Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1. Механизмы образования свободных радикалов 11
1.1.1. Активация кислорода в ферментативных реакциях 11
1.1.2. Радикальные окислительные процессы 12
1.2. Основные механизмы защиты организма от активных форм кислорода 14
1.2.1. Взаимодействие низкомолекулярных тиольных антиоксидантов с активными формами кислорода 17
1.2.2. Взаимодействие низкомолекулярных фенольных антиоксидантов с активными формами кислорода 18
1.3. Методы исследования составляющих антиоксидантной защиты 21
1.4. Методы исследования общей антиоксидантной активности 26
1.4.1. Спектрофотометрические и люминесцентные методы исследования 26
1.4.2. Электрохимические методы определения антиоксидантов 30
1.4.3. Другие методы определения антиоксидантной активности 34
Глава 2. Экспериментальная часть 39
2.1. Аппаратура 39
2.2. Реактивы 39
2.3. Объекты исследования 40
2.4. Методы исследования 43
2.4.2. Фотохемилюминесцентный метод 43
2.4.3. Исследование противорадикальной активности с использованием стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила 44
2.4.4. Метод хемилюминесцентного определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), накапливающихся в мембранах липосом 44
2.4.5. Метод Фолина-Чокальтеу 45
2.4.6. Метод циклической вольтамперометрии 46
Глава 3. Исследование антиоксидантной активности природных и синтетических антиоксидантов 47
3.1. Исследование электрохимических процессов окисления-восстановления природных и синтетических антиоксидантов методом циклической вольтамперометрии 47
3.2. Исследование АОА потенциометрическим методом с использованием медиаторной системы 55
3.2.1. Обоснование выбора медиаторной системы 55
3.2.2.Оптимизация условий определения АОА 58
3.2.3. Исследование взаимодействия медиаторнои системы с природными водорастворимыми антиоксидантами 62
3.2.4. Исследование взаимодействия медиаторнои системы с водорастворимыми синтетическими антиоксидантами 66
3.2.5. Исследование взаимодействия медиаторнои системы с жирорастворимыми антиоксидантами 69
Глава 4. Корреляционные исследования 77
4.1. Определение корреляции АОА и общего содержания фенольных соединений в вине 77
4.2. Определение АОА потенциометрическим методом и методом перекисного окисления липидов 80
4.3. Хемилюминесцентные и потенциометрические исследования АОА лекарственных настоев и бальзамов 82
4.4. Противорадикальная и антиоксидантная активность водных и водно-этанольных экстрактов лекарственных трав 84
Глава 5. Исследование антиоксидантной активности объектов со сложной матрицей 91
5.1. Метод «введено-найдено» 91
5.2. Исследование антиоксидантной активности некоторых продуктов питания 92
5.2.1. Антиоксидантная активность соков фруктов и овощей 92
5.2.2. Исследование антиоксидантной активности чая 98
5.2.3. Антиоксидантная активность алкогольсодержащих напитков 100
5.3. Определение метрологических характеристик потенциометрического измерения антиоксидантной активности продуктов питания 104
Заключение 108
Выводы 110
Литература 112
- Взаимодействие низкомолекулярных фенольных антиоксидантов с активными формами кислорода
- Метод хемилюминесцентного определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), накапливающихся в мембранах липосом
- Исследование взаимодействия медиаторнои системы с водорастворимыми синтетическими антиоксидантами
- Хемилюминесцентные и потенциометрические исследования АОА лекарственных настоев и бальзамов
Введение к работе
Актуальность темы: Общее ухудшение экологической обстановки увеличило риск развития окислительного стресса у людей. Окислительный стресс сопровождается накоплением в организме человека свободных радикалов (СР), что приводит к усугублению заболеваний сердечно-сосудистой, нервной систем, легких, глаз, крови и ускоряет старение организма. Вещества, способные снижать уровень свободных радикалов в организме и защищать макромолекулы живой клетки, получили название антиоксидантов (АО). Актуальность перечисленных выше причин привела к росту потребности оценки содержания такого рода веществ в природных или созданных на их основе объектах (продуктах питания, биологически активных добавках, лекарственных препаратах), которые могут служить источниками АО.
Исследование антиоксидантов в таких объектах в настоящее время проводится в двух направлениях: определение состава веществ, способных выполнять функции антиоксидантов, и определение общих антиоксидантных свойств объектов. Группа веществ, предотвращающая образование сильных окислителей in vivo, довольно разнообразна. К ним относится SH-содержащая аминокислота цистеин, некоторые пептиды и белки (глютатион, альбумин), убихинон, аскорбиновая кислота, мочевая кислота, токоферолы, каротиноиды, флаваноиды и др. Определение состава антиоксидантов позволяет судить о возможной физиологической ценности продуктов, в которых они содержатся. Однако исследование композиции веществ требует применения тех или иных процедур разделения, которые могут быть проведены только в условиях хорошо оснащенной исследовательской лаборатории. Кроме того, информации о составе антиоксидантов, как правило, недостаточно, чтобы судить об антиоксидантных свойствах в целом, так как в этом случае не учитываются процессы взаимного восстановления антиоксидантов и влияние матрицы исследуемого объекта.
Оценить общую антиоксидантную активность (АОА) того или иного объекта можно с помощью интегральных методов. В основе методов оценки общей антиоксидантной активности, как правило, лежат реакции взаимодействия с долгоживущими свободными радикалами, которые служат прототипом свободных радикалов, образующихся в живой клетке. Обеспечивая получение информации об АОА того или иного образца, такие методы имеют ряд особенностей, которые ограничивают возможности их применения. А именно, анализ проходит в несколько стадий и занимает довольно продолжительное время, аналитический сигнал необходимо регистрировать с помощью дорогостоящего спектрофотометрического или флуорометрического оборудования, а также требуется использование дорогостоящих реактивов.
Взаимодействие антиоксидантов с СР и активными кислородными
соединениями (02'~, НО', Н202, О!, и др.) в водных средах сопровождается
передачей электрона и, следовательно, имеет электрохимическую природу. В
связи с этим представляется целесообразным изучать взаимодействие АО и
активных кислородных соединений с использованием электрохимических
методов. Электрохимические методы характеризуются высокой
чувствительностью, быстротой процедуры анализа, относительно невысокой
стоимостью необходимого оборудования и реактивов, а значит, и анализа в
целом. В этой ситуации наиболее доступным источником информации может
служить измерение электрохимических параметров системы
реагент/антиоксидант, например, окислительно-восстановительного
потенциала.
Целю работы являлись исследование взаимодействия медиаторной системы с АО и разработка нового потенциометрического метода с использованием медиаторной системы для определения антиоксидантной активности чистых химических веществ и оценки антиоксидантных свойств объектов со сложной матрицей: продуктов питания, БАД и экстрактов лекарственных растений. Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:
обосновать применение нового потенциометрического метода с использованием медиаторнои системы для определения антиоксидантной активности различных объектов: чистых химических веществ, продуктов питания и экстрактов лекарственных растений;
- сформулировать критерии выбора и подобрать медиаторную систему для
потенциометрического определения антиоксидантной активности;
исследовать реакции взаимодействия антиоксидантов с медиаторнои системой;
исследовать антиоксидантную активность индивидуальных веществ полифенольной природы (природных и синтетических) методом потенциометрии;
провести корреляционные исследования результатов определения антиоксидантных свойств различных объектов, полученных разными методами;
- исследовать антиоксидантную активность объектов со сложной переменной
матрицей: свежеприготовленных соков, соков и нектаров промышленного
производства, алкогольсодержащих напитков, чая, овощей, ягод, некоторых
фруктов, препаратов лекарственных растений;
определить основные метрологические характеристики
потенциометрического метода с применением медиаторнои системы для измерения антиоксидантной активности некоторых продуктов питания. Научная новизна. Предложен новый потенциометрический метод исследования антиоксидантной активности. Дано термодинамическое обоснование выбора медиаторнои системы для данного метода. Предложенным потенциометрическим методом изучена стехиометрия реакции некоторых полифенольных антиоксидантов растительного происхождения, аскорбиновой кислоты, ряда синтетических антиоксидантов с выбранной медиаторнои системой гексацианоферрат (ИЛИ) калия. Показано, что стехиометрические коэффициенты взаимодействия полифенольных антиоксидантов с K3[Fe(CN)6] соответствуют количеству ОН-групп при бензольном кольце, флавоновом ядре или ненасыщенном гетероцикле (аскорбиновая кислота). На примере
производных пирогаллола, пирокатехина и гидрохинона показано, что антиоксидантная активность этих соединений возрастает при введении в структуру молекулы карбонильной группы в соседнем с бензольным кольцом положении, а также при введение оксимной и тиосульфонатной групп. Снижение АОА наблюдается, когда метильная группа находится в соседнем положении с карбонильной и оксимной группами, а также когда один или два морфолинометильных остатка находятся в соседнем положении с бензольным кольцом. Можно полагать, что подобные явления окажутся достаточно общими.
Показана высокая степень корреляции результатов определения антиоксидантной активности и противорадикальной активности методами потенциометрии, фотохемилюминесценции, фотоколориметрии с использованием стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила и методом определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления в липосомах, а также антиоксидантной активности и содержания фенольных соединений в вине. Коэффициенты корреляции составляют 80 - 90%. Практическая значимость. Разработан способ интегральной оценки антиоксидантной активности ряда природных объектов со сложной матрицей с использованием метода потенциометрии.
Предложена экспрессная и простая в исполнении методика определения АОА чистых химических веществ, оценки АОА продуктов питания и лекарственных препаратов растительного происхождения. Установлены пределы определения АОА в водном растворе и мицеллярном растворе а-токоферол/вода.
Определена АОА ряда продуктов питания. Установлены количественные метрологические характеристики измерения АОА продуктов питания. Обсуждается возможность использования этого параметра как одного из показателей качества продуктов питания. На защиту выносятся:
Обоснование применения нового потенциометрического метода исследования АОА веществ с использованием медиаторной системы.
Результаты исследования взаимодействия природных и синтетических АО с медиаторной системой K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(CN)6].
Результаты корреляционных исследований антиоксидантных свойств предложенным методом и методами фотохемилюминесценции, фотоколориметрии с использованием стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила и методом определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липосом, а также корреляции АОА и общего содержания фенолов в вине.
Результаты исследования АОА объектов со сложной переменной матрицей: продуктов питания растительного происхождения, препаратов лекарственного сырья.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VI
Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с
международным участием «ЭМА-2004», г. Уфа, 2004; на научно-практическом
семинаре «Методы оценки антиоксидантной активности биологически
активных веществ лечебного и профилактического назначения», Институт
биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, г. Москва, 2004; на
Всероссийской научно-технической конференции-выставке
«Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации», г. Москва, 2004; на II Международной конференции «Современное приборное обеспечение и методы анализа почв, кормов, растений и сельскохозяйственного сырья», г. Москва, 2004; на Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005», г. Екатеринбург, 2005; на 8-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005», г. Пущино, 2005.
Взаимодействие низкомолекулярных фенольных антиоксидантов с активными формами кислорода
Несмотря на то, что в экспериментальных условиях мелатонин проявляет антиоксидантную активность в концентрациях, значительно превышающих его содержание в крови, в отличие от других антиоксидантов не выявлено условий, при которых бы он выступал как прооксидант [13].
Во всех водных и липидных фазах организма могут протекать радикальные окислительные процессы, в защите от которых важную роль играют и другие низкомолекулярные антиоксиданти - перехватчики органических радикалов. Подобными свойствами обладает широкий круг соединений: фенолы, полифенолы (токоферолы, эвгенол, пирокатехин, производные галловой кислоты), флавоноиды (рутин, кверцетин), серосодержащие соединения (цистеин, глютатион). Общепринятой номенклатуры антиоксидантов в настоящее время нет [14]. В зависимости от растворимости различают водорастворимые (витамин С, SH-содержащие соединения) и жирорастворимые (витамин Е, убихинон, стерины) биоантиокислители. В зависимости от природы функциональной групп АО можно подразделить на соединения тиольного и фенольного типа.
Существенную роль в антиоксидантной защите организма играют SH-содержащие аминокислоты, простые гидрофильные белки и пептиды - цистеин, метионин, альбумин, глютатион. Эти тиоловые соединения занимают важную позицию в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза в клетках и тканях. SH-соединениям принадлежит ведущая роль в защите клеток от ОН-радикала, который образуется в реакциях Фентона или под действием ионизирующего излучения:
Н20 hv Fe2+ НО +НО+Є". Экспериментально показано участие метиониновых и цистеиновых остатков сывороточного альбумина в этом процессе [15]. Тиоловые соединения подвергаются окислению в первую очередь, что предохраняет функциональные группы других макромолекул. По некоторым оценкам, на SH-содержащие белки приходится более 50% ингибирования синглетного кислорода в плазме крови, связывания НОСІ, процессов ПОЛ в сыворотке [16].
Эффективными перехватчиками радикалов являются фенольные антиоксиданти, к которым относятся соединения, имеющие в своей структуре ароматическое кольцо, связанное с одной или несколькими гидроксильными группами. Отдавая атом водорода от гидроксильной группы, они образуют довольно устойчивый фенокси-радикал (арокси-радикал для производных фенола):
Взаимодействие фенольных антиоксидантов с органическими радикалами приводит к образованию феноксильных радикалов, которые в дальнейшем, участвуя в реакциях диспропорционирования, образуют хинолидные перекиси:
В результате распада хинолидных перекисей возникают хинонные формы молекул, которые в условиях дефицита кислорода также могут взаимодействовать с радикалами [17]. В настоящее время в природных объектах найдено несколько тысяч фенольных соединений. К ним относятся большинство растительных и животных пигментов, аминокислоты триптофан и фенилаланин, витамины Е и К. Как правило, синтез ароматического кольца возможен только у высших растений и микроорганизмов, поэтому в растениях фенольные антиоксиданты являются обязательным компонентом и присутствуют в значительных количествах. В организмах животных преимущественно происходит преобразование ароматических соединений. В связи с этим многие из фенольных антиоксидантов входят в группу так называемых «пищевых антиоксидантов». Потребность организма в этих веществах удовлетворяется за счет поступления их с пищей.
Аскорбиновая кислота (витамин С) - у-лактон 2,3-дегидрогулоновой кислоты (рис. 6). В молекуле витамина С присутствуют две енольные группы, которые определяют его донорно-акцепторные свойства.
Известно, что источником аскорбиновой кислоты являются растения. В то же время, она обнаружена практически во всех тканях млекопитающих. Аскорбиновая кислота обладает широким спектром биологического действия. Как антиоксидант она вступает во взаимодействие со многими свободными радикалами: гипохлоритом, синглетным кислородом, супероксидным анион-радикалом, гидроксильным и перекисными радикалами.
Флавоноиды - это разнообразная группа полифенольных соединений, главной особенностью которых является флавоновое ядро. В зависимости от структуры ядра выделают флавонолы, флавоны, флаваноны, катехины, антоцианидины, изофлавоны, дигидрофлавонолы, халконы (рис. 5). В каждую из этих групп входят соединения, содержащие разное число ОН-групп. Флавоноиды широко представлены в овощах, фруктах, цветах, семенах растений, орехах, коре деревьев. Они являются важной составной частью рациона питания животных и человека. Из растений было выделено и охарактеризовано более 4000 флавоноидов.
Метод хемилюминесцентного определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), накапливающихся в мембранах липосом
Источником большинства антиоксидантов для человека служат продукты питания и биодобавки. Разнообразие состава и механизмов действия антиоксидантов при разных путях протекания свободнорадикальных процессов делает особенно привлекательным поиск достоверных способов суммарного определения антиоксидантной активности как интегрального параметра, отражающего общее содержание функциональных групп, способных тормозить или устранять свободнорадикальное окисление биологических макромолекул.
Большинство существующих на настоящий момент методов определения антиоксидантной активности основано на принципах конкурентного анализа. В этом случае антиоксиданты исследуемого образца препятствуют образованию индикаторного вещества (чаще всего - долгоживущего свободного радикала) и подавляют в той или иной степени развитие сигналообразующей реакции. Круг способов регистрации сигналообразующей реакции зависит от природы индикаторного соединения и включает спектрофотометрические, флюорометрические методики, регистрацию электрохимических сигналов, измерение электронного парамагнитного резонанса и некоторые другие.
Спектрофотометрические и хемилюминесцентные методы - наиболее широко используемая группа методов, применяемых для исследования общей антиоксидантной активности. В настоящее время существует несколько довольно часто используемых методик определения АОС, основанных на регистрации оптических сигналов.
В основу метода определения эквивалентов Тролокса (Trolox equivalent antioxidant capacity assay (ТЕAC)) положено взаимодействие антиоксидантов с долгоживущим радикалом 2,2-азинобис(3-этилбензотиазолина-6-сульфоната) (АБТС) и, как следствие, ингибирование абсорбции при длине волны 600 нм. Радикалы АБТС получают в результате двухступенчатого процесса: взаимодействия 2,2-азинобис(3-этилбензотиазолина-6-сульфоната) с феррилмиоглобином, который в свою очередь образуется в результате взаимодействия метмиоглобина с Н2О2:
При добавлении образца, содержащего антиоксиданты, происходит уменьшение оптической плотности раствора. В качестве стандарта здесь применяют Тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси кислоту) - водорастворимый аналог а-токоферола [31]. Один из немногих, этот метод обеспечен набором реактивов промышленного производства и часто применяется в качестве метода сравнения [32]. Существенным недостатком метода является опосредованное двумя реакциями получение радикала. Это удлиняет время проведения анализа и может увеличить разброс данных, несмотря на то, что при этом используется специальные наборы стандартных реактивов промышленного изготовления.
Железовосстанавливающая/антиоксидантная способность (Ferric reducing/antioxidant power (FRAP)). Метод основан на взаимодействии антиоксидантов с Ре+3-трипиридилтриазином и восстановлении его до Ре+2-трипиридилтриазина, который, имеет интенсивную синюю окраску. Ре+2-трипиридилтриазин определяют по полосе поглощения при 593 нм. Количество антиоксидантов пропорционально количеству образовавшегося окрашенного вещества [33]. К сожалению, этим методом невозможно определение некоторых антиоксидантов, например, глутатиона.
Запатентован метод оценки антиоксидантних свойств с использованием батокупроина, который избирательно образует комплекс с ионом одновалентной меди. При добавлении солей Си2+ к растворам чистых веществ или образцам биологических и небиологических жидкостей происходит восстановление Си до Си . В присутствии батокупроина образуется устойчивый комплекс Си (І)-батокупроин, который можно определить спектрофотометрически по специфичной полосе поглощения при 480 нм [34]. Количество антиоксидантов выражают в мольных долях стандартного вещества, например, мочевой кислоты или а-токоферола.
Определение способности абсорбировать кислородные радикалы (Oxygen radical absorbance capacity assay (ORAQ). В этом методе в качестве окисляемого флюоресцирующего субстрата используют фикоэритрин или флюоресцин. Источником пероксильных радикалов служит реакция температурной декомпозиции 2,2 -диазобис(2-амидинопропана) дигидрохлорида (АБАП). Для образования гидроксильных радикалов - реакция ионов Си с Н2О2. Антиоксидантную способность рассчитывают следующим образом: вычисляют разность площадей под графиками временной развертки флюоресценции, полученной с добавлением образцов антиоксидантов, и бланковой пробы без АО. Такой способ оценки АОС позволяет учитывать как степень ингибирования, так и время, необходимое для нейтрализации радикала [35].
Для оценки антиоксидантной способности плазмы крови предложен метод с использованием флюоресцирующих продуктов аутоокисления гомованилиновой кислоты (ГВК) [36]. Этот метод основан на подавлении антиоксидантами плазмы крови флюоресценции димеров гомованилиновой кислоты, образующихся в результате ее аутоокисления. Аутоокисление ГВК в щелочных условиях (рН 9,0) приводит к образованию флюоресцирующих продуктов с полосой испускания при 450 нм. Добавление растворов веществ с известными антиоксидантными свойствами или аликвот сыворотки крови приводило к снижению интенсивности флюоресценции и увеличению времени задержки развития сигнала. Количественно эффективность антиоксидантов оценивали по длительности времени задержки флюоресценции и по соотношению скоростей реакций Ro/Ra, где Ro - скорость развития флюоресценции без добавления содержащих антиоксиданты образцов, a Ra - скорость развития флюоресценции после добавления содержащих антиоксиданты образцов.
Исследование взаимодействия медиаторнои системы с водорастворимыми синтетическими антиоксидантами
Zhang с соавторами применили спектроскопию в ближней инфракрасной области (Х=\ 000-2500 нм) для определения общей антиоксидантной способности зеленого чая [59]. Были исследованы 123 объекта, причем свежие листья чая использовались для получения спектров без предварительной обработки. Параллельно определяли АОА водных экстрактов листьев чая методом ТЕАС. Авторами была предпринята попытка обосновать использование спектроскопических исследований цельных частей растений для определения их антиоксидантных свойств, опираясь на статистическую обработку большого массива данных ИК-спектроскопии и ТЕАС.
Предложен ряд методик визуального определения антиоксидантной способности. Например, французский исследователь J. Morelle предлагает оценивать АОС веществ и растительных образцов в антирадикальных единицах. Одна антирадикальная единица соответствует обесцвечиванию 1 мг 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) [60].
Porter W.L. и Kramer R.E. предложили метод, сочетающий предварительное хроматографическое разделение смеси органических соединений на пластинке, покрытой тонким слоем полиамида, с последующей обработкой линолевой кислотой [61]. Далее обработанную пластинку нагревали до 65С в течение 8 часов. Свободные амино-группы вступали в реакцию с линолевой кислотой. Участки полиамидного слоя, покрытые антиоксидантами, имели окраску от кремового до желтого цвета. Данным методом исследовали препарат галловой кислоты и экстракты пряностей (гвоздики).
Группой американских исследователей предложен метод обнаружения антиоксидантов, основанный на экстракции веществ полярным, неполярным и полуполярным экстрагентом, последующим хроматографированием этих трех фракций и проявлением хроматограмм раствором, содержащим свободный радикал [62]. Используя процедуру последовательного экстрагирования, были проанализированы два поливитаминных препарата. Измельченные поливитамины были обработаны смесью метанола и гексана 1:1. Далее гексановая (неполярная) и метанольная (полярная) фракции были разделены. Неполярную фракцию после предварительного концентрирования растворяли в комбинированном растворителе, состоящем из гексана и этилацетата в соотношении 3:1. Полярную фракцию получали после центрифугирования метанольной суспензии. Супернатант концентрировали и перерастворяли в метаноле. Полуполярную фракцию извлекали из осадка смесью метанола, ацетонитрила и этилацетата (35:30:35), концентрировали и перерастворяли в смеси метанол/этилацетат (1:1). Полученные фракции наносили на хроматографические пластинки и проводили процедуру хроматографии в следующих смесях: для неполярной фракции - гексан/этилацетат (3:1); для полярной фракции - вода/этанол 96%/гидроксид аммония 25% (10:78:12); для полуполярной фракции - ацетонитри л/метано л/вода (35:30:35). Хроматограммы проявляли 20-2000 мМ раствором ДФПГ в метаноле. Участки, содержавшие антоксиданты, имели вид желтых пятен на общем светло-фиолетовом поле. Авторы предлагают экстраполировать предложенную ими процедуру на другие объекты: растения, бактерии, грибы, ткани и биологические жидкости животного происхождения.
Таким образом, к настоящему моменту существует довольно широкий круг методов и методик определения антиоксидантной активности. Большинство методов определения общей АОА основано на «гашении» сигналообразующей реакции за счет взаимодействия АО с индикаторным веществом (ТЕАС, FRAP, катодная вольтамперометрия, определение радикалов а-токоферола и др.). В некоторых случаях используется еще более длинная схема анализа, когда антиоксиданты взаимодействуют с полученными in situ АКС, уменьшая их количество и, как следствие, снижая флюоресценцию (ORAC, TRAP и др.). Такой многоступенчатый анализ требует, как правило, значительных затрат времени. Кроме того, для получения АКС часто применяют ферментативные реакции или долгоживущие радикалы, что значительно повышает стоимость анализа. Прямые методы определения АОС, такие как ЦВА или экспрессные визуальные методики обеспечивают только качественную оценку антиоксидантной активности. Высокий предел обнаружения (10"7 М) дает метод прямой регистрации спектров ЭПР. Однако очень малое время жизни радикалов и множество последовательно и параллельно протекающих с их участием реакций не позволяют проследить эффективность действия тех или иных АО. Кроме того, несмотря на многообразие существующих методов определения АОА, по-прежнему актуальной остается задача разработки экспрессного и недорогого метода количественного исследования антиоксидантной активности.
Итак, до сих пор не существует метода, который дал бы полную информацию о состоянии и взаимодействиях сложных систем, в которых возникают и вступают в реакции антиоксиданты. Нет также единого термина, который бы определял антиоксидантные свойства соединения или комплекса соединений. Предлагают различать «антиоксидантную емкость», «антиоксидантную активность», понимая под первым «количество молей ловушек радикалов в исследуемом образце» [38]. Под «антиоксидантной активностью» понимают константу скорости действия антиоксиданта против свободных радикалов. Используют также термины «антиоксидантной силы», «антиоксидантной способности» [33]. Таким образом, наблюдается смешение термодинамических и кинетических понятий. В общем случае термин «активность» используют как термодинамический, и его не следует применять как кинетический. По-видимому, надо согласиться с Prior and Cao [35] в том, что все существующие методы определения АО страдают теми или иными недостатками. Итак, если учесть, что доноры электронов являются основными веществами, улавливающими радикалы, вызывающими обрыв цепи радикальных реакций, разрушающими или инактивирующими сильные окислители, следует принять, что расходование правильно подобранного оксиданта в химической реакции окисления - восстановления дает информацию о концентрации (активности) «антиоксиданта».
Хемилюминесцентные и потенциометрические исследования АОА лекарственных настоев и бальзамов
Термодинамическая возможность протекания реакций между антиоксидантами (донорами электронов) и АФК и радикалами (акцепторами электронов) определяется соотношением окислительно-восстановительных потенциалов соответствующих систем, а их скорость - кинетикой взаимодействия компонентов. Таким образом, для определения концентрации АО должны быть подобраны реагенты, химическая реакция которых с определяемым веществом термодинамически возможна и протекает с достаточной скоростью. В таблице 5 приведены потенциалы основных реакций, в которых участвуют кислородные радикалы [74].
Окислительно-восстановительные потенциалы антиоксидантов (В,АОох/АО) лежат в более отрицательной области. Например, потенциал аскорбиновой кислоты относительно Н.В.Э. составляет +0,08 В [75].
Поскольку взаимодействие АО и АФК имеет электрохимическую природу, то применение электрохимических методов для определения АОА целесообразно. В этом случае достаточно информативным является метод окислительно-восстановительной потенциометрии. Однако использование потенциометрии предполагает наличие обратимой электродной реакции, которая обеспечивала бы установление равновесного потенциала. Как показали результаты исследования электрохимических процессов окисления-восстановления антиоксидантов методом циклической вольтамперометрии, окисление этих веществ по большей части необратимо. Для корректной оценки окислительно-восстановительного состояния системы необходимо использование обратимой медиаторной пары. В качестве реагента-оксиданта, применяемого для определения АОА может быть использована медиаторная система, окислительно-восстановительный потенциал которой удовлетворяет условию: где Е./л - окислительно-восстановительный потенциал пары окисленное/ восстановленное АКС; E0x/Kcd - окислительно-восстановительный потенциал медиаторной системы; мох/jo " окислительно-восстановительный потенциал пары окисленный/ восстановленный антиоксидант. Кроме того, медиаторная система должна удовлетворять ряду условий: ? обладать электрохимической обратимостью; ? потенциал системы должен быть устойчив; ? изменение потенциала медиаторной системы должно подчиняться уравнению Нернста; химическая реакция реагента с основными антиоксидантами должна происходить с достаточно большой скоростью. Как показали результаты предварительных исследований, система K3[Fe(CN6)]/K4[Fe(CN6)], стандартный потенциал которой относительно Н.В.Э. составляет 0,36 В, более всего отвечает этим требованиям. Для определения антиоксидантной активности потенциометрическим методом использовали химическое взаимодействие антиоксидантов с Fe(III) согласно уравнению реакции В результате химического взаимодействия AOre(j и Fe(III) окислительно восстановительный потенциал изменялся. Таким образом, в основе определения антиоксидантной активности предлагаемым потенциометрическим методом лежит химическое взаимодействие антиоксидантов с Fe(III), которое приводит к изменению соотношения Fe(III)/ Fe(II) и, следовательно, изменению окислительно-восстановительного потенциала медиаторной системы. Потенциал системы до введения в раствор образца, содержащего антиоксиданты, согласно уравнению Нернста можно записать следующим образом: После введения в раствор образца, содержащего антиоксиданты, потенциал системы изменяется согласно уравнению: На основании уравнений (2) и (3) активность (концентрацию) антиоксидантов в растворе рассчитывали в соответствии с выражением: где Е, Ei - потенциалы, устанавливающиеся в системе до и после введения анализируемого источника антиоксиданта, В; Е0 - стандартный потенциал медиаторной системы, В; С0х - концентрация окисленной формы медиатора, моль экв./дм3; Cred - концентрация восстановленной формы медиатора, моль экв./дм3; X - эквивалентная концентрация антиоксиданта, вступившего в реакцию с Fe (III), моль экв./дм ; Принимая во внимание, что в процессе анализа практически не изменяется ионная сила раствора и источником информации является изменение потенциала, а не его абсолютная величина, достаточно корректно не делать разницы между активностью и концентрацией. Далее именно эта величина используется для характеристики антиоксидантной активности. Одним из условий работы медиаторнои системы является наличие в растворе одновременно компонентов медиаторнои системы, содержащих железо как в степени окисления (III), так и в степени окисления (II). Взаимодействие антиоксидантов происходит с Fe(III), следовательно, целесообразно создавать избыток Fe(III). Соотношение Fe(III)/Fe(II) в электрохимической ячейке для исследования АОА объектов растительного происхождения было выбрано 100/1, чтобы обеспечить определение более широкого диапазона концентраций АО в исследуемом материале без дополнительного разведения. Поскольку концентрации измеряемых АО и окисленной формы медиаторнои системы должны быть соизмеримы, концентрация K3[Fe(CN)6] была выбрана 0,01 М. Концентрация исходного раствора K4[Fe(CN)6] была выбрана 0,0001 М. При более низкие концентрациях водных растворов это соединение достаточно быстро окисляется, что препятствует поддержанию стабильного потенциала медиаторнои системы. Таким образом, оптимальная конечная концентрация компонентов медиаторнои системы в электрохимической ячейке составила 0,01 М K3[Fe(CN)6]/0,0001 М K4[Fe(CN)6], что позволило определять АОА продуктов питания и БАД без дополнительного разведения.
![Синтез, свойства и исследование антиокислительной активности галогенидов S-[ -(4-гидроксиарил)алкил]изотиурония](/i/i/4276/436731.png "Синтез, свойства и исследование антиокислительной активности галогенидов S-[ -(4-гидроксиарил)алкил]изотиурония Кандалинцева Наталья Валерьевна")
