Введение к работе
Атугуплт^оот*» проСл^ч. Успехи сиотепіологии растений,
особеппо разработка способов пзрйщпвзнпя клоточшх культур
гасшта растеши, позволила значительно облегчить задачу по
лучения змяпокзе соэдпнсшШ растительного происхождения, в
частности локорстЕошиг ECC9CTD. .Прггарош лекарственных ве-
цоств, пепользуегзк D ка.:.»рчоских количествах, могут слу-'
птаь сордочше гдпкозпдц (датасеш, дигптокепп) Digitalis
Inrmta, D. purpurea; протпвоопухолегаз препарата Catharantua
гозеиэ (вяпблзстпз, вппкрпстст); анальгетики Раратег
GOCTirenm (кодеин, ::cpjan) л іпогпо другпэ. Из-за слоішостл
хппчоского состава щегаз продуктов рзститольпого происхож
дения поштея'ХП.ЛЧССЯОГО спітоза,''ясл'о одаокогшопептшп
продуктов, яо всегда успсппи. II по слогах случаях шс бпосип-
тоз в рзстеппл оказывается предлочтитольнгм, IIoDan экспери
ментально созданная спотс::а - клетки п ткапл глсеих расто
пи!, пірспзвзємю па пптатольтіх средах в строго контролиру
ема условиях, позволяет создавать пргшщпиолыго поело тох-
^ологпк'для гіришлошости п сельского хозяйства, однако от
бор нопболоо прддукгигштх клопов при Емрсгдгаания растптзль-
псЗ ткани в культурз бішзог често алтрудлсл пз-аа стсутстгпя
чусстпгтольпого ггогода определения пятсресукатх исследовате
ля сездпісппи. В деппем случае пр^сиснио п^іупогналпза пкэ-
от г-л ирг :':-r.z",z:i ;гр~д трзлЖіспппп методсп, тскт*У! как
zz--'.c".rx;"::~i ;,рс:;г.гогрс"лл. г.::зслс::тро::отрпл,' глссісог'"зі:-
ї.' :";л : ":..;:іос'ліг.а*.трс:гатогрс7":я, ::бо, кск прагпло, для ого
с(;;:;гоі'л;;::птл по грзбуогся c~c:—r.z :{гт-'чг-*гзлглал обработка
сОр"":п, сспр.т,:с!г!ТГ!я с ггсксі uovri "гатл отрэдол.тс:"ГЕ вз-
".'. ( :'. iv;fr" "?р, л"Я Гг'сгггтг* і '"' \-:"::""""\'>), :v -т .г'о?т-
' '''-У-';';.. :: ' ' с" ,' -'"' *:. "'.' - ---^-- .
ное преимущество ихдаоалализп заключается в его экспрессное і: вокїз::лозїп анализировать одновремзкпо до ста образцов.
Среда методов иммукозлализа наиболее популярны:,] становится КША, что объясняется безопасностью а удобством работ с нэрадиоактивпш материалом в сравнении с РИА, а такие елл-роким распространением специальных спектрофотометров, с помощью которых можно проводить измерения оптической плотности в S6 лунках илашета одновременно. Проскольку и в !;?.,, а и РИЛ действуют одни и то х:е термодинамические ограпнчыпм, а присутствие ферментативной меиаі мойві быть обнаружено, если она находится б то:,: ;::а диапазоне молярних концентрации, с каком О0І1ЧИО попользуются радиоактивные изотопы, то чувотвл-телькость и избирательность обоих мэгодов оказызается сравнимой.
Пели и сплаті ітсслг-ідопатш. Целью настоящей рабои: является, создедне 1ц.мулоСермептиых їзет-систем, пршшш.Ы2: для использования в биотехнологии раоїсилй, при опредояошгд сведущих ішзюло'лекуляршіх соединений: стефарина - елкалоида Stephanla glabra Ulers, сбладащого' Едтиголпнэстерогысл активностью; папаверина - алкалоида F.ijever scmnlferua, относящегося к спазмолитическим средствам; дагоксина и родственных соединений - сердечных глпкгшдов Digitalis laaata.
Для достижения этой цели решали следующие задачи:
-
Синтез коныогпроваяных антигенов шзксиолекуляршх соединений с белковыми носителями, определение степени эшло-щзнпя полученных коньюгатов. Бооор оптимальных концентраций для сорбшш аа пластике при проведении твердофазного ИФА для' выявлении специфических антител.
-
Получение поликлональных сывороток с высоким" титром антител к стефарину и папаверину. Оценка их специфичности.
-
Получение мовоклональшп антител к дигоксину, определение их характеристик. Наработка моноклональшх антител в
препаративних количествах, выбор способа очистки антител.
-
Синтез меченых реагентов для иммунсферментного анализа и подбор оптшалышх рабочих разведений.
-
Создание на основе получении* антител твердофазных иммунофермеятных тест-систем для определения указанных соединений в экстрактах растений или клеточных культур. Подбор условий проведения экстракции*, и ИФА.
-
Сравнение результатов анализа проб традиционными методами (ЮЖХ, ТСХ) и результатов, полученных методом ИФА.
Научная новизна. Впервые созданы высокочувствительные
:иммуноферментіше тест-системы для определения стефарина и
папзверинз, осуществлен синтез коньюгировэгашх антигенов и
мечоїшх ферментом алкалоидов. :
Получены и охарактеризованы внеокоэффинные моноклональ-
ные антитела к дигоксину, на основе которых предложен инги-
биторный вариант '-ИФА для определения дигоксина и родственных
. соединений в растительных экстрактах. Специфичность, высокая
чувствительность и точность метода подтверждены с помощью
данных ВЭЮС-анэлизз.
Основные положения, выносимые на зашиту.
Ї. Разработан, твердофазный ИФА для количественного оп-_ ределения стефарина.
. . 2. Разработан, твердефэлшй Шк лля количественного оп- ределешш папаверина. : ;
-
Получены я охарактеризованы. моноклоналыше ентитела к дигоксину.
-
Газработан ИФА для количественного определения ди-гоксигекиновых гликозидов.
Практическая значимость работы. Чувствительность разработанных методов и простота выполнения анализа позволяют использовать иастояндае тест-системы в биотехнологии растений для изучешгя условий накопления вторичных метаболитов в растениях и для селекции клеточных клонов.
Твердофазный ИФА определения стефарша шробнроваи і: используется в Институте ф'лзкологак растений для селекции клеточных клопов Stephanie: Glabra, продуцируетдх стефарші. С учетом конкретних условий проведення анализов, бшш.подоОра-іш оптимальные вариапти зкстракщш алкалоидов из влзяной ткаші.
Разработанная тест-система опрэделзкпя дигоксина и родствашшх соединений Сила использована для подтверждения дашшх селекционной раооти по Digitalis lanata. проводимой в НПО ВИЛР.
дпрооашт раооти. Материалы диссертации докладывались на конференциях: Всесоюзной конференции "Современные направления создашш г.:здшшшіх дпагаоетккумов" (декаорь, 1983 г., Москва), Украинской республиканской конференции "Применение іаа!унофор.:еитного анализа в медицине" (ноябрь, 198Э г.)
Цуоликацші. Материала дкссвртащщ отрааенн в 4 статьях, З тезисах.
Объем и структура яиссертаїдн. Диссертация изложена на страшщах машшописного текста із состоит из введения, обзора литературы, теоретической ц экспериментальной частей, выводов, списка литературы, вклшслаего источника. Работа иллюстрирована схемами, " таблицами, рисунками.
.1 '
