Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 14
1.1. Активные формы кислорода и их двойственная роль в организме 14
1.2. Антиоксидантная защита организма 18
1.3. Роль окислительного стресса в патогенезе различных заболеваний 23
1.3.1. Болезни системы кровообращения и сахарный диабет 23
1.3.2. Нарушения репродуктивной функции мужчин 25
1.3.3. Нарушения репродуктивной функции женщин 28
1.4. Мониторинг оксидант/антиоксидантного состояния (окислительного стресса) организма 30
1.4.1. Определение радикальной активности 31
1.4.2. Определение продуктов перекисного окисления макромолекул 33
1.4.3. Оценка антиоксидантной активности 35
1.4.3.1. Методы определения антиоксидантной активности ферментов 36
1.4.3.2. Методы определения суммарной активности неферментативных антиоксидантов 39
1.5. Постановка задачи 48
Глава 2. Экспериментальная часть 49
2.1. Аппаратура 49
2.2. Реактивы 50
2.3. Объекты исследования 51
2.4. Методы исследования 53
2.4.1. Потенциометрический метод определения антиоксидантной активности с использованием медиаторной системы 53
2.4.2. Спектрофотометрический метод определения антиоксидантной активности TAS Randox 55
2.4.3. Гемиглобинцианидный метод определения содержания гемоглобина 2.4.4. Метод определения гематокрита 57
2.4.5, Спермиологический анализ 57
Глава 3. Исследование взаимодействия медиаторной системы с цельной кровью и ее фракциями, семенной и фолликулярной жидкостями и разработка алгоритмов определения АОА этих жидкостей потенциометрическим методом с медиаторной системой 58
3.1. Выбор сенсора 58
3.2. Исследование и анализ крови и ее фракций 60
3.2.1. Исследование растворов индивидуальных антиоксидантов и раствора, моделирующего состав плазмы крови 60
3.2.2. Выбор состава медиаторной системы и условий разбавления пробы 62
3.2.3. Исследование влияния способа подготовки крови и ее фракций на результаты анализа 66
3.2.4. Выделение клеточной составляющей антиоксидантной активности крови и эритроцитарной массы 69
3.3. Исследование и анализ семенной и фолликулярной жидкостей 72
3.3.1. Выбор состава медиаторной системы и условий разбавления пробы72
3.3.2. Выбор фракции и способа подготовки семенной жидкости к анализу 74
3.3.3. Выбор способа подготовки фолликулярной жидкости к анализу 75
3.3.4. Корреляция результатов определения АОА фолликулярной жидкости и сыворотки крови 76
Глава 4. Исследование взаимодействия медиаторной системы с пероксидными радикалами и разработка потенциометрического метода определения антиоксидантной активности с использованием радикального инициатора 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорида (ААРН) 79
4.1. Исследование реакции взаимодействия пероксидных радикалов с восстановленным компонентом медиаторной системы 79
4.2. Разработка метода исследования кинетики генерирования пероксидных радикалов, определение скорости и константы генерирования 83
4.3. Разработка потенциометрического метода определения антиоксидантной активности с использованием реакции генерирования радикалов инициатором ААРН 88
4.4. Определение АОА растворов индивидуальных антиоксидантов потенциометрическим методом с использованием взаимодействия с пероксидными радикалами, генерируемыми ААРН 90
Глава 5. Сравнительные исследования антиоксидантных свойств биологических жидкостей методами, включающим стадию генерирования свободных радикалов и не включающим указанную реакцию. Обоснование использования последнего метода в анализе 94
5.1. Сравнительные определения АОА плазмы крови спектрофотометрическим методом TAS Randox и потенциометрическим методом с медиаторной системой 94
5.2. Определение TRA образцов эритроцитарной массы потенциометрическим методом с медиаторной системой с использованием взаимодействия с радикалами ААРН и без использования радикальных взаимодействий 99
Глава 6. Потенциометрический метод определения антиоксидантной активности в клинических исследованиях 103
6.1. Исследование АОА плазмы крови пациентов с болезнями системы кровообращения и сахарным диабетом II типа 103
6.2. Исследование АОА семенной жидкости при различных видах патологии репродуктивной функции, установление диагностических критериев 109
Выводы 121
Литература 123
- Антиоксидантная защита организма
- Потенциометрический метод определения антиоксидантной активности с использованием медиаторной системы
- Выбор состава медиаторной системы и условий разбавления пробы
- Выбор способа подготовки фолликулярной жидкости к анализу
Введение к работе
Актуальность темы. Активные формы кислорода (АФК) играют двойственную биологическую роль в организме человека. АФК являются необходимым элементом фагоцитоза, при котором происходит разрушение поврежденных, старых, иммунологически несовместимых или злокачественных клеток и клеток, пораженных вирусами. Кроме того, благодаря высокой химической активности АФК выполняют функцию сигнальных внутриклеточных трансдьюсеров и межклеточных медиаторов. Однако, при воздействии ряда неблагоприятных факторов, наблюдается избыточное образование АФК. Его патологические последствия проявляются при чрезмерном накоплении АФК и продуктов окисления биомолекул – состоянии, называемом окислительным стрессом. Факторы, вызывающие окислительный стресс, различны, но все они приводят к окислительной модификации макромолекул, т.е. повреждению ДНК, белков, липидов и т.д.
В здоровом организме сохраняется равновесие в системе оксиданты-антиоксиданты. Поддержание окислительно-восстановительных реакций на стационарном уровне обеспечивается действием согласованной антиоксидантной системы. Для коррекции состояния антиоксидантной системы необходима информация о наличии и интенсивности окислительного стресса, что может быть сделано путем оценки антиоксидантной активности (АОА) различных биологических сред.
Существует ряд методов оценки состояния антиоксидантной системы. Основными из них являются: определение радикальной активности, продуктов перекисного окисления макромолекул, индивидуальных антиоксидантов (АО) (ферментативных и неферментативных) и оценка интегральной антиоксидантной активности. Сложность методик и аппаратуры, возможность использования только для анализа неокрашенных жидкостей, отсутствие единого терминологического подхода, неоднозначность данных препятствуют их применению в медицинской экспресс-диагностике.
Наиболее доступными и экспрессными методами оценки АОА являются электрохимические методы. Кроме преимуществ, связанных с доступностью, низкой стоимостью аппаратуры и реактивов, они позволяют напрямую оценить электронно-донорно-акцепторные свойства исследуемой системы, т.е. свойства определяющие, антиоксидант/оксидантный баланс организма.
В представленной работе в качестве метода исследования антиоксидантной активности биологических объектов используется потенциометрический метод. Его использование позволяет существенно упростить и ускорить процесс получения информации об АОА в медицинской практике.
Цель работы: Развитие потенциометрического метода определения антиоксидантной активности и разработка новых алгоритмов определения АОА биологических объектов с использованием медиаторной системы и потенциометрической детекции.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Исследовать взаимодействие медиаторной системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] с отдельными антиоксидантами и биологическими объектами, разработать алгоритмы определения антиоксидантной активности крови и ее фракций, семенной и фолликулярной жидкостей.
2. Исследовать реакции взаимодействия радикального инициатора ААРН с медиаторной системой, оценить возможность использования потенциометрического метода для оценки скорости и константы генерирования пероксидных радикалов.
3. Разработать новый потенциометрический метод определения антиоксидантной активности с использованием реакции радикальной инициации и потенциометрической детекции.
4. Провести корреляционные исследования результатов определения антиоксидантной активности плазмы крови потенциометрическим методом и спектрофотометрическим методом TAS Randox.
5. Провести корреляционные исследования результатов определения антиоксидантной активности индивидуальных антиоксидантов и образцов эритроцитарной массы, полученных потенциометрическим методом с использованием радикальных взаимодействий и без использования радикального инициатора.
6. Провести клинические исследования АОА плазмы крови и семенной жидкости, выявить взаимосвязи величины АОА с наличием патологических состояний организма.
Научная новизна. Впервые показана возможность исследования радикальных реакций потенциометрическим методом с использованием медиаторной системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]. Разработан новый потенциометрический метод исследования антиоксидантной активности с использованием радикального инициатора 2,2'-азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорида (AAPH). Разработанным методом исследованы растворы индивидуальных антиоксидантов и эритроцитарной массы. Показана высокая степень корреляции результатов определения антиоксидантной активности потенциометрическим методом с реакцией радикальной инициации и без ее использования.
Разработаны новые алгоритмы анализа антиоксидантной активности крови и ее фракций, семенной и фолликулярной жидкостей. Получены новые знания в области исследования антиоксидантной активности биологических жидкостей. Проведены корреляционные исследования плазмы крови независимым спектрофотометрическим методом TAS Randox. Выявлены корреляционные зависимости между антиоксидантной активностью фолликулярной жидкости и сыворотки крови. Выделен вклад гемоглобина и клеточной составляющей антиоксидантной активности в суммарную восстановительную способность крови и эритроцитарной массы.
Предложенный метод использован в клинических исследованиях плазмы крови и семенной жидкости. Выявлена корреляционная зависимость АОА плазмы крови пациентов с болезнями системы кровообращения и сахарным диабетом II типа. Установлены различия в величине АОА семенной жидкости при различных видах патологии репродуктивной функции.
Практическая значимость. Разработаны алгоритмы определения антиоксидантной активности биологических жидкостей. Предложена экспрессная и простая методика определения АОА крови и ее фракций, семенной и фолликулярной жидкостей. Методика определения антиоксидантной активности цельной крови, эритроцитарной массы, плазмы, сыворотки аттестована в ФГУП УНИИМ.
С использованием потенциометрического метода с медиаторной системой определены скорость генерирования пероксидных радикалов, константа генерирования.
Метод использован в клинических исследованиях. Высокая степень корреляции результатов антиоксидантной активности с наличием патологического состояния позволяет использовать данный параметр в медицинской практике.
Доступность и простота приборного оформления позволяет использовать потенциометрический метод для масштабных медицинских исследований.
На защиту выносятся:
1. Результаты исследования взаимодействия медиаторной системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] с индивидуальными антиоксидантами, цельной кровью и ее фракциями, семенной и фолликулярной жидкостями и алгоритмы определения АОА этих жидкостей потенциометрическим методом с медиаторной системой
2. Методики определения антиоксидантной активности крови и ее фракций, семенной и фолликулярной жидкостей.
3. Новый потенциометрический метод с медиаторной системой для исследования радикальных реакций
4. Новый метод потенциометрической оценки антиоксидантной активности с использованием взаимодействия пероксидных радикалов с исследуемым объектом
5. Результаты корреляционных исследований плазмы крови предложенным и спектрофотометрическим методом TAS Randox
6. Результаты корреляционных исследований индивидуальных антиоксидантов и образцов эритроцитарной массы потенциометрическим методом с использованием радикальных реакций и без ее использования
7. Результаты исследования антиоксидантной активности плазмы крови пациентов с болезнями системы кровообращения и сахарным диабетом II типа
8. Результаты исследования антиоксидантной активности семенной жидкости при различных видах патологии репродуктивной функции.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), Международном семинаре «Загрязнение ртутью окружающей среды: эмиссия в атмосферу, восстановление территорий, влияние на здоровье» (Астана, 2007), Научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, 2007), 11-й Международной семинар-ярмарке «Российские технологии для индустрии» «Нанотехнологии в электронике, энергетике, экологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2007), 3rd International Symposium on Recent advances in food analysis (Prague, Czech Republic, 2007), VII Всероссийской конференции по электрохимическим метода анализа с международным участием (Уфа-Абзаково, 2008), ISTC Science Workshop at the International Conference on Contamination Soil (Center-Fiera Milano, Italy, 2008), 12th International Conference on Electroanalysis (Prague, Czech Republic, 2008), Международном конгрессе "Репродуктивное здоровье населения Урала и Сибири" (Екатеринбург, 2008), II Международном форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2008), Всероссийской конференции молодых ученых и III школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2008), Ninth workshop on (Bio)sensors and bioanalytical microtechniques in environmental and clinical analysis (Montreal, Canada, 2009), XV Symposium «Euroanalysis 2009» (Innsbruck, Austria, 2009), III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России-2009» (Туапсе, 2009), Съезд аналитиков России (Москва (пансионат «Клязьма»), 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 1 статья в издании, рекомендованном ВАК, 1 глава в книге и тезисы 18 докладов.
Диссертация выполнена при поддержке гранта Российского Фонда Фундаментальных Исследований № 07-03-96071-р_урал_а «Исследование антиоксидантной активности биологических объектов, природных и вновь синтезированных соединений с использованием потенциометрического метода анализа» (2007-2009 гг.).
Автор выражает благодарность доценту Уральского федерального университета им. первого Президента Б.Н. Ельцина, к.х.н. А.В. Ивановой за обсуждение результатов; к.х.н. Л.В. Алешиной за помощь в экспериментальной работе; профессору Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, д.х.н. О.Т. Касаикиной за ценные советы и полезные обсуждения; директору ЗАО «Центр семейной медицины», к.м.н. И.Г. Портнову и руководителю лаборатории клинической эмбриологии, врачу-эмбриологу, к.м.н. С.Л. Балезину, а также к.м.н. Я.Е. Казакову за предоставленные образцы биологических объектов и данные о клиническом заключении.
Личный вклад автора состоял в постановке и решении основных задач, проведении экспериментальных исследований в области потенциометрического определения антиоксидантной активности биологических жидкостей, интерпретации и анализе полученных результатов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, обсуждения результатов, выводов, списка литературы из 121 наименования и приложений. Содержит 151 страницы, 30 таблиц, 26 рисунков, 2 приложения.
Антиоксидантная защита организма
В здоровом организме сохраняется равновесие в системе оксиданты-антиоксиданты. Нарушение этого баланса в пользу оксидантов приводит к развитию окислительного стресса. Поддержание окислительно-восстановительных реакций на стационарном уровне обеспечивается действием согласованной антиоксидантной системы [7]. Антиоксиданты - это вещества различной химической природы, способные тормозить или устранять свободно-радикальное окисление органических соединений различными АФК [8]. Защита организма от АФК представляет собой многоуровневую систему, включающую ферменты с оксидо-редуктазной активностью, неферментативные белки, полипептиды, водо- и жирорастворимые витамины, тиолсодержащие аминокислоты, флавоноиды, каротиноиды и т.д. [1,3,8]. Ферментативные антиоксиданты характеризуются высокой специфичностью действия, направленной против определенных форм АФК, а также специфичностью клеточной локализации. Уровень внутриклеточных ферментативных антиоксидантов находится под генетическим контролем [1]. Супероксиддисмутаза (СОД) — один из важнейших ферментов антиоксидантной защиты организма. Она перехватывает супероксид анион, катализируя его превращение в относительно менее активный пероксид водорода и молекулярный кислород. Реакция протекает следующим образом [3]: где М - ион металла переходной группы (Си (n=l); Mn (n=2); Fe (п=2)) [9].
Каталаза (Кат) — гемосодержащий фермент из группы гидропероксидаз, катализирующий окислительно-восстановительную реакцию разложения пероксида водорода [1,10]: Кат-Fe + Н202 = (окисленная каталаза) (окисленная каталаза) + 2Н202 = Кат-Fe + 2Н20 + 02 Каталаза препятствует накоплению Н202 благодаря весьма значительному снижению энергии активации разложения Н202 [3,4]. Каталаза длительно сохраняет высокую активность в клеточных структурах, но плохо проникает внутрь клетки из-за большой молекулярной массы, а во внеклеточных жидкостях быстро теряет свою активность. Вместе с СОД эффективнее защищает клетки, чем ферменты по отдельности [1]. Глутатионпероксидаза (ГПО) катализирует реакцию восстановления гидропероксидов свободных жирных кислот, фосфолипидов, этерифицированных жирных кислот с помощью глутатиона. Сродство к Н202 глутатионпероксидазы выше, чем каталазы, поэтому она более эффективно работает при низких концентрациях субстрата, в случае высоких концентраций Н202 ключевая роль принадлежит каталазе [3,5]. Глутатионредуктаза (ГР) - фермент, восстанавливающий дисульфидную связь окисленного глутатиона GSSG до его сульфгидрильной формы GSH [11]. Ферментативные антиоксиданты являются, в основном, средствами внутриклеточной защиты. Вместе с тем, во всех водных и липидных фазах организма также могут протекать радикальные окислительные процессы, в защите от которых важную роль играют антиоксиданты, которые при взаимодействии с радикалами образуют малоактивные продукты, так называемые "перехватчики свободных радикалов". Среди гидрофобных антиоксидантов можно выделить следующие [3, 7, а-Токоферол (витамин Е) - жирорастворимый витамин, являющийся одним из важнейших антиоксидантов. Он эффективно ингибирует супероксидный анион-радикал, синглетный кислород, гидроксильный и пероксильные радикалы. Наряду с токоферолами в качестве перехватчика свободных радикалов способны выступать и каротиноиды - жирорастворимые пигменты.
Среди каротиноидов особо выделяют Р-каротин, лютеин. Соединения этой группы, также как и ретиноиды (витамины группы А), способны нейтрализовывать гидроксильные радикалы, супероксид-анион и гидроперекиси липидов. Убихинон (коэнзим О) обладает антиоксидантной активностью, образуя окислительно-восстановительную систему убихинол - убихинон. Его важнейшая биологическая роль определяется участием в митохондриальной цепи электронного транспорта в качестве кофермента. Основная часть внутриклеточного убихинона сконцентрирована в митохондриях [12]. Не следует полагать, что низкомолекулярные антиоксиданты действуют лишь во внеклеточной среде, их антиокислительные функции проявляются также на клеточном уровне. Среди низкомолекулярных АО большое внимание уделяется мочевой кислоте (МК), которая относится к числу наиболее эффективных водорастворимых антиоксидантов. Антиоксидантное действие МК многообразно: она является хелатором ионов железа и меди, инициирующих свободнорадикальные процессы; взаимодействует с супероксидным радикалом (Ог -), гидроксильным радикалом (ОН ) и пероксинитритом (ONOO-); усиливает антиоксидантные эффекты а-токоферола и аскорбиновой кислоты и т. д. Одним из важнейших антиоксидантов биологических сред является аскорбиновая кислота (витамин С). Она используется организмом для биохимических окислительно-восстановительных процессов, вступает во взаимодействие с супероксид-анионом, синглетным кислородом, гидроксильными и перекисными радикалами, а также гипохлоритом. Восстановительные свойства аскорбиновой кислоты могут использоваться не только для ликвидации оксидантов, но и для регенерации токоферола и глутатиона [3]. Глутатион - выполняет функцию донора водорода и кофактора ряда антиоксидантных ферментных систем.
aГлутатион играет одну из ключевых ролей в защите клеток и внутриклеточной среды [3, 13]. Снижение внутриклеточного содержания восстановленного глутатиона существенно снижает устойчивость клеток и организма к лучевому поражению или интоксикации. Достаточно известным антиоксидантом биологических сред является билирубин - один из желчных пигментов, содержащихся в сыворотке крови. Он предотвращает перекисное окисление липидов [4]. В последние годы привлек внимание эпифизарный гормон мелатонин [14] как потенциальный эндогенный низкомолекулярный антиоксидант. Он оказался эффективным в процессах детоксикации различных АФК, включая синглетный кислород, пероксинитрит, оксид азота и т.д. Он обладает способностью нейтрализовывать радикалы, а также активизировать глутатионпероксидазу. Роль антиоксидантов выполняют и некоторые аминокислоты, особое внимание уделяется цистеину. Цистеин и метионин — аминокислоты, входящие в состав белков [4,7], проявляют достаточно сильные антиоксидантные свойства. Цистеин является предшественником глутатиона. Антиоксидантными свойствами обладает также пептид карнозин, локализованный в цитоплазме, способный нейтрализовать любые формы АФК: свободные радикалы кислорода (супероксидный анион, гидроксидный радикал), нерадикальные АФК (пероксид водорода, гипохлориты) и продукты перекисного окисления липидов [3]. Помимо низкомолекулярных существуют белоксодержащие антиоксиданты, являющиеся важнейшей составной частью внеклеточной среды [8]. В качестве белков-антиоксидантов могут выступать как альбумин, так и белки «острой фазы», такие как церулоплазмин, трансферрин, ферритин, лактоферрин, концентрация которых при острых или хронических воспалениях возрастает многократно [15]. Учитывая усиленную продукцию АФК в условиях окислительного стресса, этот факт следует признать очень важным для минимизации повреждения клеток и тканей. Альбумин ассоциирует ионы металлов переменной валентности, и является неспецифическим перехватчиком различных форм АФК.
Потенциометрический метод определения антиоксидантной активности с использованием медиаторной системы
Источником информации об антиоксидантной активности служит сдвиг потенциала Pt-электрода в медиаторной системе K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], наблюдающийся при введении образца в раствор [101-103]. Этот сдвиг является следствием химического взаимодействия антиоксидантов с K3[Fe(CN)6], т.е. изменения соотношения окисленной и восстановленной форм компонентов медиаторной системы в результате реакции: где АО - антиоксидант, АОох - продукт окисления антиоксиданта; a, b - стехиометрические коэффициенты реакции. Потенциал медиаторной системы строго подчиняется уравнению Нернста, поэтому до введения анализируемого образца может быть выражен уравнением: Е - измеряемый потенциал в системе до введения анализируемого образца, мВ; Сох - концентрация окисленной формы медиаторной системы в ячейке, М; Ciied " концентрация восстановленной формы медиаторной системы в ячейке, М. После введения в раствор образца, содержащего антиоксиданты, изменяется соотношение окисленной и восстановленной форм, и потенциал медиаторной системы может быть выражен уравнением: где Ei - измеряемый потенциал в системе после введения анализируемого образца, мВ; X - концентрация антиоксидантов в исследуемом образце, М-экв. Таким образом, изменение потенциала служит источником информации об АОА. АОА (М-экв) рассчитывали по формулам (2.2-2.3). Так как в состав молекулы антиоксиданта может входить несколько функциональных групп с антиоксидантными свойствами, под АОА понимается эффективная эквивалентная концентрация антиоксидантов, вступивших в реакцию с K3[Fe(CN)6]. Принцип метода заключается в том, что ABTS (2,2 -азино-бис (этилбензтиазолино-6-сульфонат)) инкубируют с метмиоглобином и Н202 с образованием катион-радикала ABTS + по реакциям (2.4-2.5)[104]. Полученный раствор имеет относительно стабильный зелено-голубой цвет за счет ABTS"+. Оптическую плотность (D) раствора можно измерить при длине волны 600 нм. Антиоксиданты, содержащиеся в тестируемой пробе, уменьшают оптическую плотность, т.е. подавляют развитие окраски пропорционально их концентрации в образце. Измерения производили в следующем порядке: 4. Коэффициент поглощения D измеряли через 3 минуты после смешивания компонентов. Антиоксидантную активность рассчитывали в эквивалентах
Тролокса по предложенной производителем аналитического набора формуле (2.6) [105]: Принцип метода заключается в том, что все формы гемоглобина преобразуют в одну форму — гемиглобинцианид при взаимодействии трансформирующим реагентом (феррицианид калия, ацетонциангидрин, карбонат натрия) [106]. Концентрация гемиглобинцианида, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству гемоглобина, определяется фотометрически при длине волны 540 нм. Содержание гемоглобина (НЬ) в крови определялась по формуле (2.7): где С(НЬ) - концентрация гемоглобина, г/л; ЕИзм - оптическая плотность опытной пробы, отн. ед.; ЕСт - оптическая плотность калибровочного раствора, отн. ед.; Сет - концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л. Метод основан на разделении плазмы и эритроцитов с помощью центрифугирования. Определение производят в гематокрической трубке, представляющей собой стеклянную пипетку, разделенную на 100 равных частей. Перед взятием крови гематокрическую трубку промывают раствором гепарина или щавелевокислых солей. Затем цельную кровь центрифугируют в течение 1—30 минут при 3000 об/мин. После этого отмечают, какую часть в градуированной трубке составляют эритроциты. Гематокритную величину определяют с помощью отсчетной шкалы. Исследование эякулята проводили методом автоматической компьютерной микровидеографии (С AS А - computer-assisted semen analisis). В ходе анализа оценивали количественные и качественные параметры эякулята, включающие следующие характеристики мужских половых клеток: концентрация; категории подвижности; скорости движения. Полученные параметры сравнивали с физиологическими нормами, установленными Всемирной организацией здравоохранения. Также спермиологический анализ включал цитологическое исследование морфологии гамет на окрашенных мазковых препаратах.
Ранее при разработке потенциометрического метода определения антиоксидантной активности [101-103] в качестве рабочего был использован ORP-electrode (Phoenix, США) промышленного изготовления. Это сложная электродная система с внутренним электролитом, имеющая Pt рабочий элемент. Этот электрод является достаточно дорогостоящим и хрупким. В связи с этим, для исследования антиоксидантной активности биологических объектов в качестве рабочего электрода предложен платиновый screen-printed электрод (ООО НПВП «ИВА»), изготовленный методом трафаретной печати путем нанесения платиновой пасты на керамическую подложку с последующим отжигом. Предлагаемый электрод можно изготовить полупромышленным способом в лабораторных условиях, более того, он прост в конструкции и имеет доступную стоимость. Общий вид screen-printed Pt-электрода представлен на рисунке 3.1.
Выбор состава медиаторной системы и условий разбавления пробы
При выборе концентраций компонентов медиаторной системы использованы следующие критерии: -достаточная величина сдвига потенциала системы при введении в её раствор исследуемого образца; -достаточная скорость протекания химической реакции между антиоксидантами образца и окисленным компонентом медиаторной системы; -стабильность потенциала медиаторной системы во времени. Оптимальным для определения АОА является содержание компонентов медиаторной системы Fe(III)/Fe(II) в электрохимической ячейке в соотношении 100/1. Такое соотношение, согласно математическим расчетам, позволяет получить максимальную величину сдвига потенциала системы при введении в ее раствор исследуемого образца, достаточную скорость протекания реакции взаимодействия антиоксидантов образца с окисленным компонентом медиаторнои системы за счет большого избытка K3[Fe(CN)6] и обеспечивает стабильную работу медиаторнои системы. Из экспериментальных данных, т.е. величины АОА цельной крови (6,0-15,0 мМ-экв), для анализа цельной крови и эритроцитарной массы выбрана медиаторная система со следующими соотношением компонентов 0,01М K3[Fe(CN)6]/0,0001M K4[Fe(CN)6]. Для анализа сыворотки и плазмы, которые содержат на порядок меньше антиоксидантов (0,70-2,10 мМ-экв), чем кровь и эритроцитарная масса, оптимальным соотношением концентраций компонентов медиаторнои системы, соответственно, является 0,001 М K3[Fe(CN)6]/0,00001 М K4[Fe(CN)6]. Однако концентрации 0,00001 М раствора K4[Fe(CN)6] недостаточна для установления равновесного потенциала. Также раствор K4[Fe(CN)6] легко окисляется, что делает использование его в малых концентрациях проблематичным. В таблице 3.4 приведены расчетные значения сдвига потенциала, соответствующие различным исследуемым системам. Поэтому была предложена система с содержанием 0,00005 М K4[Fe(CN)6]. При использовании медиаторнои системы, содержащей 0,00005 М K4[Fe(CN)6] наблюдается достаточно быстрое установление потенциала и стабильность его во времени.
В связи с этим, в дальнейшем эта система использована для анализа сыворотки и плазмы крови. При выборе условий разбавления пробы (объема аликвоты) учитывались не только содержание антиоксидантов, но и доступность исследуемого образца. На рис. 3.3 — 3.6 приведены зависимости найденной величины АОА, от объёма аликвоты крови (рис. 3.3), эритроцитарной массы (рис. 3.4), плазмы (рис. 3.5), введённой в 10 мл (рис. 3.3, 3.4) и 1 мл раствора (рис. 3.5). Малая найденная величина АОА при малых аликвотах может быть обусловлена тем, что концентрация образца в ячейке недостаточна для полного протекания реакции взаимодействия антиоксидантов с окисленным компонентом медиаторной системы и полного смещения равновесия в сторону сигналообразующей реакции. Полученные экспериментальные данные показывают, что дальнейшее увеличение аликвоты практически не оказывает влияния на полученные результаты. Таким образом, учитывая с одной стороны, целесообразность экономии биологического материала, с другой, обеспечение полного протекания реакции взаимодействия образца с медиаторной системой, достаточного сдвига потенциала при добавлении аликвоты в раствор медиаторной системы и достаточной скорости взаимодействия антиоксидантов образца с окисленным компонентом медиаторной системы, рабочие условия определения антиоксидантнои активности исследуемых образцов приведены в таблице 3.5. В медицинской практике наиболее используемыми антикоагулянтами являются гепарин, цитрат натрия и ЭДТА. В таблице 3.6 приведены условия разбавления крови антикоагулянтами и их концентрации. В дальнейших исследованиях данные приведены с учетом коэффициента разбавления за счет использования антикоагулянтов. В таблице 3.7 приведены результаты исследования влияния используемых антикоагулянтов на найденные значения АОА как индивидуальных АО, так и их смеси (аскорбиновая кислота (АК), цистеин). Антикоагулянты использованы в тех концентрациях, которые используются для предотвращения коагуляции цельной крови.
Из данных таблицы 3.7 следует, что все перечисленные антикоагулянты практически не влияют на результаты определения АОА. В таблице 3.8 приведены результаты определения АОА одного и того же образца цельной крови, отобранной с перечисленными антикоагулянтами. Таким образом, все перечисленные антикоагулянты могут быть использованы при определении АОА в биологических образцах потенциометрическим методом, что видно при анализе реальных проб и индивидуальных антиоксидантов. Вследствие того, что эритроциты представляют собой клетки крови, получение достоверной информации относительно АОА цельной крови и эритроцитарной массы возможно только после полного разрушения клеточных мембран клеток крови (гемолиза) с целью выхода внутриклеточных антиоксидантов в межклеточную среду. Существует несколько способов гемолиза [40]. Однако наиболее эффективным и часто используемым для клинических исследований является термический гемолиз, т.е. гемолиз путем замораживания образца.
Выбор способа подготовки фолликулярной жидкости к анализу
В связи с тем, что фолликулярная жидкость получена в ходе пункции, в образце возможно наличие эритроцитов и клеток эпителия. Поэтому перед оценкой АОА образцы фолликулярной жидкости центрифугировали (2000 об/мин, 20 мин) с целью отделения от указанных примесей. Как видно из таблицы, АОА фолликулярной жидкости различных фолликулов не является абсолютно одинаковой по значению, однако значения АОА фолликулярной жидкости первого и второго фолликулов достаточно близки по величине. Поэтому диагностику взаимосвязи величины антиоксидантной активности с процессами оплодотворения и развития эмбрионов можно проводить, используя фолликулярную жидкость только одного фолликула, что упростит процедуру отбора пробы. Фолликулярная жидкость является достаточно перспективным объектом для диагностики оплодотворения ооцитов. Она можете быть получена в достаточном количестве во время процедур вспомогательной репродукции. Однако получение достаточно проблематично, т.к. требует оперативного вмешательства. В связи с этим, проведены исследования по выявлению корреляции АОА фолликулярной жидкости и АОА сыворотки крови (таблица 3.17). Степень корреляции полученных результатов составляет 76%. Это даёт возможность использовать анализ сыворотки крови вместо фолликулярной жидкости для диагностики оплодотворения, что позволит избежать оперативного вмешательства для получения образцов. Таким образом, разработаны алгоритмы анализа и исследована антиоксидантная активность цельной крови и ее фракций, семенной и фолликулярной жидкостей. На основании исследований разработана аттестованная методика определения антиоксидантной активности цельной крови, эритроцитарной массы, плазмы, сыворотки, приведенная в Приложении I.
Также предложен подход, позволяющий выделить клеточную составляющую крови и эритроцитарной массы. Высокая степень корреляции АОА фолликулярной жидкости и АОА сыворотки крови позволит упростить процедуру диагностики АОА при нарушениях репродуктивной функции у женщин. Глава 4. Исследование взаимодействия медиаторной системы с пероксидными радикалами и разработка потенциометрического метода определения антиоксидантной активности с использованием радикального инициатора 2,2 -азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорида (ААРН) Реальные процессы, связанные с окислительным стрессом в организме, обычно моделируют, используя реакции генерирования свободных радикалов, поэтому большинство методов исследования антиоксидантной активности биологических жидкостей базируются на использовании таких реакций. Поскольку предложенный и развиваемый нами метод основан на использовании неорганической медиаторной системы и не включает реакций со свободными радикалами, нами была введена модельная реакция генерирования радикалов. Одним из наиболее часто используемых водорастворимых радикальных инициаторов является 2,2 -азобис(2 метилпропионамидин) дигидрохлорида (ААРН). Исследовано взаимодействие пероксидных радикалов ААРН с медиаторной системой.
В этом исследовании выясняется возможность использования медиаторной системы для исследования радикальных реакций, и создания потенциометрического метода определения антиоксидантной активности с использованием взаимодействия пероксидных радикалов ААРН с антиоксидантами образца. В качестве источника пероксидных радикалов использовали водорастворимый азоинициатор 2,2 -азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид (ААРН), который при термическом воздействии разлагается по следующей схеме [76-77]:
![Синтез, свойства и исследование антиокислительной активности галогенидов S-[ -(4-гидроксиарил)алкил]изотиурония](/i/i/4276/436731.png "Синтез, свойства и исследование антиокислительной активности галогенидов S-[ -(4-гидроксиарил)алкил]изотиурония Кандалинцева Наталья Валерьевна")
