения различных аналитических задач. Ранее в лаборатории кинетических методов кафедры аналитической химии МГУ показано, что для создания чувствительных методик определения соединений, имеющих большое сродство к сульфгидрильным группам белка (ионов тяжелых металлов и ртутьорганических соединений), а также азотсодержащих гетероциклических соединений (в том числе хелатирующих агентов, аминокислот, некоторых лекарственных препаратов и т.д.) весьма перспективно использование АДГ из пекарских дрожжей [11.6], Была получена апоформа этого фермента и разработана чувствительная методика определения кофактора - иона цинка(И) по реактивации апофермента.
Алкогольдегидрогеназы выделяют из различных источников (см. Обзор литературы); помимо фермента из пекарских дрожжей, доступным коммерческим препаратом является АДГ из печени лошади. Из литературы известно, что обе АДГ имеют одинаковые по длине цепи аминокислотных остатков, содержат 2 иона цинка на субъединицу белка, имеют очень близкое по составу окружение металла-кофактора, катализируют один и тот же субстрат по одному общему механизму. В то же время, АДГ из печени лошади проявляет существенно более широкую субстратную специфичность и, что особенно важно, подвержена ингибирующему воздействию более широкого круга различных веществ. Все эти сведения явились основанием для постановки исследования направленного на выявление и определение эффекторов АДГ, выделенной из печени лошади и сопоставление вновь полученных экспериментальных данных с полученными ранее данными об АДГ из пекарских дрожжей. Такой подход может обеспечить не только систематизацию и дополнение имеющихся в литературе сведений, но и комплексное изучение особенностей и свойств одних и тех же алкогольдегидрогеназ, но выделенных из различных источников. Совокупность полученных данных позволит обоснованно подходить к выбору определенного ферментного препарата для решения конкретных аналитических задач. В качестве индикаторной нами была выбрана реакция окисления этанола НАД+, катализируемая различными алкогольдегидрогеназами, в том числе АДГ из дрожжей. Выбор данной индикаторной реакции обусловлен тем, что, как показывает анализ литературных данных, именно в ней АДГ проявляет максимальную каталитическую активность; кинетика и механизм ее довольно хорошо изучены [43, 63, 158], с использованием именно этой реакции в большинстве работ изучено влияние различных соединений на каталитическую активность АДГ. Этанол - нетоксичный, доступный и дешевый субстрат. Не менее веским аргументом явился также тот факг, что именно эта реакция была использована в исследовании, описанном в [116], т.е. выбор и изучение нами именно этой реакции должно обеспечить наиболее полное и корректное решение поставленной в работе задачи. В различных публикациях приводятся различные условия проведения реакции окисления этанола НАД7, поэтому было решено прежде всего выяснить оптимальные условия индикаторной реакции. При этом в качестве исходных были приняты оптимальные условия проведения этой реакции в присутствии АДГ из пекарских дрожжей, т.е.: трис-НС1 буферный раствор, рН 9.0, сэтанола = 0.4 М, снлд — 0.6 мМ, Сддг — 0.2 мкМ. Оказалось, что в таких условиях скорость ферментативной реакции, катализируемой АДГ из печени лошади, крайне низка. В связи с этим были изучены зависимости скорости реакции от рН среды и природы буферного раствора и концентраций реагентов: фермента, НАД и этанола. Эксперимент проводили по следующей методике. В стеклянную пробирку с притертой пробкой последовательно вводили 1.1 мл грис-НСІ-буфериого раствора с рН 6.0-11.0, 0.1 мл воды, по 0.1 мл растворов НАД" в интервале концентраций (4.5-11.5) мМ, этанола - (0.025-12) М, АДГ - (0-125) мкМ.
Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади метил-, диметил- и триметилолова
Органические производные олова по сравнению с его неорганическими соединениями проявляют несопоставимо большую токсичность по отношению к живым организмам. Оловоорганические соединения общей формулы RI1SnX4-11 находят широкое применение как в промышленности, так и в сельском хозяйстве [186]. В настоящее время они занимают четвертое место среди производимых металлоорганических соединений. Существенным отличием процессов метилирования олова от ртути является, прежде всего, образование по меньшей мере четырех соединений общей формулы (СНз)п8пХ4-п. Оловоорганические соединения могут образовываться в результате алкилирования нетоксичных неорганических предшественников микроорганизмами и химическими агентами природного происхождения в присутствии сульфид-ионов (на свету): Sn + СНзІ [CH3SnI] CH3I +[CH3SnI] ct (CH3)2SnI2 2(CH3)2SnI2 (CH3)3SnI + CH3S11I3 2{CH3)3SnI ± (CH3)4Sn + (CH3)2SnI2 Следует особо подчеркнуть, что оловоорганические соединения могут метилировать другие металлы, например ртуть и свинец. Возможны также реакции переметилирования между неорганическим оловом и метильными производными различных металлов, а также реакции диспропорционирования [187]: 3(CH3)4Sn + 3SnCl4 Й 2(CH3)3SnCl + 2(CH3)2SnCl2 + 2CH3SnCl3 Токсическое действие органических производных олова чрезвычайно разнообразно и зависит прежде всего от числа органических групп в соединении, важную роль играет природа органической группы. В целом, алкильные производные более токсичны, при этом удлинение цепи в группе R приводит к снижению токсичности. В виду биоаккумуляции в органах и тканях наряду с прямым токсическим действием на организм соединения олова вызывают опасные отдаленные биологические последствия - мутагенные, эмбриотоксические, гонадотоксические, тератогенные [188]. При изучении взаимосвязи морфологических изменений с биохимическими процессами было сделано предположение, что механизм проявления токсичности включает в себя ингибирование соответствующих ферментов оловоорганическими соединениями при их взаимодействии с SH-группой цистеина и атомом азота гистидина [189]. Состоятельность выдвинутой гипотезы была продемонстрирована на примере снижения активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы при действии (C jHc SnCb, приводящем к усилению образования кислородных метаболитов, и, как следствие, острому панкреатиту [190].
В литературе отсутствуют какие-либо данные о влиянии олова или оловоорганических соединений на алкогольдегадрогеназы, однако в работе [191] было изучено влияние СНзЭпОз на активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ, ЕС 1.1.1.27), принадлежащей к той же группе ферментов, что и АДГ - НАД-зависимым оксидоредуктазам. В условиях проведения эксперимента, весьма приближенных к оптимальным условиям проведения индикаторной реакции, катализируемой АДГ из печени лошади, было показано, что метилолово оказывает ингибирующее влияние на ЛДГ из печени русского осетра в диапазоне его концентраций 0.4 - 1.0 мМ. В связи со всем вышесказанным было решено изучить влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади хлоридов метилпроизводных олова - CH3SnCl3, (CH3)2SnCl2 и (CH3)3SnCI. Хлорид-ион не оказывает никакого действия на АДГ в широком интервале его концентраций (1-Ю 6-1-Ю"3) М даже при инкубировании с ферментом в течение 30 мин (гл. 6.4) Ранее было показано (гл. 7.1), что оптимальные условия проведения индикаторной реакции в присутствии ионов тяжелых металлов и метилртути совпадают, поэтому воспользовались теми же условиями, которые были выбраны для изучения влияния метилртути. Установлено, что моно-, ди- и триметилолово оказывают ингибирующее действие на каталитическую активность АДГ из печени лошади. При этом степень ингибирующего эффекта моно- и диметилолова не зависит от времени их совместного выдерживания с АДГ из печени лошади, в то время как степень ингибирования триметилоловом возрастает при 30-минутном инкубировании с ферментом (рис. 32). Таким образом, моно- и диметилпроизводные олова так же, как и метилртуть, являются обратимыми, а (CH3)3SnCl - необратимым ингибитором алкогольдегидрогеназы. Известно, что токсичность органических производных олова убывает в ряду R3SnX R2S11X2 RS11X3 [192], причем только тризамещенные производные считают высокотоксичными веществами. По-видимому, этот факт может быть объяснен с точки зрения обратимости действия этих соединений, что было показано нами на примере ингибирования каталитической активности АДГ метилпроизводными олова. Так, комплексы CH3SnCl3 и (CH3)2SnCl2 с ферментом подвержены распаду в силу обратимости процесса их образования; (CH3)3SnCl напротив, способен накапливаться в организме, параллельно усиливая во времени негативное влияние, вероятно вследствие реализации иных механизмов токсичности, например радикальных [180]. При этом, как правило, токсичность соединений олова объясняют взаимодействием атома олова с SH-грутшами фермента в его активном центре [193]. В выясненных оптимальных условиях проявления метилртутьго ингибирующего влияния на каталитическую активность АДГ изучили зависимости скорости индикаторной реакции от концентрации хлоридов метил-, диметил- и триметилолова в широком интервале их концентраций (1-Ю"6 -МО"3 М). Установили, что эти соединения оказывают слабое ингибирующее влияние на фермент, проявляющееся при достаточно высоких концентрациях (1-КҐ М и выше или 0.1 - 1.0 мг/мл), определение которых не представляет аналитического интереса. Как видно из рис.33, при концентрации 1 мг/мл монометилолово, обладающее, как показано в [192], наименьшим токсическим действием, оказывает максимальный ингибирующий эффект на АДГ из печени лошади (1=53%), в то время как триметилолово - минимальный (1=20%); диметилпроизводное занимает промежуточное положение (1=40%), Известно, что оловоорганические соединения обладают ярко выраженной окислительной способностью, убывающей в ряду RSnX3 R2SnX2 R3SnX, что позволяет им участвовать в таких биохимических процессах, как транспорт электронов в дыхательном цикле или же взаимопревращение НАД4" и НАДН [194].
Принимая во внимание степень действия метилпроизводньгх олова, а также тот факт, что Sn(IV) проявляет больший ингибирующий эффект, чем его органические производные, можно с уверенностью утверждать, что в присутствии как неорганических, так и органических соединений олова активность АДГ понижается вследствие образования связи Sn-S и последующего окисления сульфгидрильных групп биокатализатора. Учитывая наличие большого избытка оловоорганических соединений в реакционной среде, чрезвычайно слабый ингибирующий эффект этих веществ можно объяснить одновременным протеканием двух процессов. С одной стороны, органические производные олова взаимодействуют с тиольными группами АДГ, окисляя их; с другой стороны эти же соединения (находясь в заведомом избытке) способны также окислять НАДН до НАД+ [J 94]. При этом первый процесс в силу блокирования аллостерических центров фермента понижает скорость индикаторной реакции, в то время как второй процесс номинально ускоряет реакцию, поставляя дополнительное количества кофермента (НАД "). В области низких концентраций оловоорганических соединений преобладает второй процесс, в силу чего ингибирование не наблюдается. При увеличении концентрации метилпроизводных олова, более существенную роль начинает играть процесс окисления SH-групп фермента, в результате чего степень ингибирования возрастает. Необходимо учитывать также стерический фактор, который имеет наибольшее значение в случае тризамещенного органического соединения олова, что и приводит к тому, что ингибирующее действие возрастает в ряду, строго соответствующем уменьшению токсичности исследуемого вещества. Таким образом, впервые изучено влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ оловоорганических соединений и установлено, что они являются реагентами на SH-группы белка. Также показано, что метилпроизводные олова являются существенно менее эффективными ингибиторами АДГ из печени лошади, чем Sn(IV). При этом прослеживается четкая корреляция ингибирующего действия неорганических и органических соединений олова и ртути.
