Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
Порфиринполимеры 11
1.1.. Классификация порфиринполимеров. Получение 12
1.1.2 Ковалентная иммобилизация порфиринов на полимеры 15
1.2. Модификация тетрафенилпорфиринов 21
1.2.1 Мезо-замещенные -формил-порфирины 21
1.2.2 Нитропроизводные мезо-тетрафенилпорфирина . 23
1.2.3 Синтез металлокомплексов порфиринов 25
1.3. Полимеры-носители в иммобилизации мезо-арилпорфиринов . 27
1.3. Поливиниловый спирт в качестве полимера-носителя. Применение 29
1.4. Растворимость и реологические свойства разбавленных водных рас
творов порфиринполимеров 34
1.4.1 Растворимость мезо-арилпорфиринов и порфиринполимеров 34
1.4.2 Реологические свойства разбавленных водных растворов порфирин-полимеров 37
1.4.3 Влияние природы растворителя на процесс закрепления порфирина на ПВС . 42
1.4.4 Бинарные растворители в процессе ковалентной иммобилизации мезо-арилпорфиринов на полимер 43
1.5. Антибактериальное воздействие бактерицидных материлов 44
Применение порфиринполимеров 47
Глава 2. Экспериментально-методическая часть 52
2.1. Объекты исследования 52
2.2. Методы анализа полученных соединений 56
2.2.1 Спектроскопия видимой и УФ области . 56
2.2.2 ИК-спектроскопия 57
2.2.3 ЯМР-спектроскопия . 58
2.2.4 Элементный анализ 59
2.3. Методика получения водорастворимых порфиринполимеров 59
2.4. Определение вязкости порфиринполимеров 60
2.5. Квантово-химические исследования 63
2.5.1 Оптимизация мезо-арилпорфиринов . 63
65
2.5.2 Сканирование поверхности потенциальной энергии реакции .
2.5.3 Компьютерное моделирование порфиринполимеров 66
2.6. Методы определения антибактериальной активности 67
STRONG Глава 3. Результаты и обсуждение 71
STRONG
3.1. Модификация мезо-тетрафенилпорфиринов и их металлокомплексов . 71
3.2. Иммобилизация полученных мезо-арилпорфиринов на ПВС . 74
3.2.1 Оптимизация условий ковалентного закрепления формилпроизводного тетрафенилпорфирина на ПВС 78
3.3. Синтез металлокомплексов порфиринполимеров 82
3.4. Определение молекулярной массы полученных порфиринполимеров и реологические свойства разбавленных водных растворов иммобилизатов 84
3.5. Квантово-химичесие исследования 91
3.5.1 Теоретическое исследование строения мезо-арилпорфиринов . 91
3.5.2 Исследование механизма реакции ацеталирования 100
3.5.3 Модеирование системы «Порфирин-ПВС» 103
3.6. Обудение результатов первичной оценки биологической активности 104
водорастворимых ПП
Основные результаты и выводы 111
Спсок цитируемой литературы
- Модификация тетрафенилпорфиринов
- Методика получения водорастворимых порфиринполимеров
- Иммобилизация полученных мезо-арилпорфиринов на ПВС
- Теоретическое исследование строения мезо-арилпорфиринов
Введение к работе
Актуальность темы. Благодаря своей уникальной химической природе пор-фирины и их аналоги находят применение во множестве областей науки и техники. Среди синтетических порфиринов одним из наиболее доступных остается ме-зо-тетрафенилпорфирин (НгТРР) и его функциональные замещенные, металло-комплексы которых применяются как основные компоненты функциональных материалов, используемых в катализе, экстракции, качественном и количественном анализе, нелинейной оптике, молекулярном дизайне и медицине. Известно, что порфирины и их аналоги являются активными и биологически совместимыми фотосенсибилизаторами, генерирующими при освещении синглетный кислород, который активно окисляет субстрат опухолевых тканей. С целью получения лекарств комплексного и пролонгированного действия с радиопротекторным действием были использованы порфиринполимеры на основе гемина и медного комплекса хлорина Єб.
Однако НгТРР и его металлокомплексы не растворимы в воде, что практически не позволяет реализовать их в качестве перспективных фармацевтических препаратов. Постадийный синтез стабильных порфиринполимеров, которые принято называть иммобилизатами, обычно заключается в предварительной модификации порфиринов с введением функциональных групп, способных взаимодействовать с полимерной матрицей и последующей их иммобилизацией с образованием ковалентных связей с полимером-носителем. В связи с этим представляется актуальной задача создания новых функциональных материалов на основе порфиринов с целью повышения их биосовместимости, придания антимикробных и сорб-ционных свойств, водорастворимости, а также фотостабильности.
В настоящее время вопрос об исследовании антимикробных свойств новых материалов на основе порфиринов остается актуальным, особенно благодаря появлению сведений о том, что введенные в организм синтетические порфирины могут распозноваться бактериями и включаться, вместо природных, в обмен веществ бактериальных клеток. Поскольку синтетические порфирины отличаются по строению от природных, такое включение может привести к нарушению процессов жизнедеятельности микроорганизмов и их дальнейшей гибели. Таким образом, с помощью водорастворимых иммобилизатов с синтетическими порфиринами можно добиться дезактивации патогенных микробов без вредного влияния на микрофлору организма.
В связи с этим является актуальной разработка синтеза новых водорастворимых порфиринполимеров, обладающих антимикробным действием и изучение их структуры и физико-химических и функциональных свойств.
Цель работы. Направленный синтез водорастворимых порфиринполимеров, содержащих в качестве исходных структурных элементов металлокомплексы ме-зо-арилпорфиринов, и исследование их физико-химических и биологических свойств.
Для достижения поставленной цели были поставлены и решены следующие задачи:
S оптимизация метода формилирования металлокомплексов мезо-тетрафенилпорфиринов по условиям реакции и составу реагентов;
S синтез 2-формил-5,10,15,20-тетрафенилпорфирина Н2ТРР-СНО и его медного (II) CuTPP-СНО, кобальтового (II) СоТРР-СНО, никелевого (II) МТРР-СНО и цинкового (II) ZnTPP-CHO комплексов, как исходных структурных единиц для получения водорастворимых порфиринполимеров;
S квантово-химическое и экспериментальное изучение процесса иммобилизации л/езо-арилпорфиринов на водорастворимом полимерном носителе: поливиниловом спирте (ЛВС);
S синтез 2-формил,10(15)-(4,-нитрофенил)-5,15(10),20-трифенилпорфирина H2TPP-CHO(phenyl-N02) и его медных (II) CuTPP-CHO(phenyl-N02), кобальтовых (II) CoTPP-CHO(phenyl-N02), никелевых (II) NiTPP-CHO(phenyl-N02) и цинковых (II) ZnTPP-CHO(phenyl-N02) комплексов и их иммобилизация на ЛВС;
S исследование реологических свойств разбавленных водных растворов полученных порфиринполимеров;
S первичное исследование биологической активности полученных иммоби-лизатов, определение их антибактериальной активности на бактериальных культурах E.coli, Staphylococcus aureus и Candida albicans, а также дрожжевой культуре Candida sp.
Исследование проводилось с использованием методов электронной абсорбционной, ИК- и !Н ЯМР - спектроскопии, а также элементного анализа, вискозиметрии, биологических и квантово-химических методов.
Научная новизна. С целью получения водорастворимых порфиринполимеров заданного состава исследован и оптимизирован процесс ковалентной иммобилизации л/езо-арилпорфиринов на ЛВС.
Исследованы реологические свойства разбавленных водных растворов полученных иммобилизатов. Показано, что с ростом количества порфирина в иммобилизате увеличивается размер макромолекулярного клубка, но при этом структура введённого иммобилизованного порфирина не влияет на характер взаимодействия полимера с растворителем.
С целью получения материалов, обладающих значительной антибактериальной активностью, синтезированы новые водорастворимые порфиринполимеры, содержащие H2TPP-CHO(phenyl-N02) и его медные (II), кобальтовые (II), никелевые (II), и цинковые (II) комплексы.
Сравнительное изучение антибактериальных свойств полученных иммобилиза-тов показало, что металокомплексы порфиринполимеров в присутствии соответствующих ацетатов металлов (10" - 10" моль/л) обладают более выраженной антибактериальной активностью в отношении исследуемых культур. Исследования водных растворов, содержащих только ПВС, только ацетат цинка или ацетат никеля или ацетат кобальта, только ПВС с ацетатом металла показали, что никакого эффекта не наблюдается ни для одной из перечисленных тест-культур бактерий.
Практическая значимость. Предложенный способ модификации мезо-тетрафенилпорфирина с последующей иммобилизацией его на полимерах-носителях может служить одним из путей получения физиологически активных полимеров на основе порфиринов, в том числе антибактериального действия, включающих в свой состав фрагменты, каждый из которых придает порфиринполимеру определенные свойства (растворимость, биологическую активность и т.д.) в гомогенных условиях. Исследования антимикробной активности полученных порфиринполимеров открывают перспективы использования данных соединений в качестве терапевтических средств с антибактериальным действием широкого спектра действия.
Личный вклад автора. Непосредственное участие на всех этапах работы: постановка цели и задач работы, планирование эксперимента, обсуждение полученных результатов.
Работа выполнена на кафедре химии и технологии высокомолекулярных соединений Ивановского химико-технологического университета при поддержке гранта РФФИ 12-03-01014 и федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, соглашение № 14.В37.21.0840.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на конференциях 35th Inorganic Reaction Mechanisms Meeting (IRMM-35) (Krakov, Poland, 2006), X International Conference on the Problems of Solvation and Complex Formation in Solutions (Suzdal, 2007), IV и VII Международных конференциях молодых учёных «Современные проблемы науки о полимерах» (С-Петербург, 2008, 2011), IV школы-семинара молодых ученых «Квантово-химические расчеты: структура и реакционная способность органических и неорганических молекул» (Иваново, 2009), X и XI Международных конференциях по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов (ICPC-10, ICPC-11) (Иваново, 2009; Одесса, Украина 2011), XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2010» (Суздаль, 2010), II Международной конференции «Техническая химия. От теории к практике» (Пермь, 2010), VI Международной на-
учно-практической конференции «Новые полимерные композиционные материалы» (Нальчик, 2010), XIV Молодежной конференции по органической химии (Екатеринбург, 2011), Всероссийской научной конференции «Современные проблемы и инновационные перспективы развития химии высокомолекулярных соединений» (Уфа, 2012), Всероссийской научной конференции «Органический синтез: химия и технология» (Екатеринбург, 2012), IX Международной молодежной научной школе «Химия порфиринов и родственных соединений» (Иваново, 2012), XVI Молодежной школы-конференции по органической химии (Пятигорск, 2013), III Международной научной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Пятигорск, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в изданиях рецензируемых ВАК и тезисы 16 докладов на международных и российских конференциях.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста и включает введение, литературный обзор, экспериментально-методическую часть, обсуждение результатов, выводы. Работа содержит 14 таблиц, 23 рисунка, 6 схем и 2 диаграммы. Список цитируемой литературы состоит из 160 работ.
Модификация тетрафенилпорфиринов
Однако Н2ТРР и его металлокомплексы не растворимы в воде, что практически не позволяет реализовать их в качестве перспективных фармацевтических препаратов. Постадийный синтез стабильных порфиринполимеров, которые принято называть иммобилизатами, обычно заключается в предварительной модификации порфиринов с введением функциональных групп, способных взаимодействовать с полимерной матрицей и последующей их иммобилизацией с образованием ковалентных связей с полимером-носителем. В связи с этим представляется актуальной задача создания новых функциональных материалов на основе порфиринов с целью повышения их биосовместимости, придания антимикробных и сорбционных свойств, водо-растворимости, а также фотостабильности порфиринам.
В настоящее время вопрос об исследовании антимикробных свойств новых материалов на основе порфиринов остается актуальным, особенно благодаря появлению сведений о том, что введенные в организм синтетические порфирины могут распозноваться бактериями и включаться, вместо природных, в обмен веществ бактериальных клеток. Поскольку синтетические порфирины отличаются по строению от природных, такое включение может привести к нарушению процессов жизнедеятельности микроорганизмов и их дальнейшей гибели.
Таким образом, целью настоящей работы является направленный синтез водорастворимых порфиринполимеров, содержащих в качестве исходных структурных элементов металлокомплексы ./иезоарилпорфиринов, и исследование их физико-химических и биологических свойств.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: S оптимизация метода формилирования металлокомплексов мезо тетрафенилпорфиринов по условиям реакции и составу реагентов; синтез Н2ТРР-СНО и его медного (II), кобальтового (II), никелевого (II) и цинкового (II) комплексов, как исходных структурных единиц для по лучения водорастворимых ПП; S квантово-химическое и экспериментальное изучение процесса иммобилизации л езо-арилпорфиринов на водорастворимом полимерном носителе: ПВС; синтез Н2ТРР-СНО (phenyl-N02) и его медных (II), кобальтовых (II), никелевых (II) и цинковых (II) комплексов и их иммобилизация на ПВС; S исследование реологических свойств разбавленных водных растворов полученных ПП; S первичное исследование биологической активности полученных им-мобилизатов, определение их антибактериальной активности на бактериальных культурах Е.соїц Staphylococcus aureus и Candida albicans, а также дрожжевой культуры Candida sp.
Исследование проводилось с использованием методов электронной абсорбционной, ИК- и 1Н ЯМР - спектроскопии, а также элементного анализа, вискозиметрии, биологических и квантово-химических методов.
Научная новизна. С целью получения водорастворимых порфиринпо-лимеров заданного состава исследован и оптимизирован процесс ковалент-ной иммобилизации л езо-арилпорфиринов на ПВС.
Исследованы реологические свойства разбавленных водных растворов полученных иммобилизатов. Показано, что с ростом количества порфирина в им-мобилизате увеличивается размер макромолекулярного клубка, но при этом структура введнного иммобилизованного порфирина не влияет на характер взаимодействия полимера с растворителем.
С целью получения материалов, обладающих значительной антибактериальной активностью, синтезированы новые водорастворимые ПП, содержащие H2TPP-CHO(phenyl-N02) и его медные (II), кобальтовые (II), никелевые (II), и цинковые (II) комплексы. Сравнительное изучение антибактериальных свойств полученных иммо-билизатов показало, что металокомплексы ПП в присутствии соответствующих ацетатов металлов (10-4 - 10-6 моль/л) обладают более выраженной антибактериальной активностью в отношении исследуемых культур. Исследования водных растворов, содержащих только ПВС, только ацетат цинка или ацетат никеля или ацетат кобальта, только ПВС с ацетатом металла показали, что никакого эффекта не наблюдается ни для одной из перечисленных тест-культур бактерий.
Практическая значимость. Предложенный способ модификации мезо-тетрафенилпорфирина с последующей иммобилизацией его на полимерах-носителях может служить одним из путей получения физиологически активных полимеров на основе порфиринов, в том числе антибактериального действия, включающих в свой состав составляющие фрагменты, каждый из которых придает порфиринполимеру определенные свойства (растворимость, биологическая активность и т.д.) в гомогенных условиях. Исследования антимикробной активности полученных порфиринполимеров открывают перспективы использования данных соединений в качестве терапевтических средств с антибактериальным действием широкого спектра действия.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на конференциях 35th Inorganic Reaction Mechanisms Meeting (IRMM-35) (Krakov, Poland, 2006), X International Conference on the Problems of Solvation and Complex Formation in Solutions (Suzdal, 2007), IV и VII Международных конференциях молодых учных «Современные проблемы науки о полимерах» (С-Петербург, 2008, 2011), IV школы-семинара молодых ученых «Квантово-химические расчеты: структура и реакционная способность органических и неорганических молекул» (Иваново, 2009), X и XI Международных конференциях по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов (ICPC-10, ICPC-11) (Иваново, 2009; Одесса, Украина 2011), XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии– 2010» (Суздаль, 2010), II Международной конференции «Техническая химия. От теории к практике» (Пермь, 2010), VI Международной научно-практической конференции «Новые полимерные композиционные материалы» (Нальчик, 2010), XIV Молодежной конференции по органической химии (Екатеринбург, 2011), Всероссийской научной конференции «Современные проблемы и инновационные перспективы развития химии высокомолекулярных соединений» (Уфа, 2012), Всероссийской научной конференции «Органический синтез: химия и технология» (Екатеринбург, 2012), IX Международной молодежной научной школе «Химия порфиринов и родственных соединений» (Иваново, 2012), XVI Молодежной школы-конференции по органической химии (Пятигорск, 2013), III Международной научной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Пятигорск, 2013).
Методика получения водорастворимых порфиринполимеров
Порфириновые молекулы проявляют свои биологические и каталитические функции только в составе металлокомплексов. Эти функции определяются координационными (донорно-акцепторными, комплексообразующими) свойствами молекулы порфирина и соли металла. Поскольку между тетра-пиррольным макрогетероциклом и ионом металла в молекуле металлопорфи-рина существует очень сильное химическое взаимодействие, можно говорить о координационных свойствах металлопорфиринов [61].
В основе синтеза металлопорфиринов и их аналогов лежат две основные реакции [11, 62-64]: 1) комплексообразования порфиринов с солями, оксидами или карбонилами металлов в растворе; 2) замыкания тетрапирроль-ного макрогетероцикла из его отдельных фрагментов вокруг центрального атома металла ("темплатный синтез"). Второй метод является основным для синтеза комплексов фталоцианина и тетрабензопорфирина. Комплексы собственно порфиринов получаются реакцией комплексообразования (1.3.): H2P(Solv)p + MXm(Solv)n.m - MP(Solv)q + mHX(Solv)r, (1.3), где Н2Р - порфирин; МХm - соль металла; МР - металлопорфирин, п - максимальное координационное число катиона металла в данном растворителе, m - число монодентатных однозарядных ацидолигандов. Ацетаты, хлориды или ацетилацетонаты большинства двухзарядных катионов металлов образуют с порфиринами комплексы в различных органических растворителях. Универсального метода синтеза металлопорфиринов для всех металлов не существует. Это обусловлено как природой металла, так и особенностями различных функциональных заместителей в макроцикле порфирина, определяющими возможность реализации схемы (1.3) в выбранной реакционной среде. В обзорах [65-70] обобщены все известные в настоящее время методы синтеза металлопорфиринов.
Реакции координации порфиринов солями металлов относятся к медленным процессам и характеризуются значительными энергиями активации и отрицательными значениями величин энтропий активации [11, 61, 71]. На основании полученных многочисленных данных исследования кинетики реакции (1.3) был установлен механизм образования металлопорфиринов для всех порфиринов в органических растворителях, который классифицируется как механизм взаимного обмена с ассоциативно-диссоциативной активацией, Металлопорфирины образуются с высокой скоростью в уксусной кислоте, метаноле, ацетоне. Однако устойчивость металлопорфиринов в различных средах имеет определяющее значение для выбора растворителя. Универсальной средой для синтеза металлопорфиринов служит диметилформамид, в котором хорошо растворяются и порфирины, и соли металлов [70]. Кроме того, для этих целей используются основные растворители, например, пиридин.
Как правило, синтез металлопорфиринов проводится при нагревании вплоть до температуры кипения раствора. При этом необходимо, чтобы концентрация реагирующих веществ в реакционной массе была как можно выше. Для этого используются соли металлов, достаточно хорошо раствори мые в органических растворителях: ацетаты, хлориды, карбонилы, ацетил-ацетонаты металлов, взятые в 5-100 - кратном избытке по отношению к порфирину.
Полнота превращения cвободного лиганда в его металлокомплекс легко устанавливается спектрофотометрическими методами.
Значительное место среди носителей, применяемых в иммобилизации ./иезоарилпорфиринов занимают природные полимеры и их производные (целлюлоза, декстран, крахмал, хитозан, белки и др.). В исходном и модифицированном виде они имеют различные функциональные группы, легко вступающие в разные химические реакции. Гидрофильность этих высокомолекулярных соединений позволяет осуществлять их превращения в водной среде, однако эти носители неустойчивы к воздействию микроорганизмов [73]. Однако в последнее время все большее внимание уделяется носителям на основе синтетических полимеров, позволяющих в зависимости от условий синтеза в широких пределах варьировать характер и количество вводимых функциональных групп, стерические особенности их расположения, физические свойства носителя (гидрофильность, полярность и др.) а также его форму (гранулы, трубки, мембраны, покрытия и т.д.). Из синтетических полимеров-носителей используют полиэтиленгликоль, полиэфиры, полиакрилаты, сополимеры акрилатов, полимерные непредельные спирты, полимеры и сополимеры N-винилпирролидона, окиси этилена и т.д. [62, 74-77].
К полимерам-носителям, в зависимости от условий синтеза порфирин-полимеров и поставленной задачи создания материалов с определенными свойствами, определяют следующие требования [3, 73, 78,79]: доступность полимера как индивидуального химического объекта; минимальное число стадий, приводящих к его функционализации и закреплению на нем иммобилизуемого соединения; наличие достаточно охарактеризованных в химическом отношении ре-акционноспособных групп; подходящие структурные и геометрические характеристики (форма, размер частиц, удельная поверхность и пористость полимера-носителя); устойчивость к механическим воздействиям; легкость отделения непрореагировавших продуктов, их устойчивость в условиях процесса и простота выделения; минимальное изменение физико-механических характеристик при мно гократном использовании.
Существуют два основных типа носителей - органические полимеры и неорганические носители. В свою очередь первая группа делится на две большие подгруппы: линейные и сшитые. В качестве неорганических носителей используют оксиды кремния, алюминия и титана, стекла, глины, цеолиты. Перечисленные носители имеют достаточно высокоразвитую поверхность, высокую пористость. Большинство неорганических оксидных носителей имеют поверхностные гидроксильные группы, используемые для эффективного связывания НМС, в том числе металлопорфиринов. Иногда присутствие таких поверхностных групп, создающих очень полярную поверхность, нежелательно в иммобилизате и в этих случаях их удаляют или блокируют. Высокополярные носители применяются в основном для реализации физических методов иммобилизации.
Иммобилизация полученных мезо-арилпорфиринов на ПВС
Растворители ДМФА, хлороформ, этиленгликоль, серную кислоту, соляную кислоту, ацетон использовали марки «ч.д.а.». Все растворители очищали по известным методикам [130,131]. В данном исследовании использовали 98% раствор этилового спирта, дополнительного осушения растворителя не проводили.
Спирты (этанол, этиленгликоль), а также воду в экспериментах с пор-фириносодержащими полимерами использовали как амфипротонные растворители. Выбор спиртов обусловлен их способностью к ассоциации посредством образования водородных связей, в чм проявляется их сходство с водой, а также достаточно хорошей растворимостью в них ПВС. Кроме того, по своей полярности, протонодонорным свойствам и гидрофильно – липофильному балансу такие растворители как диметилформамид и этиленгликоль являются удобной моделью внутренней области биомолекул (гемоглобина, нуклеиновых кислот, ферментов), в матрице которых функционируют биологические макрогетероциклы [132].
Электронная спектроскопия позволяет с высокой точностью определять наличие в молекулах определенных структурных групп (называемых хромофорными), для которых хорошо изучены характеристические электронные спектры. Чаще этот метод используется для качественного анализа строения молекул, хотя может быть использован для количественного анализа по коэффициенту экстинкции (обычно в расчете на моль вещества) [133].
Порфирины и их металлокомплексы обладают выраженными свето-поглощающими свойствами и относятся к одним из наиболее сильных хромофоров [134]. В электронных спектрах поглощения Н2ТРР с преимущественно плоской структурой присутствуют четыре малоинтенсивные ( 104) Q-полосы (I-IV) в интервале 500-660 нм, а также интенсивная B-полоса (Со-56 ре) на границе УФ- и видимой областей спектра (380-420 нм, 2105). Все полосы ЭСП принадлежат электронным (I, III, Соре) переходам тг-тг -природы или их электронно-колебательным (II и IV полосы) составляющим.
Комплексообразование (MP) или двукратная ионизация (Н4Р2+, Р2") порфиринового лиганда приводит к вырождению электронных уровней вследствие роста симметрии молекулы и (D2h D4h) к понижению числа полос в видимой области, имеющих тг-тг - происхождение, с четырех до двух. Вместе с тем, ЭСП комплексов может осложняться наличием переходов, связанных с участием орбиталей металла, а именно d-d -переходы между орби-талями металлы и переходы с переносом заряда между -орбиталями макроцикла Н2Р и d-орбиталями иона металла (d-ти и ж-d ) [135]
Характерные электронные спектры поглощения ЭСП порфириновых соединений в основном сохраняются и для их иммобилизатов. Оптическую плотность как растворов порфиринов так и полученных соответствующих иммобилизатов измеряли в области 400-700 нм.
Электронные спектры поглощения записывали на сканирующем спектрофотометре фирмы Perkin - Elmer UV/VIS Lambda 20 с точностью установки длины волны ± 0.1нм. Воспроизводимость установки длины волны 0.05 нм. Фотометрическая точность 0.003. Все измерения проводились при температуре 25оС с точностью 0.15оС. Все измерения проводились в стандартных кварцевых кюветах толщиной 0.2 см и 1 см.
Инфракрасная спектроскопия до сих пор продолжает оставаться наиболее распространенным физическим методом исследования порфириновых и полимерных соединений. ИК-спектроскопия наряду с рентгенографией, ЯМР, электронной микроскопией и другими методами, вносит свой вклад в исследование надмолекулярной структуры твердого порфиринполимера. Так как ИК-спектры являются «отпечатками пальцев» молекулы, а интенсивность поглощения отдельных групп атомов изменяется пропорционально их кон цетрации, то этот метод наряду с элементным анализом позволяет надежно идентифицировать полученные соединения и определить их структуру [136].
Наиболее распространенный метод приготовления твердых образцов (для анализа с помощью ИК-спектроскопии) – прессование с KBr. Для полимеров его используют наравне с методом получения пленок. Из-за невозможности получения иммобилизатов мезо-арилпорфиринов с достаточно высокими значениями МСИ не удалось определить наличия ацетальной связи в ПП по ИК–спектрам [137]. ИК-спектры порфиринов и ПВС были получены на спектрометре AVATAR E.S.P. в области 3500 -400 см-1.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса на 1Н ядрах регулярно используется химиками для определения молекулярного строения полученных порфириновых соединений. Кроме того, ЯМР – спектроскопия позволяет изучать динамические процессы в образце – определять константы скорости химических реакций, величину энергетических барьеров [138].
Также как и с ИК – спектрами, из-за недостаточного содержания пор-фирина в полученном порфиринполимере не удается получить четкие ЯМР – спектры полученных порфиринполимеров.
Техника ЯМР, так же как и УФ и ИК-спектроскопии, включает приготовление образца, получение спектра и его интерпретацию. Для того, чтобы получить досточно узкие сигналы с хорошим разрешением, спектры регистрировали в виде раствора концентрации не более 10% в дейтерированном хлороформе.
Теоретическое исследование строения мезо-арилпорфиринов
Из таблицы можно сделать вывод, что значительное влияние на ингиби-рование культур оказывает металл, расположенный в координационном центре порфириного фрагмента.
В случае с безметальным порфириновым комплексом при меньшей концентрации раствора наблюдается более низкий рост культур E.coli ATCC 25922 и даже ингибирование грибковой культуры Candida albicans ATCC 885-653, с культурой Staphylococcus aureus ATCC 6538 наблюдаем противоположный эффект.
Медные комплексы нитропроизводных тетрафенилпорфиринов характеризовались лучшей растворимостью и обладали повышенной антибактериальной активностью в отношении Staphylococcus aureus ATCC 6538, но не в отношении E. Coli ATCC 25922. Возможно, это связано со структурными различиями в строении клеточных стенок грамположительных и грамотрица-тельных бактерий. Поскольку возникновением водородных связей между по-107 лимером и поверхностью клеток микроорганизмов, возникающим затем напряжением между молекулами полимера, находящимися на клеточной стенке, и последующим е разрывом объясняют один из механизмов действия полимера в отношении грамположительных бактерий [110, 114].
Другим фактором влияния на ингибирование бактериальных культур ока залась концентрация закрепленного порфирина на полимере-носителе. Уста новлено, что чем меньше содержание порфирина ( 1 %) в порфиринполиме ре, тем выше антибактериальная активность иммобилизата CuTPP-CHO(phenyl-NO2) для бактериальной культуры E.coli ATCC 25922 и грибковой культуры Candida albicans ATCC 885-653.
Например, CuTPP-CHO(phenyl-NO2) с концентрацией 0.5x10-3 моль/л оказывает наибольшее ингибирующее воздействие на рост культуры E.coli ATCC 25922 (21%). С увеличением концентрации CuTPP-CHO(phenyl-NO2) до 0.98x10-3 моль/л приводит к уменьшению эффекта ингибирования роста культуры E.coli ATCC 25922 (диаграмма 3.1). Для бактериальной культуры Staphylococcus aureus ATCC 6538 наибольшей противомикробной активностью обладает образец иммобилизата Im-porphyrin CuTPP-CHO(phenyl-NO2) с концентрацией 2.33x10-3 моль /л (диаграмма 3.2).
Также влияние на ингибирование культур оказывает природа металла, расположенного в координационном центре порфириного фрагмента порфи-ринполимера. С целью исследования влияния природы металла на усиление антибактериальных свойств иммобилизатов, нами были получены цинковые (II), кобальтовые (II) и никелевые (II) комплексы мезо-нитрофенил--формилтрифенилпорфирин - ПВС.
Результаты исследования представлены в табл. 3.12. ПП с ZnTPP-CHO(phenyl-NO2), NiTPP-CHO (phenyl-NO2), CoTPP-CHO(phenyl-NO2) с меньшей концентрацией порфирина обладают наибольшей антибактериальной активностью на исследуемых бактериальных культурах (таблица 3.12). Мы предполагаем, что это связано с полимерным окружением порфирина. Чем меньше порфирина в составе полимера, тем меньше закручивается порфиринполимерный клубок и тем легче он взаимодействует с бактериями.
Таким образом, на данном этапе мы установили, что антибактериальная эффективность зависит от трех факторов: наличия металла в координационной плоскости порфиринового макроцикла, наличия нитрогруппы в порфириновом макроцикле и концентрации ПП при воздействии.
Кроме того, можно сделать вывод о том, что наиболее эффективными являются порфиринполимеры с ZnTPP-CHO(phenyl-NO2) и CoTPP-CHO(phenyl-NO2) в присутствии соответствующих ацетатов металлов.
Одновременное присутствие ацетата металла в растворе с порфирин-полимером дает более выраженный антибактериальный эффект при сохранении небольшой концентрации порфирина в порфиринполимере во всех методах определения антибактериальной активности.
Основные результаты и выводы
1. Оптимизирован метод формилирования комплексов 2-формил-тетрафенилпорфиринов меди (II) и кобальта (II) по условиям реакции и составу реагентов с целью получения исходных структурных единиц для последующего закрепления их на ПВС.
2. С целью получения полифункциональных соединений проведено модифицирование 2-формил-тетрафенилпорфирина и его металлокомплексов за счет введения нитрогруппы.
3. Разработан способ получения и определены оптимальные условия синтеза водорастворимых порфиринполимеров, содержащих синтетические мезо-арилпорфирины и их металлокомплексы путем ковалентного закрепления их на поливиниловый спирт.
4. В результате исследования реологических свойств разбавленных водных растворов иммобилизатов установили, что с ростом количества порфирина в иммобилизате увеличивается размер макромолекулярного клубка за счет включения тетрапиррольного макрогетероцикла в полимерную матрицу. Показано, что структура иммобилизованного порфирина не изменила характер взаимодействия полимера с растворителем.
5. С использованием квантово-химического моделирования установлено, что при иммобилизации нитропроизводного порфирина на ПВС полимерный клубок формируется вокруг тетрапиррольного макрогетероцикла. Тогда, как в модели «ZnTPP-CHO - ПВС» порфирин выходит на поверхность клубка иммо-билизата.
6. Исследование биологической активности водорастворимых иммобилиза-тов мезо-арилпорфиринов показало, что полученные порфиринполимеры с ме-зо-нитрофенил--формил-трифенилпорфирином и его медными (II), кобальтовыми (II), никелевыми (II) и цинковыми (II) комплексами обладают антибактериальной активностью на бактериальных культурах E.coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, а также на дрожжевой культуре Candida Sp. Иммобилиза-ты с немодифицированными порфиринами не обладают биологической активностью в отношении исследуемых тест-культур. Наиболее ярко выражены антибактериальные свойства у иммобилизатов, содержащих цинковые (II) и кобальтовые (II) комплексы мезо-нитрофенил--формил-трифенилпорфирина в присутствии ацетатов соответствующих металлов.
