Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Методологические и методические аспекты определения антиоксидантов в объектах 21
1.1. Методологическое значение антиоксидантов 21
1.1.1. Терминология антиоксидантов и антиоксидантной активности 21
1.1.2. Классификация антиоксидантов 25
1.1.3. Механизмы действия антиоксидантов 28
1.2. Методы и модельные системы определения антиоксидантной активности объектов 33
1.2.1. Хемилюминесцентные методы 34
1.2.2. Кинетические методы 36
1.2.3. Фотоколориметрические, спектрофотометрические, ЭПР методы 38
1.2.4. Электрохимические методы 41
1.2.4.1. Кулонометрическое определение интегральной антиоксидантной емкости объектов 41
1.2.4.2. Потенциометрический метод определения суммарной антиоксидантной активности объектов 42
1.2.4.3. Амперометрические и вольтамперометрические методы 44
1.2.5. Методы, основанные на взаимодействии антиоксидантов с кислородом и его активными радикалами 46
1.3. Восстановление кислорода в биологических средах 51
ГЛАВА II. Обоснование выбора электровосстановления кислорода как модельного процесса для определения антиоксидантной активности объектов 57
2.1. Процесс электровосстановления кислорода (ЭВ 02) в водных и неводных средах
2.1.1. Влияние материала электрода 58
2.1.2. Влияние природы растворителя 62
2.1.3. Влияние рН раствора 69
2.1.4. Влияние состава электролита 71
2.1.5. Обоснование использования электровосстановления кислорода как модельного процесса для оценки антиоксидантной активности объектов. 71
2.2. Закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии поверхностно активных веществ 73
2.2.1. Влияние ПАВ на процесс ЭВ Ог на ртутно-пленочном, стеклоуглеродном и платиновом электродах при различных рН. 77
2.2.2. Закономерности процесса ЭВ 02 на платиновом электроде в присутствии ПАВ 85
ГЛАВА III. Физико - химические закономерности процесса ЭВ От в присутствии антиоксидантов 93
3.1. Аппаратурное и методическое оформление 93
3.2. Влияние природы антиоксидантов на процесс ЭВ Ог
3.2.1. Физико - химические закономерности влияния каталазы на процесс ЭВ Ог. 101
3.2.2. Закономерности влияния антиоксидантов фенольной природы на процесс ЭВ Ог 106
3.2.3. Физико-химические закономерности процесса ЭВ Ог в присутствии N, S, Se содержащих антиоксидантов 114
3.2.4. Закономерности процесса ЭВ 02 в присутствии антиоксидантов, взаимодействующих с кислородом и его активными радикалами по параллельной схеме 118
ГЛАВА IV Определение суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения 128
4.1. Критерии оценки антиоксидантной активности объектов 128
4.2. Процедура проведения эксперимента 137
4.3. Методы планирования эксперимента в оптимизации определения антиоксидантной активности объектов 138
4.4. Исследование антиоксиданной активности металлокомплексов, катализирующих процесс ЭВ СЬ
4.4.1. Антиоксидантная активность каталазы 146
4.4.2. Антиоксидантные свойства гуминовых кислот, полученных из торфов 147
4.5. Вольтамперометрическое определение антиоксиданной
активности соединений фенольной природы 153
4.5.1. Антиоксидантные свойства некоторых флавоноидов и оптимизация параметров их активности 154
4.5.2. Антиоксидантные свойства производных кумарина 171
4.5.3. Антиоксидантные свойства некоторых производных фенола в апротонных средах 176
4.5.4. Антиоксидантные свойства коэнзима Qio 180
4.5.5. Антиоксидантные свойства некоторых витаминов 183
4.5.5.1. Антиоксидантная и биологическая активность жирорастворимых витаминов Е, А 183
4.5.5.2. Оценка антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты и некоторых ее солей 187
4.5.5.3. Антиоксидантные свойства витаминов группы В6 193
4.6. Исследование антиоксидантных свойств N, Se содержащих соединений 197
4.6.1. Антиоксидантная активность Se содержащих БАД 197
4.6.2. Антиоксидантные свойства производных антипирина, антипириламида и бенздиазепина 199
4.7. Вольтамперометрический метод определения суммарной антиоксидантной актвности объектов искусственного и природного происхождения 209
4.7.1. Антиоксидантные свойства лекарственного растительного сырья 209
4.7.1.1. Водные, водно - этанольные экстракты ряда растений флоры Сибири 210
4.7.1.2. Антиоксидантные свойства лабазника вязолистного
2 4.7.1.3. Антиоксидантные свойства экстрактов растения Альфредии 219
4.7.1.4. Антиоксидантные свойства экстрактов побегов черники обыкновенной 2 4.7.2. Исследование антиоксидантных свойств препаратов фармацевтического назначения 226
4.7.3. Оценка антиоксидантнои активности продукции косметической промышленности 232
4.7.4. Исследование антиоксидантнои активности продукции пищевой промышленности 237
4.7.4.1. Антиоксидантные свойства пищевых консервантов 238
4.7.4.2. Оптимальная антиоксидантная композиция для улучшения качества питьевой минеральной воды 243
4.7.5. Вольтамперометрическое определение антиоксидантнои активности биологических объектов 248
ГЛАВА V. Исследование электрохимических свойств антиоксидантов методом циклической вольтамперометрии 256
5.1. Антиоксиданты фармацевтического назначения 258
5.1.1. Антипирин и его галоген - производные 258
5.1.2. Производные антипириламида 264
5.2. Некоторые антиоксиданты фенольной природы 271
5.2.1. Электрохимические свойства некоторых флавоноидов 274
5.2.2. Некоторые производные кумарина 278
5.2.3. КоэнзимСЬо 281
5.3. Взаимосвязь между антиоксидантними свойствами соединений фенольной природы и их электрохимическими параметрами 283
ГЛАВА VI. Методика определения показателя суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения 288
6.1. Сравнительные испытания методик определения антиоксидантной активности объектов с использованием разных методов 289
6.1.1. Спектрофотометрическое и вольтамперометрическое определение 289
6.1.2. Определение антиоксидантной активности производных ацетилсалициловой кислоты тремя различными методами 295
6.1.3. Определение суммарной антиоксидантной активности БАВ кинетическим и вольтамперометрическим методами
6.2. Подготовка вольтамперометрической методики к аттестации 298
6.3. Утверждение типа вольтамперометрического анализатора по определению показателя антиоксидантной активности объектов 308
Обсуждение результатов 310
Выводы 325
Список литературы
- Терминология антиоксидантов и антиоксидантной активности
- Влияние материала электрода
- Физико - химические закономерности влияния каталазы на процесс ЭВ Ог.
- Вольтамперометрический метод определения суммарной антиоксидантной актвности объектов искусственного и природного происхождения
Введение к работе
Актуальность темы. Антиоксидант, как вещества, предотвращающие зарождение и развитие свободно - радикальных процессов окисления в объектах органического и неорганического происхождения, нашли широкое применение в химической, пищевой, косметической, фармацевтической промышленности, биологии и медицине в последнее время. Особенно широко антиоксиданты применяются в составе биологически - активных добавок, косметических средств, фармацевтической продукции. Лавинообразный рост подобной продукции на рынке предъявляет все более серьезные требования к сертификации товара. В настоящее время в нормативных документах РФ не существует единого показателя антиоксидантной активности подобных препаратов. Для проверки их качества используются длительные, трудоемкие, не всегда сопоставимые и неточные исследования, опирающиеся иногда на неаттестованные методики. Необходимость введения новых методик и приборов, обеспечивающих надежные результаты по определению суммарной антиоксидантной активности подобных препаратов, является актуальной задачей, от решения которой зависит качество, эффективность и безопасность предлагаемых на рынке продуктов.
В последнее время в литературе предлагается большое число методов по определению антиоксидантов и их активности. Однако, эти данные имеют разрозненный характер, используют разные модельные системы, представления о характере их действия на радикалы различной природы. Полученные результаты имеют разные размерности, что не позволяет сопоставить их друг с другом. Достаточно мало аттестованных методик и сертифицированных приборов, способных быстро и на качественном уровне определить суммарную антиоксидантную активность продукции. Недостаточно сведений о влиянии ряда факторов на антиоксидантные свойства продукции, например, рН среды, природы самих антиоксидантов, растворителя и др. Недостаточно изученными факторами остаются эффективная концентрация антиоксидантов, время их активного действия и совместимость компонентов в смесях антиоксидантов. Поэтому обобщение информации и поиск новых подходов к определению антиоксидантов и их активности на данном этапе является весьма актуальной задачей.
Одними из перспективных и доступных методов определения активности антиоксидантов являются электрохимические методы, обладая низкой себестоимостью, высокой чувствительностью, возможностью анализировать как водные, так и неводные среды. В России большой вклад в развитие электрохимии антиоксидантов внесли такие ученые, как Г.К. Будников (Казанский государственный университет), Х.З. Брайнина (Уральский государственный экономический университет), З.А. Темердашев (Кубанский государственный университет) и другие.
Достаточно удобным для определения антиоксидантов и их активности является вольтамперометрический метод, так как он, как и антиоксиданты, весьма чувствителен к наличию в среде кислорода и его активных радикалов. Это позволило предложить новый подход к определению суммарной антиоксидантной активности объектов, используя в качестве модельной системы процесс электровосстановления кислорода в отсутствии и при наличии антиоксидантов различного происхождения. Поскольку с участием кислорода протекает большинство окислительных процессов в объектах органического и неорганического происхождения, такой подход должен быть успешным и в
некоторой степени моделировать характер взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами в организме человека и животных.
Цель работы: Развитие теории и практики вольтамперометрического метода определения активности антиоксидантов на основе модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант. Создание на этой основе методического обеспечения для определения суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи.
-
Обосновать выбор модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант для определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Рассмотреть влияние различных факторов: рН среды, природы растворителя, концентрации молекулярного кислорода, на процесс электровосстановления кислорода. Показать возможность использования относительного изменения тока электровостановления кислорода в присутствии антиоксидангов на ртутно - пленочном электроде как средство измерения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.
-
Исследовать влияние поверхностно активных веществ, сопутствующих антиоксидантам в различных объектах, на процесс электровосстановления кислорода. Рассмотреть закономерности влияния различных факторов (рН среды, материала электрода) на процесс электровосстановления кислорода в присутствии разных типов поверхностно активных веществ.
3. Изучить физико-химические закономерности процесса
электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной
природы. Предложить преимущественные механизмы взаимодействия
антиоксидантов с кислородом и его активными формами.
4. Осуществить и обосновать выбор количественных критериев оценки
антиоксидантной активности объектов искусственного и природного
происхождения на основании относительного изменения тока
электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов.
5. Провести оценку антиоксидантной активности индивидуальных
антиоксидантов, их смесей, объектов искусственного и природного
происхождения. Выявить наиболее активные соединения. Рассмотреть влияние
концентрации, времени взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его
активными радикалами, рН среды, совместимости компонентов в смесях на
антиоксидантную активность объектов.
-
Исследовать электрохимические свойства ряда антиоксидантов. Особое внимание уделить впервые синтезированным соединениям с антиоксидантными свойствами, таким, как производные антипирина, антипириламида, кумарина, имеющими фармацевтическое значение. Определить оптимальные условия получения аналитического сигнала с целью дальнейшей разработки методик их количественного определения. Установить взаимосвязь между антиоксидантными свойствами и электрохимическими параметрами (потенциалами окисления) антиоксидантов на примере ряда флавоноидов и витаминов.
-
Разработать методику определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения на основе полученных закономерностей. Рассчитать основные метрологические характеристики методики в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2002, действующего на территории РФ.
Провести сравнительные испытания методики с другими известными методами определения активности антиоксидантов. Разработать вольтамперометрический анализатор для определения показателя антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Провести сертификацию нового анализатора. Научная новизна
-
Впервые предложен новый подход на основе метода вольтамперометрии и модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант для оценки суммарной антиоксидантной активности объектов искусственного (продукция пищевой, косметической, фармацевтической промышленности) и природного (экстракты растений, вытяжки торфа, биологические объекты) происхождения.
-
Впервые проведены и обобщены исследования по влиянию поверхностно активных веществ, сопутствующие антиоксидантам, на процесс электровосстановления кислорода. Показан неоднозначный характер данного влияния, зависящий от материала электрода, рН среды, типа поверхностно активных веществ. На основе изученных закономерностей показано, что только на платиновых металлах в кислых средах наблюдается пропорциональное уменьшение тока кислорода в присутствии поверхностно активных веществ. На этой основе разработан новый способ определения суммарного содержания поверхностно - активных веществ в водных средах. На ртутно - пленочном электроде подобной закономерности не обнаружено, что дает возможность использовать данный процесс для определения антиоксидантной активности объектов в присутствии поверхностно активных веществ.
-
Впервые установлены физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Получены новые уравнения для тока кислорода, осложненного наличием предшествующей и последующей химических реакций взаимодействия с антиоксидантами в условиях линейной полубесконечной диффузии на твердых электродах. На основе этого предложены и обоснованы преимущественные механизмы взаимодействия антиоксидантов с кислородом и его активными формами. Установлено, что для каталазы, как фермента антиоксидантной природы, характерен механизм с последующей химической реакцией диспропорционирования и частичной регенерацией деполяризатора. В присутствии антиоксидантов фенольной природы наблюдается преимущественное протекание электродного процесса восстановления кислорода с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами. Для N, S и Se содержащих антиоксидантов характерен механизм с преимущественным протеканием предшествующей химической реакцией взаимодействия с молекулярным кислородом.
-
Впервые предложены и теоретически обоснованы новые количественные критерии определения антиоксидантной активности объектов по отношению к процессу электровосстановления кислорода: емкостный (мг/л)" критерий, отражающий степень изменения модельного сигнала в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе; кинетический критерий (мкмоль/л мин), отражающий концентрацию кислорода и его активных форм, прореагировавших с антиоксидантом за минуту времени.
-
С использованием факторного эксперимента, метода крутого восхождения и центрального ортогонального композиционного планирования, впервые получены математические модели первого и второго порядков для определения активности антиоксидантов в зависимости от концентрации и времени их взаимодействия с кислородом и его активными формами. Полученные уравнения позволяют определять эффективные концентрации и время активного действия антиоксидантов по отношению к процессу электровосстановления кислорода.
-
С использованием кинетического и емкостного критериев впервые выявлено значительное влияние ряда факторов, таких, как рН среды, природы растворителя при выделении компонентов растительного сырья, совместимости компонентов в смесях, на антиоксидантные свойства объектов. На примере токоферола моногликозида показано, что данный антиоксидант наиболее активен в нейтральной области рН (7,1 - 7.3). При фракционировании экстрактов растений выявлена наиболее активная этилацетатная фракция, которая рекомендована для наиболее полного извлечения антиоксидантов из растительного сырья. При оценке совместимости компонентов в смесях антиоксидантов показано, что при увеличении числа компонентов (больше 2) их суммарная антиоксидантная активность падает, при этом аддитивности сигнала не наблюдается. На основе данных исследований предложена наиболее эффективная композиция из числа исследованных антиоксидантов на основе аскорбиновой кислоты и дигидрокверцетина в соотношении 1:1.
-
Методом циклической вольтамперометрии впервые установлены механизмы протекания электродных процессов окисления - восстановления ряда вновь синтезированных соединений с антиоксидантными свойствами, имеющими фармацевтическое значение (производные антипирина, антипириламида, кумарина). Показан обратимый характер протекания процессов, определены потенциалы окисления - восстановления исследуемых соединений. Найдены оптимальные условия получения аналитического сигнала (пиков окисления) для исследованных веществ.
-
Найдена взаимосвязь между электрохимическими свойствами (потенциалами окисления) и антиоксидантной активностью веществ. Получено уравнение, которое позволяет прогнозировать значения электрохимических потенциалов окисления и осуществлять целенаправленный синтез и анализ новых соединений с антиоксидантными свойствами.
Достоверность разработанных научных положений и сформулированных выводов обеспечена корреляцией полученных экспериментальных результатов с теоретическими, хорошей сопоставимостью с литературными данными, получением согласованных результатов сравнительных определений вольтамперометрического метода с независимыми аналитическими спектрофотометрическими, кинетическими, флуоресцентными методами, оценкой основных метрологических характеристик результатов определения с помощью методов математической статистики в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2002, действующего на территории РФ.
Практическая значимость работы. Исследование антиоксидантных свойств широкого круга объектов методом вольтамперометрии на основе процесса электровосстановления кислорода, позволило выявить наиболее активные антиоксидант, их композиции, предложить способ фракционирования экстрактов растений и дать рекомендации для их дальнейшего использования в фитотерапии.
С использованием полученных результатов фирмой «Диадема» (г. Иркутск) разработана новая биологически - активная добавка «Лавитол», прошедшая необходимую процедуру сертификации и допущенная к применению как профилактическое средство сердечно - сосудистых заболеваний. Фирма «Биокор» (г. Новосибирск), используя результаты данной работы, выпустила на рынок новый кисломолочный продукт «Наринэ-2» с улучшенными свойствами.
При исследовании антиоксидантной активности нового синтезированного препарата токоферолмоногликозида выявлены оптимальная концентрация, время активного действия антиоксиданта, рН среды. Результаты данной работы внедрены в НИИ онкологии г. Томска для разработки рекомендаций к лечению и профилактике онкологических заболеваний с использованием данного препарата.
На основе результатов определения совместимости компонентов в смесях антиоксидантов разработаны эффективные антиоксидантные композиции, улучшающие качество питьевой минерализованной воды, косметической продукции. На основе полученных результатов фирма «Кора» (г. Москва) разработала новые косметические средства антиоксидантного назначения, способствующие эффективной защите и омоложению клеток кожи.
Разработан анализатор «Антиоксидант» для определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения. Прибор прошел государственные испытания, по результатам которых ему присвоен тип средства измерения - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат RU.C.31.113.A № 28715) и внесен в единый ГОСреестр СИ под номером 35466-07. В настоящее время анализатор прошел международную сертификацию в Чехии (г. Прага) (Сертификат ІЕС № 603066-01/01 of 11.07.2008) и допущен к применению в аналитических и научно-исследовательских лабораториях Европы и Америки.
На защиту выносятся следующие положения:
-
Обоснование выбора вольтамперометрического метода и модельной системы: кислород, активные формы кислорода - антиоксидант для определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения.
-
Результаты оценки влияния поверхностно активных веществ, сопутствующих антиоксидантам, на процесс электровосстановления кислорода в зависимости от материала электрода, рН среды, типа поверхностно - активного вещества.
-
Физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов различной природы. Классификация антиоксидантов по механизмам их взаимодействия с кислородом и его активными формами.
-
Количественные критерии определения антиоксидантной активности объектов по отношению к процессу электровосстановления кислорода: емкостный (мг/л)" критерий, отражающий степень изменения модельного сигнала в зависимости от концентрации антиоксиданта в растворе; кинетический критерий (мкмоль/л-мин), отражающий концентрацию кислорода и его активных форм, прореагировавших с антиоксидантом за минуту времени.
-
Результаты определения антиоксидантной активности по отношению к процессу электровостановления кислорода ряда индивидуальных веществ, объектов искусственного и природного происхождения.
-
Результаты определения электрохимических свойств (потенциалов окисления - восстановления) производных антипирина, антипириламида, кумарина, в модельных растворах и лекарственных формах. Выявленные зависимости между электрохимическими свойствами (потенциалами окисления) и антиоксидантной активностью ряда флавоноидов и витаминов.
-
Результаты сравнительных определений антиоксидантной активности некоторых биологически активных веществ с использованием метода вольтамперометрии и независимых аналитических методов анализа (спектрофотометрический, флуориметрический, амперометрический с использованием биосенсора).
-
Методика определения антиоксидантной активности объектов искусственного и природного происхождения по отношению к процессу электровосстановления кислорода.
Апробация работы Основные результаты диссертации доложены и обсуждены
на следующих Международных и Всероссийских конференциях: VI Межд. конф.
«Биоантиоксидант» (г. Москва 2002); Int. conf. "Euroanalysis-12", (Dortmund,
Germany, 2002); Всерос. конф. «Актуальные проблемы аналитической химии» (г.
Москва, 2002); Всерос. научно -практ. конф. «Химия и технология лекарственных
препаратов и полупродуктов» (г. Новокузнецк 2002); I, II, III, IV Всерос. научн.
конф. «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (г. Томск, 2000,
2002, 2004, 2006); 203rd Meeting of the electrochemical society (Paris, France 2003);
XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (г. Казань 2003); Int.
conf. Euro Food Chem XII (Brugge, Belgium 2003); Научно- практ. конф.
«Технология органических веществ и высокомолекулярных соединений» (г.Томск,
2003); 3-rd, 4-th, 5- th Int. conf. "Instrumental Methods of Analysis" (Greece 2003,
2005, 2007); V Всерос. конф. «Экоаналитика - 2003». (Санкт- Петербург 2003); 7".-
Int conf. on pharmacy and applied physical chemistry (Innsbruck, Austria 2003); 15th Int.
symp. of pharmaceutical and biomedical analysis (Florence, Italy 2004); Int. conf.
"Euroanalysis - 13" (Salamanca, Spain 2004); I семинара «Методы и средства
определения антиоксидантной активности препаратов». (г.Москва, 2004); VII
Всерос. науч. конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока», (г.Новосибирск
2004); 10th Int. conf. on electroanalysis (Ireland 2004); Всерос. научн. конф.
«Электроаналитика-2005». (г.Екатеринбург 2005); научно - практ. конф,
«Технологии и продукты здорового питания» (г. Москва 2005); Межд. симп.
«Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (г. Тюмень 2005); Int. conf
"Analytical chemistry and chemical analysis". (Kyev, Ukraine. 2005); 2-nd Int. symp. on
Recent advances in food analysis. (Prague Czech Republic 2005); 8-ой Межд. семинар
«Биотехнология-2005» (Пущине 2005); 2-ой Всерос. конф.
«Аналитические приборы 2005» (г Санкт-Петербург 2005); 9-th Annual meeting of the Israel analytical chemistry society (Tel-Aviv Israel 2006); 13-th World congress "Food in life". (Nantes. France 2006); Int. congress ICAS-2006. (Moscow, Russia 2006); III Всерос. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г.Барнаул, 2007); Int. conf. "4th Black Sea basin conference on analytical chemistry" (Sunny Beach, Bulgaria 2007); Int. conf. "Euroanalysis XIV". (Antwerp, Belgium 2007); Межд. XVIII Менделеевский съезд по общей и
прикладной химии (г.Москва 2007); II Всерос. конф. по аналитической химии с межд. участием (г. Туапсе 2007); Всерос. научно- практ. конф. «Здоровое питание -основа жизнедеятельности человека» (г.Красноярск 2008); VII Всерос. конф. «ЭМА - 2008» (г. Уфа 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 128 печатных работ в виде 43 статей (29 статей входит в список журналов, рекомендованных ВАК), материалов докладов и конференций, 4 патентов РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6-ти глав, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 370 наименований, изложена на 368 страницах текста, содержит 70 таблиц, 104 рисунка и 3 приложения на 30-страницах.
Терминология антиоксидантов и антиоксидантной активности
Термин «Антиоксидант» произошел от английского слова «Antioxidant» и характеризовал вещество, препятствующее окислительным процессам в объектах [2,3]. Более широкое применение антиоксиданты получили в предотвращении окислительных процессов деструкции полимеров и характеризовались как ингибиторы или стабилизаторы свободно-радикальных процессов окисления [4].
В последнее время антиоксиданты широко используются как регуляторы окислительного метаболизма в живых организмах [5]. Они характеризуются способностью в малых количествах различными путями нейтрализовать свободные радикалы, регулировать субстратный состав окислительных реакций, взаимодействовать с вторичными продуктами или обрывать цепные реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ). В широком смысле "антиоксидант" может быть определен как молекула, которая защищает биологическую мишень от окислительного разрушения [6].
С точки зрения химизма процессов окисления, антиоксиданты можно рассматривать как вещества, проявляющие свою восстановительную природу по отношению к рассматриваемому (модельному) процессу [7].
В последнее время большое значение в литературе уделяется биоантиоксидантам. В механизме повреждения клеток важную роль играют кислород - зависимые свободнорадикальные процессы, запускающие в мембранах клеток реакции перекисного окисления. Активные кислородные радикалы являются высокореакционноспособными промежуточными продуктами восстановления кислорода, оказывающими токсическое действие на клетки организма. Основными объектами нападения свободных радикалов являются фосфолипиды клеточных мембран, в состав которых входят ненасыщенные жирные кислоты, что ведет к повреждению мембрансвязанных белков, инактивации ферментов и повреждению ДНК клеток [8-11].
Клеточная мембрана не только механически ограничивает содержимое клетки от внешней среды, но и выполняет множество жизненно важных функций: осуществляет связь клетки с другими клетками и организмом в целом; через нее активно поступают необходимые для ее жизни молекулы и удаляются отработанные продукты. Повреждение даже небольшого участка мембраны приводит к значительным нарушениям в нормальном метаболизме, а затем и к смерти клеток. Кроме того, избыточное окисление липидов приводит к резкому нарушению физико-химической структуры мембран. Конкретный механизм может быть различным: изменение заряда на поверхности раздела мембрана - раствор; изменение конформации мембранного липопротеинового комплекса; образование молекул - переносчиков ионов или появление гидрофильных включений в сплошном гидрофобном слое мембраны. Ненасыщенные жирные кислоты определяют степень эластичности, внутренней гидрофобной зоны мембран, ответственной за малую проницаемость их по отношению к полярным соединениям. Появление в этой гидрофобной области гидроксилов и полярных продуктов ПОЛ может привести к образованию водных пор, резко нарушить стабильность данного слоя мембран и привести к ее полному разрыву [8].
Биологическое действие липидных пероксидов на белки связано с их высокой эффективностью как окислителей, с одной стороны, и способностью некоторых продуктов ПОЛ (альдегидов и кетонов) образовывать стабильные ковалентные связи с отдельными функциональными группами белков — с другой стороны. Окислительная активность пероксидных продуктов может реализоваться при взаимодействии с SH-группами белковых молекул, в способности данных соединений окислять витамины А и Д, цистеин, глутатион, нуклеотиды. Взаимодействие продуктов перекисного окисления липидов с белками-ферментами приводит к их инактивации [11].
В настоящее время научно доказано, что изменения в биологических мембранах, которые происходят под действием свободных радикалов, являются причиной развития многих заболеваний [12]. В кардиологии яркими проявлениями оксидативного стресса являются повреждение миокарда, гипертония, атеросклероз [13-15]. Получено подтверждение непосредственного участия свободных радикалов в процессах старения организма [16,17]. Имеется обширная литература, посвященная проблеме связи злокачественного роста раковой опухоли со свободнорадикальными процессами в клетках [18-20].
Учитывая, что активные кислородные радикалы, а также первичные и вторичные продукты ПОЛ способны оказывать мощное повреждающее действие на биомембраны и молекулы жизненно важных биополимеров, в организме существует регуляторный механизм, ограничивающий накопление высокотоксичных свободнорадикальных интермедиатов, так называемый антиоксидантный статус организма. Регуляция многостадийных процессов ПОЛ осуществляется АО ферментативной и неферментативной природы. Ферментативные АО являются средством внутриклеточной защиты, и в сыворотке крови обнаруживается их следовое содержание. Важное значение в антиоксидантной защите в сыворотке крови играют несвязывающие белки и другие неферментативные АО — перехватчики свободных радикалов: витамины А, Е, К, каротины, убихиноны, мочевая кислота. В отличие от ферментативных АО, собственные неферментативные АО организма находятся как во внутренней среде, так и в клетках организма, перераспределяются между различными органами и вступают в кооперативные взаимодействия.
Для того чтобы охарактеризовать весь гетерогенный пул различных классов антиоксидантных веществ в целом, было введено неспецифическое интегральное понятие, обозначенное в литературе как "общая антиоксидантная емкость". Существует множество синонимов, обозначающих способность веществ (и многокомпонентных сред, какими являются биологические жидкости) ингибировать свободнорадикальные реакции — "антиоксидантный потенциал", "антиоксидантная буферная емкость" и др., среди которых наиболее часто применяется "общая, или суммарная антиоксидантная активность" (АОА).
Влияние материала электрода
В качестве еще одного фактора, влияющего на механизм процесса ЭВ 02, следует рассмотреть присутствие поверхностно активных веществ. Современное развитие промышленности приводит к более широкому использованию поверхностно активных веществ (ПАВ) в различных отраслях народного хозяйства. В последнее время появилось много работ об их влиянии на электрохимические процессы. В работе [166] отмечено ингибирование анодных пиков металлов в присутствии ПАВ пропорционально их концентрации, используя метод инверсионной вольтамперометрии. По мнению авторов [167], влияние ПАВ на электрохимическую реакцию приводит к изменению степени обратимости электродного процесса, уменьшению константы скорости электрохимической реакции и, соответственно, сдвигу потенциала, увеличению ширины полупика и уменьшению анодного или катодного токов.
Несмотря на широкое применение и всестороннее изучение процесса ЭВ 02, долгое время информация о влиянии ПАВ на данный процесс имела разрозненный характер. Ранее было отмечено, что в присутствии ПАВ в растворе уменьшается ток ЭВ 02 [168-170]. Последующие сведения о влиянии ПАВ на процесс ЭВ 02 имели противоречивый характер. Одни утверждали, что с ростом концентрации ПАВ в растворе ток ЭВ 02 уменьшался на 50%, а далее не менялся [171], другие указывали на отсутствие какого-либо влияния на процесс катодного восстановления кислорода [172].
В последнее время в связи с все более широким использованием ПАВ в промышленности, интерес к вопросу об их влиянии на процесс ЭВ 02 повысился. Встречаются сведения о влиянии конкретных органических веществ, обладающих специфической адсорбционной способностью, на полярографический максимум кислорода. В работе [173], рассматривается влияние 2,4-диарил-З-азобициклокетонов на полярографические максимумы О? и ряда металлов. В работе [174] отмечено отсутствие пропорционального характера влияния галотана (2-бром-2-хлор-1,1,1-трибромэтан), как ПАВ, пассивирующего электрод, на ток ЭВ 02.
Однако все эти работы не раскрывают причину столь неоднозначного влияния ПАВ на процесс ЭВ 02. Наиболее систематизированные данные по влиянию ПАВ на процесс ЭВ 02 даны в работе [105]. Автор работы исследовал ПАВ катионного и анионного типов. Показано, что данные ПАВ оказывают заметное влияние на процесс катодного восстановления кислорода на металлах первой группы [93], что выражается в уменьшении величины предельного тока ЭВ Ог, и не изменяют эту величину на металлах второй группы. Предположено, что на этих металлах ПАВ не влияют на процесс ЭВ Оі в связи с тем, что они сами могут принимать участие в передаче электрона от металла через адсорбированную частицу ПАВ в двойном электрическом слое (ДЭС) к восстанавливающейся молекуле кислорода со скоростью большей, чем скорость его диффузии. При этом восстановление кислорода по-прежнему будет проходить с диффузионным контролем, и величина тока, а, следовательно, и скорость процесса ЭВ 02 не изменяются. Предложенный механизм действия ПАВ подтверждается в данной работе также емкостными измерениями. Напротив, на металлах первой группы уменьшение доли свободной поверхности электрода вследствие покрытия ее адсорбционными частицами ПАВ приводит к уменьшению поверхностной концентрации От и Н0адс, а следовательно, скорость лимитирующей стадии процесса ЭВ О2 (1.3.8) уменьшается. На платиновом электроде, на котором в чистых растворах (без ПАВ) скорости процессов диффузии и собственно электрохимической замедленной стадии ЭВ От примерно одинаковы, значительное торможение скорости замедленной стадии при введении ПАВ в раствор приводит к тому, что процесс ЭВ Ог перестает быть зависимым от скорости диффузии и начинает определяться только кинетикой лимитирующей стадии процесса. Эксперименты, проведенные на вращающемся дисковом электроде с кольцом, подтвердили данные предположения.
В работе [133] изучено влияние ПАВ, адсорбирующихся в широкой области потенциалов, на электрохимическое поведение кислорода при различных значениях рН (3 рН 12) в условиях квазиобратимого электродного процесса на трех типах электродов (платиновом, ртутно-пленочном и стеклоуглеродном). Показано, что адсорбция ПАВ сложным образом влияет на предельный ток ЭВ 02, оказывая как ингибирующее, так и каталитическое влияние в зависимости от концентрации ПАВ, рН раствора, материала электрода. В большинстве случаев значение предельного тока восстановления кислорода при увеличении ПАВ в растворе колеблется в пределах своей первоначальной величины. Предполагается, что причина такого поведения лежит в механизме взаимодействия ПАВ с молекулой кислорода на поверхности электрода. Кроме того, адсорбируясь на поверхности электрода, ПАВ затрудняют процессы адсорбции-десорбции продуктов реакции ЭВ Ог, что ведет к накоплению и разложению пероксида водорода на поверхности электрода с образованием кислорода, что, в свою очередь, увеличивает невоспроизводимость результатов. Подтверждением такого механизма действия ПАВ на процесс ЭВ Ог служил так же сдвиг потенциала предельного тока ЭВ 02 в отрицательную сторону с увеличением концентрации ПАВ в растворе.
Показано, что в случае необратимого электродного процесса ЭВ 02, реализующегося на электродах первой группы и Pt, в том числе при рН 5, когда меняется механизм и характер лимитирующей стадии катодного восстановления кислорода, меняется и характер влияния ПАВ на данный процесс и его кинетические параметры. В данном случае наблюдалось ингибирование катодных волн кислорода с ростом концентрации ПАВ в растворе, однако сдвига потенциала предельного тока кислорода не происходило. Было сделано предположение, что механизм ингибирования электродного процесса ЭВ СЬ в присутствии ПАВ заключается в торможении как стадии доставки вещества к электроду, так и скорости электрохимической реакции переноса электрона. Введение ПАВ вызывает блокировку части рабочей поверхности электрода, конкурируя с H4 ), участвующего в данном процессе восстановления кислорода. Уменьшение поверхностной концентрации H4 ) приводит к торможению собственно электрохимической реакции ЭВ 02.
Физико - химические закономерности влияния каталазы на процесс ЭВ Ог.
По линейной части графика и по тангенсу угла наклона касательной к данному участку кривой рассчитывался показатель антиоксидантнои активности образцов — К, мкмоль/(л-мин) по формуле (4.1.4).
Использование относительного изменения тока электровосстановления кислорода позволяет значительно повысить точность метода, избежать влияния растворителя, окружающей среды и других побочных факторов на определение суммарной антиоксидантнои активности образцов [195].
Данный критерий носит эмпирический характер. Он был выведен для удобства в исследовании антиоксидантнои активности веществ и интерпретации результатов определения суммарного показателя антиоксидантнои активности сложных объектов (экстрактов растений, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности) [196].
Кинетический критерий освобождается от необходимости привлечения стандартного антиоксиданта и необходимости работать в строгом концентрационном диапазоне, что весьма удобно для определения суммарного показателя антиоксидантнои активности сложных объектов.
Каждый из предложенных критериев может быть использован для оценки суммарного показателя антиоксидантнои активности исследуемых объектов в зависимости от цели эксперимента. Например, если необходимо определить наиболее эффективную концентрацию антиоксиданта, используют концентрационный или биохимический критерий 1С5о. Если необходимо провести сравнительные определения, используя разные методы анализа, применяют международный критерий, выраженный в единицах ORAC с выбранным единым стандартом. Для сравнения антиоксидантнои активности различных объектов между собой удобно использовать кинетический критерий.
Таким образом, в зависимости от цели эксперимента, предложено несколько критериев оценки показателя антиоксидантнои активности исследуемых объектов. При выборе того или иного критерия несколько меняется процедура выполнения анализа, но в основе каждого из них лежит относительное изменение тока ЭВ Оо в присутствии антиоксидантов в растворе.
В электрохимическую ячейку помещали 10 см3 раствора фонового электролита. В качестве фонового электролита для водных сред использовали фосфатный буфер (фиксанальный раствор) с рН=6.86, для неводных сред использовали 0.1М NaC104 растворенный в диметилформамиде или ацетонитриле. Для работы собирали трехэлектродную ячейку, состоящую из рабочего РПЭ, хлорид-серебряного электрода используемого в качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода. Электроды опускали в раствор фонового электролита и подключали к полярографу ПУ—1 или анализатору ТА—2. Использовался постоянно-токовый режим катодной вольтамперометрии, скорость развертки потенциала варьировалась V = 10 - 100 мВ/с, рабочий диапазон потенциалов от 0 до -1 В, чувствительность прибора 10"6 А. Скорость развертки потенциала: 50 мВ/с. Перемешивали раствор с помощью магнитной мешалки или вибрации электродов 20 сек., затем 10 сек. - успокоение раствора. Далее снимали первую волну катодного восстановления кислорода, растворенного в фоновом растворителе, в указанной области потенциалов. Повторяли съемку вольтамперограммы не менее пяти раз. Идентификацию пика ЭВ СЬ определяли пропусканием газообразного азота через исследуемый раствор в течение 15- -20 мин, после чего на вольтамперограммах пик ЭВ СЬ полностью исчезал. Благодаря строгому выдерживанию времени и скорости перемешивания и успокоения раствора значительно уменьшалась ошибка эксперимента.
Известно, что концентрация 02 подвержена колебаниям в зависимости от температуры и давления окружающей среды, поэтому в качестве сигнала целесообразнее использовать относительное изменения высоты катодного тока 02. Устраняя необходимость контроля кислорода в исследуемом растворе, что явно усложнило бы методику, перед исследованием каждого вещества перемешивали раствор в открытой ячейке для полного насыщения фонового раствора кислородом воздуха, чтобы концентрация 02 оставалась неизменной от раствора к раствору и была равной его растворшмости в данном растворителе при н.у. (таблица 4.1.1).
Делали добавки приготовленного раствора испытуемого образца (для твердых образцов их первоначально переводили в растворенное состояние), каждый раз снимая вольтамперограммы первой волны катодного восстановления кислорода. Фиксировали изменение тока ЭВ 02 от концентрации образца в растворе или от времени взаимодействия антиоксиданта с кислородом и его активными радикалами. По полученным результатам строили соответствующие графики зависимости относительного изменения тока электровосстановления кислорода (—) от концентрации вещества в растворе (С) или от времени взаимодействия (t). По тангенсу угла наклона касательной к прямолинейному участку данных кривых рассчитывали соответствующие критерии антиоксидантной активности, К.
Вольтамперометрический метод определения суммарной антиоксидантной актвности объектов искусственного и природного происхождения
Проводилось исследование электрохимических свойств препарата ТМГ, имеющего в своей структуре фенольную и спиртовые гидроксильные группы, которые могут быть окислены или восстановлены на электроде. Для описания электрохимического поведения исследуемых веществ методом анодной вольтамперометрии важным вопросом является исследование зависимостей тока окисления или восстановления веществ от их концентрации в растворе. В связи с этим были сняты анодные вольтамперограммы ТМГ при разных концентрациях (рис. 4.7.9).
Наблюдался анодный пик окисления ТМГ при потенциале Е 0.55 В, причем высота анодного пика пропорциональна концентрации вещества в растворе. В рассматриваемом диапазоне потенциалов в данных условиях эксперимента катодных пиков вещества не наблюдалось.
Таким образом, изучено влияние рН раствора на антиоксидантные свойства препарата ТМГ. Показано, что наибольшая АОА наблюдалась в растворах при рН = 5.5 - - 8.0, что соответсвует рН крови человека и животного (рН=7.12 + 7.14). Предполагается, что это обусловлено стабильностью ТМГ фенольного радикала в нейтральной среде. Сдвиг потенциала предельного тока ЭВ Ог в более положительную область при добавлении исследуемого вещества в раствор фонового электролита свидетельствует о ЕС механизме взаимодействия ТМГ с активными кислородными радикалами.
В НИИ Онкологии г. Томска проводились испытания препарата ТМГ на животных (мышах). Как уже указывалось ранее, при введении препарата с пищей, предполагаемой защиты от радиационного воздействия не наблюдалось, животные погибали. По результатам данной работы были даны рекомендации по введению ТМГ внутривенно через кровь, рН которой лежит в пределах 7.12- -7.14. В данном случае защитные действия препарата были максимальными и животные выживали после смертельной дозы радиации. Проведенные исследования in vivo подтвердили результаы, полученные методом катодной вольтамперометрии на основе процесса ЭВ 02. Результаты работы опубликованы в журнале Talanta [316].
В косметике, основным предназначением которой является защита кожного покрова, широко используются природные и синтетические антиоксидантные системы - от индивидуальных веществ, до сложных природных композиций [331].
Главная роль АО в составе косметических средств - ингибирование процессов перекисного окисления липидов кожи, усиливающихся при развитии заболеваний кожи различной этиологии, воздействии УФ-лучей и других неблагоприятных факторов окружающей среды. Другой функцией антиоксидантных добавок является уменьшение образования пероксидов в самой косметике, которые образуются при длительном хранении и являются распространенной причиной дерматита и различных воспалительных процессов. Однако для более эффективной работы косметических средств необходимо соблюдать определенный баланс используемых веществ. Зачастую новые компоненты вводятся в продукцию в дозах, превышающих необходимый уровень, что не только не помогает, но ухудшает качество продукции. Кроме того, многие композиции просто несовместимы друг с другом, что может нанести вред организму.
Контролируя показатель АОА как отдельных ингредиентов, так и готовой продукции, можно выбрать наиболее эффективные композиции для повышения качества косметических средств, подобрать эффективный и безопасный стабилизатор для них. В связи с этим в данном параграфе исследовалась суммарная АОА готовой косметической продукции, а также водно-спиртовых экстрактов растительных объектов, входящих в их состав.
В качестве объектов исследования использовалась косметическая продукция ЗАО «Компания Кора» г. Москва: гель, крем и тоник.
Продукция имела следующий состав. Гель: карбопол 5.0 %, триэтаноламин 0.6 %, глицерин 2.0 %, Д-пантенол (провитамин В5) 1.0 %, консервант (ДМДМН - гидантоин) 0.2 % и вода 91.7 %. Крем: стеариновая кислота 2.0 %, эмульсионный воск 2.5 %, виноградное масло 0.5 %, триэтаноламин 0.3 %, глицерин 2 %, консервант (ДМДМН - гидантоин) 0.2 % и вода 87.5 %. Тоник: Д-пантенол (провитамин В5) 1.0 %, глицерин 2.0 %, консервант (ДМДМН - гидантоин) 0.2 % и вода 92.8 %. Карбонол -полимер акриловой кислоты, который нейтрализуют триэтаноламином для получения геля, эмульсионный воск - эмульгатор, стеариновая кислота и триэтаноламин во время приготовления крема образуют эмульгатор -триэтаноламинстеарат.
В качестве БАД использовались экстракты лекарственных растений -люцерны, солодки гладкой, клевера лугового и хмеля дикорастущего. Выбор данных растений обусловлен тем, что они обладают адаптогенным, противовоспалительным, успокаивающим, противоаллергическим действием [280, 302].
Для оценки влияния исследуемых образцов рассмотрены зависимости предельного тока ЭВ 02 от концентрации их в объеме раствора (рис. 4.7.10). Уменьшение тока ЭВ 02 и сдвиг потенциала полуволны в положительную обоасть свидетельствует о том, что входящие в состав косметической продукции растительные экстракты, представляющие собой сложную многокомпонентную смесь, содержат значительное количество БАБ фенольной природы, проявляя преимущественно ЕС механизм (п.3.2.2.).
