Содержание к диссертации
Введение
Глава 1, Источники, структура, физико-химические характеристики и механизм действия щелочных фосфатаз бактериального и животного происхождения
1.1. Источники щелочных фосфатаз 6
1.2. Структура и аминокислотный состав щелочных фосфатаз 11
1.3. Роль ионов металлов в структуре и каталитической активности щелочных фосфатаз 17
1.4. Механизм действия щелочных фосфатаз 28
1.5. Субстратная специфичность щелочных фосфатаз 31
Глава 2. Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз различного происхождения и их апоферментов 35
2.1. Влияние ионов металлов на активность бактериальных и животных щелочных фосфатаз 35
2.2. Влияние ионов металлов на апоферменты бактериальных и животных щелочных фосфатаз 50
Глава 3. Роль цинка и магния в биологических объектах и методы их определения 62
3.1. Значение цинка для организма человека, контроль его содержаний 62
3.1.1. Биологическая роль цинка 62
3.1.2. Методы определения цинка (II) в биологических жидкостях 63
3.2. Значение магния для организма человека, контроль его содержаний 65
3.2.1. Биологическая роль магния 65
3.2.2. Методы определения магния (II) в биологических жидкостях 67
Экспериментальная часть
Глава 4. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика эксперимента, обработка результатов измерений 70
4.1. Исходные вещества 70
4.2. Посуда и аппаратура 73
4.3. Методика эксперимента 74
4.4. Обработка результатов измерений 78
Глава 5. Выбор фермента, индикаторной реакции и оптимальных условий ее проведения 79
5.1. Выбор фермента 79
5.2. Выбор индикаторной системы 80
5.3. Выяснение оптимальных условий проведения индикаторной реакции 82
Глава 6. Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников 94
6.1. Влияние ионов цинка на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из трех различных источников 94
6.1.1. Выяснение тина ингибирования щелочных фосфатаз ионами цинка 98
6.1.2. Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз различного происхождения 104
6.2. Влияние ионов цинка па каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах 105
6.3. Влияние ионов магния на каталитическую активность трех щелочных фосфатаз 111
6.4. Совместное влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах 117
Глава 7. Выбор оптимальных условий получения апоферментов щелочных фосфатаз 121
7.1. Влияние ЭДТА на каталитическую активность щелочных фосфатаз 122
7.2. Влияние органических соединений различных классов на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя, 127
7.3. Получение истинного апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя с использованием диализа 136
7.3.1. Выбор оптимальных условий получения апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя 138
Глава 8. Реактивирование апоферментов щелочных фосфатаз из кишечника цыпленка и кишки тюленя ионами металлов 148
8.1. Реактивирование апоферментов, полученных с использованием ЭДТЛ 148
8.1.1. Изучение влияния на апоферменти ионов цинка и ряда других металлов 148
8.1.2. Изучение влияния ионов магния и кальция на апофосфатазу из кишки тюленя 153
8.1.3. Реактивирование апофосфатазы из кишки тюленя, полученной диализом , 155
8.2. Реактивирование апоферментов, полученных с использованием нитрилотриметиленфосфоновой кислоты 156
Глава 9. Разработка методики определения цинка (II) по его реактивирующему действию на апофосфатазу из кишки тюленя 162
Глава 10. Ферментативные методики определения цинка (II) и магния (II) в биологических объектах 164
10.1. Определение цинка (II) в сыворотке крови по реактивированию апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя 164
10.2. Определение магния (II) в моче по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка 167
10.2.1. Подготовка проб мочи к анализу 167
10.2.2. Методика определения магния в моче 176
Заключение 181
Выводы 187
Список литературы
- Структура и аминокислотный состав щелочных фосфатаз
- Биологическая роль цинка
- Методика эксперимента
- Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз различного происхождения
Введение к работе
Одной из многих медико-биологических проблем, стоящих перед современными методами химического анализа, является контроль содержания в организме человека определенных макро- и микроэлементов, особенно магния и цинка, необходимых для нормального протекания многих биохимических реакций и физиологических процессов. В связи с этим актуальна разработка высокочувствительных и высокоселективных методов определения ионов указанных металлов в биологических объектах, в частности крови и моче.
Для решения этой задачи весьма перспективно использование ферментов, выделенных из различных источников и содержащих в активных центрах одновременно ионы обоих металлов - цинка и магния. Использование различий в доступности металл связывающих центров, в аминокислотной последовательности и каталитических свойствах металлоферментов различного происхождения может позволить направленно изменять чувствительность и селективность ферментативных методов определения ионов металлов-кофакторов в различных биологических объектах.
В этом плане особенно интересны гидролазы, в частности щелочные фосфатазы из E.coli, кишечника цыпленка и тонкой кишки гренландского тюленя, как активные, стабильные, коммерческие препараты ферментов, содержащие в каталитических и аллостерических центрах ионы цинка и магния соответственно. Сравнительное изучение влияния . ионов металлов, в особенности цинка и мапшя, на каталитическую активность этих ферментов с целью разработки ферментативных методик определения ионов металлов-кофакторов до настоящего времени не проводилось. Щелочная фосфатаза, выделенная из тонкой кишки гренландского тюленя, в аналитических целях ранее не использовалась.
Систематическое исследование действия ионов металлов на каталитическую активность указанных щелочных фосфатаз может позволить не только выявить ферменты, наиболее перспективные для разработки чувствительных и селективных методик определения цинка и мапшя в различных объектах, особенно биологических, по и использовать подходы, выработанные на примере щелочных фосфатаз различного происхождения, для
расширения областей использования в химическом анализе других металлофермсптов, содержащих в каталитическом и аллостерическом центрах ионы металлов различной природы.
Все сказанное дает основание считать создание и развитие ферментативных методов определения металлов-кофакторов актуальным и перспективным направлением.
Цели настоящей работы:
установление характера и степени влияния ионов цинка и магния на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из трёх различных источников: кишечной палочки Е. coli, кишечника цыпленка, тонкой кишки гренландского тюленя;
выбор препаратов ферментов, наиболее перспективных с аналитической точки зрения;
разработка с их использованием высокочувствительных и селективных методик определения цинка и магния на основе их различного действия на каталитическую активность щелочных фосфатаз и их апоферментов;
применение разработанных методик в анализе биологических объектов.
Научная новизна заключается в том, что
впервые на примере щелочных фосфатаз различного происхождения предложены приемы многопланового использования в химическом анализе ферментов, содержащих в каталитическом и аллостерическом центрах ионы различных металлов (цинка и магния);
впервые в аналитических целях использована щелочная фосфатаза, выделенная из тонкой кишки гренландского тюленя; выяснены оптимальные условия получения и реактивирования ее апофермента;
с целью выяснения перспектив использования в химическом анализе бактериальной и животных щелочных фосфатаз различного олигомерного состава проведено систематическое сравнительное изучение каталитических свойств этих ферментов: чувствительности к действию эффекторов (ионов металлов и органических соединений разных классов); стабильности в буферных растворах различной природы: неорганической - боратном и карбонатном, и органической — глициновом и mpwc-HCI;
> разработаны приемы направленного изменения чувствительности и селективности определения цинка и магния: применение щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников; проведение ферментативного гидролиза п-нитрофенилфосфата в буферных растворах различной природы; использование различных эффектов: ингибирования (для определения цинка) и активирования фермента (для определения магния), реактивирования апофермента (для определения цинка в присутствии магния); применение либеративного действия ионов металла на фермент, ингибированный органическим лигапдом (для определения магния).
Практическую значимость имеют
селективные методики определения цинка по его ингибирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя в реакции гидролиза «-питрофенилфосфата в боратном (с„=10 нг/мл) и трис-\\С\ (с„=1 мкг/мл) буферных растворах;
селективная и высокочувствительная методика определения магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка в реакции гидролиза п-питрофенилфосфата (с„=0.6 нг/мл);
методика получения апофермента щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя с использованием ЭДТА;
селективная и высокочувствительная методика определения цинка по его реактивирующему действию на апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя (с„= 10 нг/мл);
методика определения цинка в сыворотке крови человека;
методика определения магния в моче человека;
рекомендации по выбору препарата щелочной фосфатазы для определения ферментативным методом магния в присутствии цинка и цинка в присутствии магния; цинка в присутствии иопов кобальта, меди, кадмия и никеля; магния в присутствии кальция.
Автор выносит на защиту:
Результаты систематического сравнительного изучения каталитических свойств щелочных фосфатаз разного происхождения в буферных растворах различной природы (органической и неорганической) в реакции гидролиза и-нитрофенилфосфата в отсутствие и в присутствии ионов металлов: цинка и магния, а также кобальта, никеля, кадмия, меди, железа, свинца, ртути, кальция, бария, натрия, калия, цезия (при индивидуальном и совместном с цинком присутствии).
Результаты, полученные в ходе:
исследования влияния широкого круга органических соединений на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя с целью выявления ее наиболее эффективных ингибиторов;
выбора подходов к получению апоферментов щелочных фосфатаз из трех источников и выяснения оптимальных условий проведения диализа щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя;
изучения возможности реактивирования апофосфатаз животного происхождения, полученных с использованием ЭДТА, ионами цинка и магния, а также кобальта, меди, никеля', кадмия и кальция;
исследования действия магния и кальция на щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя в присутствии нитрилтриметиленфосфоновой кислоты.
3. Ферментативные методики определения:
цинка по его ингибирующему действию на каталитическую
активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя
в различных буферных растворах;
магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка;
цинка по его реактивирующему действию на апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя.
4. Результаты определения магния в образцах мочи; цинка - в образцах
сыворотки крови человека.
,
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VII Международном симпозиуме «Kinetics in Analytical Chemistry» (Румыния, 2001), Международной конференции «Biocatalysis-2002» (Москва, 2002), Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 4 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 211 стр. машинописного текста, включая 26 рисунков, 32 таблицы, 9 схем; состоит из введения, обзора литературы (главы 1-3), экспериментальной части (главы 4-10), заключения, выводов, списка литературы, включающего 172 наименования, и приложения.
Структура и аминокислотный состав щелочных фосфатаз
Молекулярные массы щелочных фосфатаз зависят от их источника, чистоты ферментного препарата, а также от пространственной структуры молекулы биокатализатора; они изменяются в среднем в интервалах 40-90 кДа для мономера, 80-150 и 145-300 кДа - для димера и тстрамера соответственно (табл. I, [49]). Интересно отметить, что молекулярные массы ферментов одной пространственной структуры, как правило, увеличиваются при варьировании их источников от менее организованного к- более организованному живому существу. Так, молекулярные массы димериых микробных щелочных фосфатаз ниже (68-120 кДа), чем у фосфатаз животного происхождения (120-200 кДа)
Для большинства щелочных фосфатаз доказана идентичность их субъединиц [32, 50], Однако встречаются ферменты, молекула которых представлена гетеродимером, как, например, щелочная фосфатаза из плаценты человека. Полагают, что молекула этой фосфатазы состоит из двух субъелипиц одной молекулярной массы, но не идентичных друг другу по составу аминокислот, их последовательности и расположению в пространстве.
Микробные щелочные фосфатазы способны образовывать новые активные гибриды из мономеров двух ферментов, выделенных из разных микроорганизмов. Это указывает на близость вторичных структур таких фосфатаз, несмотря на различия в составе и иммунологических свойствах их субъединиц. Так, например, С. Левинталь с сотр. [50] показали, что новый фермент, полученный в результате взаимодействия субъединиц щелочных фосфатаз из Е.соИ и S.marcescens (in vivo и in vitro), представляет собой дим ер, содержащий по одному мономеру фосфатаз, выделенных из этих бактерий.
В настоящее время наиболее изучена щелочная фосфатаза из Е.соИ. Методом рентгеноструктурного анализа установлена пространственная структура этого фермента [51]. Он представляет собой каталитически активный симметричный димер с молекулярной массой « 90 кДа (рис. 1). Дж. Рейнольде и М. Шлезингер в 1967-1969 гг. обнаружили, что молекулярная масса щелочной фосфатазы из Е.соИ в присутствии избытка ионов цинка увеличивается с
повышением рН и достигает максимального значения (172 кДа) при рН 8.0 [6]. Авторы [6] предположили, что молекулярная масса фермента возрастает вследствие быстрой и обратимой самоассоциации димеров с образованием тетрамера. Таким образом, при рН 8.0 щелочная фосфатаза из Е.соН существует исключительно в виде тетрамеров, димеры возникают при более низких значениях рН. Согласно данным работы [10], процесс образования тетрамера сопровождается конформациопными изменениями внутри димера; каждая субъединица в тетрамерс связывает два дополнительных (введенных извне) иона пинка. Кроме того, в работе [52] была высказана гипотеза об отсутствии активности у мономера и тетрамера.
В 1998 г. Е.С. Чухрай и др. предположили, что в растворе щелочной фосфатазы из Е.coli устанавливаются следующие равновесия:
Важно отмстить, что равновесия (1) и (2) имеют разное значение для стабильности и активности фермента. Равновесие мономер - димер (1) в обычных условиях полностью сдвинуто в сторону образования каталитически активного димера и фиксируется структурой конформапионного замка [53]. Распад димера на мономеры сопровождается инактивацией фермента. Обратимую диссоциацию димерной щелочной фосфатазы на неактивные мономеры согласно [54, 55] можно осуществить несколькими способами: 1) обработкой фермента 8 М раствором мочевины; 2) понижением рН до 4 и ниже; 3) удалением цинка хелатирующими агентами; 4) повышением температуры.
Равновесие димер - тетрамер (2) значительно более подвижно, поэтому именно оно может играть важную роль в регуляции каталитической активности фермента и выполнении его биологических функций.
В работе [56] показано, что активными могут быть не только димеры щелочной фосфатазы из Е.соИ (как было предположено ранее в [6, 10J), но и тетрамеры, однако активность последних ниже активности димеров почти в 7 раз. Активные ассоциаты щелочной фосфатазы из Е.соИ с числом субъединиц более 4 не обнаружены. Кроме того, установлено, что при высоких ( 2 мг/л) концентрациях фермента доля димеров не превышает 1% и постепенно возрастает с разбавлением раствора, достигая почти 50% при концентрации белка 3J мкг/л. Согласно данным рентгеноструктурпого анализа [56], нслиссоциированпый димер не имеет на своей поверхности протяженных гидрофобных участков; положительно и отрицательно заряженные группы аминокислотных остатков распределены по поверхности белка более или менее равномерно. Следовательно, контактными участками молекул димера при формировании тетрамеров могут быть гетерополярные участки поверхности белка, связанные с соответствующими полипептидными образованиями в активных центрах димера.
Таким образом, смещение равновесия между различными формами щелочной фосфатази позволяет исследователю подобрать такие условия, при которых будет преобладать только одна из молекулярных форм фермента.
Аминокислотный состав всех щелочных фосфатаз независимо от источника выделения (бактерии или животное) практически одинаков. Интересно отметить, что щелочные фосфатазы человека и животных подобны по своему аминокислотному составу бактериальным: например, заметные сходства обнаружены у щелочных фосфатаз. из плаценты человека wE.coii [32]. Щелочная фосфатаза животного происхождения, являясь гликопротсином, имеет набор органоспецифических форм, различающихся между собой углеводной частью. На основании данных о взаимодействии фермента с лектипами, для которых хорошо известна их олигосахаридная специфичность, были установлены углеводные структуры щелочной фосфатазы из слизистой тонкой кишки тюленя [37]. Сравнение аминокислотного состава щелочных фосфатаз из тонкой кишки тюленя и печени быка выявило лишь одно отличие: более низкое содержание в тюленьей фосфатазе остатков тирозина и аланипа при одновременном, хотя и незначительном, обогащении сери ном, изолейцииом, лейцином, фепилаланином, гистидином и лизином [40].
Биологическая роль цинка
Цинк является основным и наиболее распространенным микроэлементом, поскольку обнаруживается во всех живых клетках и секреторных жидкостях человеческого организма [117]. Кроме того, цинк входит в состав более 300 металлоферментов (карбоангидраз, щелочных фосфатаз, алкогольдегидрогеназ, супероксиддисмутаз, РНК- и ДНК-полимераз и др.) [117]. Без цинка невозможны деление и развитие клеток, синтез белка и нуклеиновых кислот (ДНК и РЫК), процессы регенерации, очищение организма и укрепление иммунитета [118]. Ионная проницаемость клеточных мембран также связана с цинком [119].
Велика биологическая роль цинка в росте, развитии и половом созревании человека, поддержании репродуктивной функции, в кроветворении, вкусовосприятии и обонянии; нормальном течении процессов заживления ран и ожогов; в образовании коллагеновых волокон, ответственных за эластичность кожи, сосудов; в формировании и нормальном функционировании скелета; в поддержании и улучшении зрения; в поддержании высокого иммунного уровня в результате активизации выработки лимфоцитов, особенно у пожилых людей [I20-124].
Цинк необходим для нормальной работы гипофиза, щитовидной, поджелудочной и предстательной желез; он ускоряет регенерацию слизистого слоя кишечника. Под влиянием его соединений усиливается активность гормонов гипофиза. Установлено участие цинка в реализации биологического действия инсулина и витамина А. Цинк нормализует жировой обмен, повышая интенсивность распада жиров в организме и предотвращая ожирение печени [125]. Умственные способности человека также зависят от уровня содержания и организме цинка: чем его больше, тем выше работоспособность и интеллектуальный потенциал. Этот элемент необходим также при реабилитации после перелома костей, в той же мере, что и кальций, кремний, фосфор, калий и магний [126].
Сведения о распределении и дефиците цинка в организме человека приведены в Приложении.
В настоящее время цинк определяют в широком спектре биологических жидкостей: плазме и сыворотке крови, слюне, моче, дуоденальном содержимом. Наиболее информативны данные о содержании цинка в крови (сыворотке). Нормальный уровень цинка в крови взрослого и ребенка составляет: 0.13 - 0.26 мМ (8.5 — 17 мкг/мл) и 0.013 - 0.026 мМ (0.85 - 1.7 мкг/мл) соответственно. Диагноз цинкового дефицита ставится в том случае, если содержание микроэлемента в крови менее 13 мкМ (0.85 мкг/мл), а в сыворотке 0.9 - 8,2 мкМ (0.06-0.5 мкг/мл)[ 127].
В клинической практике содержание цинка (II) в крови устанавливают преимущественно методами атомно-эмиссионной или атомно-абсорбционной спектроскопии, инверсионной вольтамперометрии [128]. Чаще всего используют метод атомно-абсорбционной спектроскопии с ато.мизацией пробы в пламени ( =213.9 нм), который позволяет определять цинк в диапазоне концентраций 0.05 - 2.00 мкг/мл. Замена атомизатора на электротермический позволяет понизить нижнюю границу определяемых концентраций цинка до 0.016 и г/мл, а также уменьшить объем пробы до 1—10 мкл. Однако существенным недостатком метода является высокое фоновое излучение от раскаленной поверхности кюветы и неселективнос поглощение света парами основного вещества пробы при его высокой концентрации; результаты определения зависят от природи матрицы [129].
С использованием атомно-эмиссионной спектроскопии с возбуждением от высокочастотного плазменного факела (ИСП-АЭС) можно определять до 150 мкг/мл цинка; предел обнаружения составляет 4 мкг/мл. Градуировочные графики линейны в диапазоне четырех порядков концентрации цинка, однако, влияние матрицы выражено в большей степени, чем в атомно-абсорбционном методе [129].
По достоверности определения цинка в крови с выше описанным методом конкурирует метод инверсионной вольтамперометрии с использованием в качестве индикаторных модифицированных нерастворимыми солями ртути толстопленочных графитовых электродов [130]. Данный метод не требует предварительного разложения и концентрирования пробы крови.
Основным недостатком всех выше перечисленных методов определения цинка является высокая стоимость анализа, обусловленная сложностью используемой аппаратуры, необходимость привлечения квалифицированного персонала.
Методика эксперимента
Полоса максимального поглощения /т-питрофенолят-иопа лежит в интервале длин волн 380-420 нм. Скорость индикаторной реакции в большинстве случаев контролируют по поглощению и-нитрофенолята при 410 нм. В работе [88] поглощение п-нитрофенолята измеряли при 290 нм после остановки реакции трихлоруксусной кислотой с последующим центрифугированием, фильтрованием и добавлением щелочи.
Индикаторным веществом наряду с я-нитрофенолят-ионом может служить и второй продукт реакции гидролиза и-НФФ - фосфат-ион. В работах [18, 45, 88] реакцию останавливали серной или трихлоруксусной кислотой, после фильтрования в систему добавляли молнбдат аммония и аминонафтолсульфонат-реагент: поглощение окрашенного реакционного раствора измеряли при 660 или 680 нм. Или, например, индикаторную реакцию останавливали добавлением сернокислого раствора молибдата аммония, который взаимодействовал с выделившимся при ферментативном гидролизе фосфат-ионом (схема 6). Образовавшееся гетерополисоединснис экстрагировали изобутанолом и восстанавливали раствором-хлорида олова (II) до молибденовой сини, а затем измеряли оптическую плотность полученного синего раствора при 720 им [145]. Однако эти способы контроля скорости индикаторного процесса весьма трудоемки, поэтому мы остановили свой выбор на использовании п-нитрофенолят-иоиа в качестве индикаторного вещества и скорость ферментативного гидролиза контролировали спектрофотометр ически но нарастанию его оптической плотности во времени при 400 им. Мы установили, что в течение 3 мин после начала гидролиза я-НФФ оптическая плотность реакционного раствора возрастает линейно, поэтому скорость ферментативного процесса характеризовали величиной тангенса угла наклона (tgee) начальных линейных участков кинетических кривых, построенных в координатах оптическая плотность (Л400) - время (т, с). Начальную скорость индикаторной реакции рассчитывали как описано в гл. 4.3.
Для проведения реакции гидролиза л-НФФ в присутствии трех исследуемых щелочных фосфатаз, прежде всего, необходимо было выбрать подходящий буферный раствор. При выборе буферных систем основывались на литературных данных о наиболее широко используемых буферных растворах при работе со щелочными фосфатазами (табл. 2), а также учитывали доступность их компонентов. В результате для исследования нами были выбраны неорганические (боратный, карбонатный) и органические (mpwc-HCl, глициновый) буферные растворы, компоненты которых, согласно данным, приведенным в гл. 1, по-разному взаимодействуют с ферментом, субстратом, а также с ингибиторами и активаторами щелочных фосфатаз.
Скорость индикаторной реакции в зависимости от концентрации и рН буферных растворов различной природы изучали при таких концентрациях щелочных фосфатаз, при которых скорость ферментативного процесса составляет 7-9 мкМ/мин и наиболее удобна для регистрации в 0.05 М трис-\\С\-буферном растворе с рИ 9.8. Этот буферный раствор чаще других используют при работе со щелочными фосфатазами (табл. 2), поэтому каталитическую активность трех ферментов в других буферных системах сравнивали с их активностью в mpuc-HCl-буферном растворе.
Эксперименты проводили по Методике 1 А, приведенной в гл. 4. Из рис. 9 видно, что пне зависимости от источника щелочные фосфатазы наименее активны в боратиом буферном растворе. Интересно отметить, что при очень низких ( 5 мкМ) концентрациях этого буферного раствора активность щелочных фосфатаз в нем практически такая же, как при проведении индикаторной реакции в подщелоченной воде (рН 9.8). Этот факт подтверждает отсутствие акцепторной способности . компонентов боратного буферного раствора по отношению к фосфат-ионам. Роль акцептора в данном случае выполняет вода, акцепторные свойства которой закономерно уменьшаются при повышении концентрации боратного буферного раствора (рис. 9).
Поведение щелочных фосфатаз из кишечника цыпленка и тол кой кишки тюленя в карбонатном буферном растворе при рН 9.8 также можно объяснить акцепторными свойствами воды. Из рис. 9 (б, в) видно, что эти ферменты лишь немногим более активны в карбонатном буферном растворе, чем в боратном. Эго незначительное различие в активности объясняется, по-видимому, тем, что гилрокарбоиат-ионы, преобладающие в карбонатном буферном растворе при рН 9.8 (доля гидрокарбонат-ионов а = 74,67%), способны координироваться вокруг ионов цинка и магния активного центра щелочных фосфатаз, давая возможность воде в большей степени проявить акцепторные свойства по отношению к фосфат-иону. Следует отметить, что, несмотря на практически одинаковое значение констант устойчивости комплексов гидрокарбонат-иоїт с ионами цинка и магния (табл. 8), у последнего в условиях нашего эксперимента способность к образованию комплекса значительно выше (ct/n=0.001; p (Zn)=0.56 и ctMg=l; P (Mg)=13.03 соответственно). Поскольку основной вклад в проявление ферментом активности вносят ионы цинка каталитического центра, то связывание магния (II) практически не сказывается на каталитической способности рассматриваемых щелочных фосфатаз.
Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз различного происхождения
Ранее отмечалось (гл. 2.1). что ионы кобальта, никеля, свинца, кадмия и меди, обладая близкими с ионами цинка ионными радиусами и эффективными зарядами (табл. 5), могут потенциально замещать ионы ципка и магния в каталитическом и аллостерическом центрах и мешать определению последних ферментативным методом; поэтому нами было изучено влияние указанных ионов металлов натри щелочные фосфатазы.
Изучение характера влияния свинца (II) на каталитическую активность щелочных фосфатаз из E.coli и кишки тюленя представляло самостоятельный интерес, поскольку ранее [149] ингибирующее действие свинца (II) на щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка в реакции гидролиза п-НФФ было положено в основу высокочувствительного (сМ1Ш = 0.1 нг/мл) ферментативного метода его определения.
Как отмечалось нами ранее в гл. 2 обзора литературы, не только ионы металлов, но и их гидроксокомплексы способны ипгибировать каталитическую активность щелочных фосфатаз. В связи с этим мы изучили также влияние на активность трех щелочных фосфатаз легко гидролизуемых ионов металлов, таких, как Fe(III) и Hg(II). Кроме того, Fe(III) наиболее часто присутствует в различных объектах.
В результате проведенного исследования установили, что кобальт (II), никель (II), медь (II), кадмий (II), ртуть (II) и железо (III) при концентрациях 1 мкг/мл и ниже в реакционной смеси не влияют на скорость индикаторной реакции (реакцию проводили в 0.05 М триоНС!-буферном растворе рН 9.8), катализируемой щелочными фосфатазами из всех трех источников. Свинец (II) при этих же концентрациях не изменяет каталитическую активность фосфатаз из E.coli и кишки тюленя, а щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка ипгибирует на 60%, что согласуется с результатами более ранних исследований [149].
Таким образом, обнаруженное нами ингибирующес действие ионов цинка на щелочную фосфатазу из кишки тюленя оказалось не только самым эффективным, но и самым селективным.
Это действие цинка (II) было положено в основу селективной ферментативной методики его определения в интервале концентраций 1-Ю мкг/мл (0.015-0.15 мМ). Уравнение градуировочного графика имеет вид: у = 5.57 - 3.02х, где у - v, мкМ/мин, х - lg{Czn(ii), мкг/мл}; sr= 0.03 (n = 5, Р = 0.95) при с„.
С целью повышения чувствительности и селективности определения цинка (II) по его ингибирующему действию на щелочную фосфатазу из кишки тюленя было изучено влияние этого иона и ионов других двухвалентных металлов на каталитическую активность этого фермента в различных буферных растворах (боратном, карбонатном, глициновом), оптимальные условия проведения индикаторной реакции в которых выяснены нами ранее (табл. 9, глава 5.3). Обнаружено, что цинк (II) ингибирует щелочную фосфатазу из кишки тюленя во всех исследованных буферных системах, но в различных диапазонах его концентраций (рис. 18). В неорганических (боратном и карбонатном) буферных растворах ингибирующес действие цинка (II) начинает проявляться при более низких его концентрациях и в значительно большей степени (рис. 18, кривые 1 и 2), чем в буферных растворах органической природы. Концентрации цинка (II), при которых степень ингибирования составляет 50% в боратном, карбонатном, трис-\\С\ и глициновом буферных растворах: 0.04; 0.25; 1.5 и 2.2 соответственно, что коррелирует с величинами констант устойчивости их комплексов (табл. 8). Наименее благоприятным буферным раствором для проявления ингибирующего действия цинка (II) является глициновый, в котором для достижения той же степени (-90%) ингибирования, что и в боратном буферном растворе, требуется почти п 2 раза большая концентрация цинка (II). При одной и той же концентрации цинка (II) -1 мкг/мл, степени ингибирования фермента в карбонатном и глициновом
буферных растворах различаются более, чем в 4 раза (рис. 18). Таким образом, в неорганических буферных растворах - боратном и карбонатном цинк (II) можно определять по ингибирующему действию на фермент с большей чувствительностью, чем в органических буферных системах. Очевидно, это связано с тем, что равновесная концентрация иона металла в неорганических буферных растворах выше, чем в органических (особенно глициновом), способных образовывать устойчивые комплексы с цинком (II) (табл. 8). Выход всех кривых зависимости на плато при концентрации цинка (II) 5 мкг/мл можно объяснить, по-видимому, насыщением цинк-связывающих центров фермента ионами данного металла при достаточно высоких его содержаниях в реакционной смеси.
Следует отдельно остановиться на рассмотрении взаимодействия цинка (II) в глициновом буферном растворе со щелочными фосфатазами изо всех трех источников, а не только из кишки тюленя. Ранее (гл. 5) нами было показано, что выдерживание щелочных фосфатаз из трех источников в глициновом буферном растворе приводит к снижению в той или иной степени (табл. 10) их каталитической активности по сравнению с исходной. Было высказано предположение, что такое снижение связано с тем, что в условиях эксперимента глицин полностью диссоциирован, благодаря чему способен взаимодействовать с металлсвязывающими центрами фосфатаз. Для доказательства этого предположения ко всем щелочным фосфатазам после выдерживания их в глициновом буферном растворе в течение 5 мин добавили извне ионы цинка в концентрации I мкг/мл, при которой они ингибируют в разной степени все три щелочные фосфатаз ы.
Результаты данного эксперимента показали, что после введения в систему ионов цинка каталитическая активность щелочных фосфатаз из E.coli и кишки тюленя не только восстанавливается до исходной, но и примерно в два раза превышает ее. Это, по-видимому, свидетельствует о том, что на момент введения в индикаторную систему субстрата часть ионов цинка активных центров фосфатаз ировзаимодействовала с глицином, поэтому исходная активность не является истинной. Следовательно, изначально мы фиксируем не истинную, а несколькозаниженнуюактивностьфермента.
