Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 10
1.1 Генномодифицированная продукция и ее значение 10
1.2 Вопросы безопасности ГМО, необходимость контроля и маркировки 12
1.3 Методы определения ГМО 14
1.3.1 Методы определения ГМО на основе анализа нуклеиновых кислот 16
1.3.2 Методы определения ГМО на основе анализа белков 25
2 Собственные исследования
2.1 Цель и задачи исследования 30
2.2 Материалы и методы 30
2.2.1 Отбор и подготовка проб для исследования 31
2.2.2 Методика выделение ДНК с использованием детергента СТАВ. 31
2.2.3 Методика выделения ДНК с использованием сорбента Silica 33
2.2.4 Методика качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов 35
2.2.5 Методика качественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени 41
2.2.6 Методика количественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени 43
2.2.7 Методика идентификации ГМО с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003) 46
2.2.8 Методика определения ГМО на основе амплификации с 46 последующей ДНК-гибридизацией с использованием тест-систем SureFood 2.2 9 Модифицированная методика определения ГМО с применением ДНК-зондов иммобилизованных на мембранных биочипах 48
2.2 10 Методика иммунохроматографического определения трансгенных белков 50
2.2.11 Статистическая обработка результатов 50
2.3 Результаты исследований
2.3.1. Разработка методов определения трансгенных белков в растительном сырье и растительных кормах на основе иммунохроматографии 50
2.3.2. Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения 55
2.3.3. Совершенствование определения ГМО на основе ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией 59
2.3.4. Разработка модифицированного метода определения ГМО с использованием ДНК-чипов 67
2.3.5. Количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме «реального времени» 70
2.3.6. Проведение мониторинговых исследований по выявлению ГМО в продуктах и кормах с использованием различных методов ДНК- и иммунодиагностики 76
3. Обсуждение результатов 80
4. Выводы 90
5. Предложения для практики 92
6. Список литературы 93
- Методы определения ГМО
- Отбор и подготовка проб для исследования
- Методика идентификации ГМО с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003)
- Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения
Введение к работе
1. Актуальность темы
С помощью генной инженерии получены различные трансгенные растения (соя, кукуруза, картофель, хлопчатник, сахарная свекла) с устойчивостью к вирусам, колорадскому жуку и другим насекомым, а также к пестицидам. Производство и оборот трансгенной продукции увеличивается в мире год от года (Дубцова Г.Н. и др., 2003; Мошенский А.А. и др., 2003; Нечаев А.П., 2003; Рогов И.А., 2003; Монастырский О.А., 2004). В настоящее время определенная часть находящихся в обороте в России продуктов и кормов содержат компоненты из генномодифицированных источников (ГМИ). Так как замена трансгенными компонентами белков животных и растений -весьма выгодный бизнес, трансгенные белки постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания и кормах биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур.
Мнения ученых о безопасности генетически модифицированных организмов (ГМО) расходятся. Одни исследователи считают, что генномодифицированный организм безвреден, по мнению других, он является источником биологических и экологических рисков для человека, животных и окружающей среды (Baker В., 1999). Эти риски могут быть связаны как с плейотропным эффектом трансгенного белка, так и со свойствами самой встроенной конструкции, в том числе с регуляторным действием на соседние гены. Введение в пищевую цепочку человека или животных трансгенных структур может привести к непредсказуемому воздействию на их здоровье. В ГМО вместе с целевыми генами могут интегрироваться и другие фрагменты ДНК, несущие гены с нежелательными признаками, например, гены, кодирующие токсины или устойчивость к антибиотикам.
В различных странах, включая Россию, создание, производство, реализация продукции, содержащей трансгенные компоненты, подлежит государственному регулированию. Содержание трансгенных конструкций в продуктах и кормах в соответствии с указаниями Роспотребнадзора и
Россельхознадзора должно быть продекларировано. В соответствии с приказом Минсельхоза Российской Федерации в нашей стране проводится Государственный ветеринарный лабораторный мониторинг остатков запрещенных и вредных веществ в организме животных, продуктах животного происхождения и кормах. В перечень показателей безопасности входят ГМО, которые определяются в сырых и термически обработанных пищевых продуктах животного происхождения, а также в кормах и кормовых добавках.
В системе лабораторного контроля трансгенных продуктов можно выделить два направления. Это методы ДНК-диагностики и методы обнаружения трансгенных белков на основе иммунодиагностики. На основе ДНК-диагностики (ПЦР, ПЦР в режиме «реального времени») определяют как конкретные встроенные гены, так и регуляторные участки ДНК векторных конструкций (35S - промотор, NOS - терминатор). Иммунологические методы позволяют определять непосредственно трансгенные белки. Они основаны на образовании устойчивого комплекса молекулы трансгенного белка (антигена) со специфичными к нему антителами.
В связи с изложенным, весьма важным является разработка и создание высоко эффективных методик для определения трансгенных компонентов в продуктах и кормах. Несмотря на достигнутые в этом направлении значительные успехи, актуальным представляется совершенствование методов в плане экспрессное, оптимизации пробоподготовки, валидации к конкретным объектам и приборам, а также апробация различных модификаций и определение их места в системе скринингового или количественного анализа в соответствии с задачами ветеринарно-санитарного мониторинга продуктов и кормов.
Цель и задачи исследований
Целью исследований являлись разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики.
В задачи исследований входило:
совершенствование определения трансгенных белков в растительном сырье и растительных кормах на основе метода иммунохроматографии;
валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения;
- совершенствование определения ГМО на основе ПЦР с последующей
ДНК-гибридизацией;
- разработка модифицированного метода определения ГМО с
использованием ДНК-чипов;
- количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме «реального
времени»;
- проведение мониторинговых исследований по выявлению ГМО в
продуктах и кормах с использованием различных методов ДНК- и
иммунодиагностики.
Научная новизна
Проведены исследования по усовершенствованию методов определения ГМО в сырье, продукции и кормах, с использованием комплекса методов ДНК- и иммунодиагностики.
Проведены исследования по апробации иммунохроматографических тест-систем для определения трансгенных белков, связанных с устойчивостью к гербицидам и насекомым в растительном сырье, зеленых кормах, в зернофураже. Определены чувствительность и специфичность метода и тест-систем для указанных объектов.
Осуществлена валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в нетермообработанных продуктах и кормах, включающих
компоненты животного и растительного происхождения (мясорастительные полуфабрикаты, комбикорма). Определены чувствительность и специфичность валидированной методики.
На основе мультиплексной ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией усовершенствована методика выявления ГМО в термообработанных и нетермообработанных продуктах и кормах. Определены чувствительность и специфичность модифицированной методики.
Разработана модифицированная методика определения ГМО на основе ДНК-чипов. Определены чувствительность и специфичность методики.
Получены данные мониторинговых исследований по определению содержания ГМО в сырье продуктах питания и кормах и проанализировано соответствие исследуемых проб нормативной документации.
Практическая значимость
На основании результатов исследований для практического использования разработаны:
-Методические рекомендации «Использование
иммунохроматографических тест-систем для выявления ГМО» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 02.06.2008 г.)
- Национальный стандарт (проект) «Растительная продукция. Экспресс - метод обнаружения специфичных белков», который прошел публичные чтения и получил положительное решение технического комитета.
Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
VII Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения». Москва, МГУПБ, 2008 г.
Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии». Москва, ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2008 г.
Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания». Москва, МГУПБ, 2009 г.
Международной выставке «Научно-техническое творчество молодежи (НТТМ)», 2008 г. на ВВЦ. Работа «Совершенствование методов определения ГМО на основе иммунохроматографии», представленная на ВВЦ, была отмечена почетной грамотой.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Совершенствование определения трансгенных белков на основе иммунохроматографии в растительном сырье, зеленых кормах, зернофураже.
-
Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.
-
Разработка модифицированной методики определения ГМО в продуктах и кормах на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией.
-
Разработка модифицированной методики определения ГМО с использованием ДНК-чипов.
-
Количественный анализ содержания ГМО в продуктах и кормах на основе ПЦР в режиме «реального времени».
6. Сравнительный анализ различных методов ДНК- и
иммунодиагностики для качественного и количественного определения ГМО
при проведении мониторинговых исследований продуктов и кормов.
Публикации Результаты исследований отражены в 7 научных статьях, из них две - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения.
Методы определения ГМО
Существуют различные мнения о безопасности генетически модифицированных организмов (ГМО) расходятся. Одни исследователи считают, что генномодифицированный организм безвреден, по мнению других, он является источником биологических и экологических рисков для человека, животных и окружающей среды (Baker В., 1999) (56).
Вместе с приобретением нового признака ГМ-продукт получает и» целый набор новых качеств, опосредованных как плейотропным действием экспрессируемых белков, так и влиянием самой встроенной конструкции, на регуляторные механизмы соседних генов.
Непредсказуемость встраивания измененной конструкции в чужеродный геном является одним из недостатков генно-инженерных методов. Встроенный ген может оказывать влияние на окружающие его гены В следствие этого появляется вероятность изменения процессов транскрипции и трансляции, приводящая к экспрессии новых белков, как, например, токсинов или аллергенов (53,130,62,122,152, 59,71,90,102,159).
Полученные трансгенные сорта растений трудно сохраняют генетическую стабильность и представляют потенциальную опасность для человека и окружающей среды (56, 63, 67, 96,103, 156).
Наличие в трансгенной конструкции фрагментов ДНК, кодирующих устойчивость к антибиотикам может привестиг к нежелательным последствиям (68).
Существуют риски, связанные с накоплением гербицидов и их метаболитов в устойчивых сортах сельскохозяйственных растений (41, 60, 70), а также риски горизонтального переноса трансгенных конструкций, в геном человека, животных и бактерий (128, 65). Оценка различных степеней риска представлена в работах зарубежных исследователей (74, 133, 73, 54,137).
Показано соответствие состава генномодифицированной сои, устойчивой к глифосату, и родительского традиционного сорта (123, 124, 125). Однако имеются и другие данные, что при обработке глифосатом устойчивых к нему сортов сахарной свеклы, растения накапливают токсичные метаболиты (128).
Показана способность репродуктивных тканей хлопчатника, устойчивого к глифосату, к накоплению высоких концентраций этого гербицида - от 0,14 до 0,48 мг/г сухой массы (129). Информация по анализу остаточных концентраций гербицидов в устойчивых к ним ГМ сортах в. сопровождающих документах и описаниях отсутствует.
Экологические риски связаны с возможностью снижения сортового разнообразия сельскохозяйственных культур вследствие подавления их ГМО. (2, 57,58).
Кроме того, приведенны данные по негативному влиянию на биоразнообразие токсичных трансгенных белков на насекомых и почвенную микрофлору (111, 136). Показана устойчивость к трансгенным токсинам у насекомых-фитофагов, бактерий, грибов и других вредителей (15).
Существует возможность образования более патогенных штаммов фитовирусов, при взаимодействии фитовирусов с трансгенными конструкциями.
Некоторые риски могут быть связаны с пролонгированным действием и проявляться через поколения (15).
Для регулирования оборота ГМО принят Картахенский договор, к которому присоединились уже более 180 стран.
В различных странах разработаны планы мониторинга продукции на содержание ГМО (10, 72, 122).
ЕС разработал Директивы о маркировке пищевых продуктов, полученных из ГМО, а также стандарты по методам их контроля (7, 8). В то же время в США маркировка ГМ продуктов питания не является обязательной.
В Российской Федерации разрешено к применению несколько видов растений, полученных с применением трансгенных технологий: 6 линий кукурузы, 3 линии сои, 3 сорта картофеля, 1 линия сахарной свеклы, 1 линия риса.
С целью регулирования оборота и контроля ГМИ принят ряд законодательных актов (20, 28, 29, 30, 31, 36, 48, 49). Постановлением. главного государственного санитарного врача Российской федерации установлен пороговый уровень для маркировки продукции, полученной из ГМИ, которая равняется 0,9 %.
Продукция, полученная из ГМИ и впервые реализующаяся в России, подлежит обязательной санитарно-эпидемиологической экспертизе (3).
Несмотря на различия в законодательствах относительно безопасности ГМО и необходимости маркировки в разных странах мира, включая РФ, определение ГМО в продукции является неотъемлемой мерой в связи с принципами технического регулирования. В соответствии с Федеральным законом «О техническом регулировании» продукция должна соответствовать требованиям технических регламентов и стандартов. Определение компонентного состава продукции, в том числе и ГМО, является важным элементом при подтверждении соответствия и препятствует введению в заблуждение потребителя.
Согласно поправке к Федеральному закону РФ «О защите прав потребителя», вступившей в силу в 2005 году, продукты/ питания, содержащие ГМО, подлежат обязательной-маркировке вне зависимости от процентного содержания компонентов. 1.3. Методы определения ГМО
Определение ГМО в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, проводят по белку или нуклеиновым кислотам. Для этого применяют качественный и количественный анализ. В настоящее время известны стандарты и методические указания по методам определения ГМО. Качественное определение: Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводится в соответствии с ГОСТ Р 52173-2003, МУК 4.2.1902-04 (5, 22). Метод идентификации с применением биологического микрочипа проводится в соответствии с ГОСТ Р 52174-2003 (б). Иммуноферментный анализ проводится в соответствии с МУК 4.2.1913-04 (21). Количественное определение: ПЦР в реальном времени проводится в соответствии с МУК 4.2.1913-04 (21). Иммуноферментный анализ проводится в соответствии с МУК 4.2.1913-04 (21). Исследование продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов (ГММ), проводиться в соответствии с МУ 2.3.2.1935-04 (7).
На настоящий момент Российское законодательство в данной области является одним из самых жестоких в мире. Однако, законы носят декларативный характер, а ужесточение правил сопровождается отсутствием соответствующей контрольно-аналитической базы.
Существует множество различных весьма чувствительных и специфичных способов определения ГМО в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения (151). Для идентификации используется три объекта, по которым можно судить о наличии ГМИ. Этими объектами являются: 1) встроенный чужеродный ген и фланкирующие вспомогательные последовательности; 2) мРНК, матрица для синтеза модифицированного белка; 3) синтезируемый трансгенный белок.
Отбор и подготовка проб для исследования
Детекцию полученных ампликонов проводили электрофорезом в 2% агарозном геле. Приготовление 2% агарозы: 1 г агарозы разводили в 50 мл 1х ТВЕ-буфера и тщательно перемешивали. Колбу с агарозой нагревали в микроволновой печи (5-10 мин), периодически вынимали и перемешивали раствор. Расплавленную агарозу охлаждали до 60С и разливали в подготовленную форму. Толщина геля составляла 0,5-0,7 см. После полимеризации (15-30 минут) удаляли гребенку. Гель помещали в камеру для электрофореза, заполненную 1х ТВЕ-буфером. Толщина слоя буфера над поверхностью геля примерно 2-3 мм
Для проведения электрофореза полученные ПЦР-продукты разбавляли ТВЕ-буфером (содержащим красители ксилен-цианол и бромфеноловый синий) в 5 раз. Вносили смесь в лунки геля. В крайнюю лунку вносили маркер молекулярной массы. Маркер молекулярной массы использовали производства ЗАО «Синтол». Для его получения применяли плазмиду pGEM.
Включали источник постоянного тока. Напряжение составляло 1,5V/CM геля. Электрофорез прекращали, когда ксилен-цианол проходил 2/3 пути. Гель помещали на 10-мин. в раствор бромистого этидия. Затем гель переносили на трансиллюминатора и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете, при длине волны 312 нм.
ПЦР проводили по собственной разработанной программе, в автоматическом режиме, на амплификаторах с детекцией в режиме реального времени: «АНК-32», «АНК-16» производства ИАнП РАН, МГТУ им. Баумана, ЗАО «Синтол» (Россия) и «ICycler» производства Bio-Rad (США).
Для мониторинговых исследований продуктов, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, была предложена следующая методика. Она основана на выявлении широко распространенных линий ГМИ, содержащих гены вставки 35 S промотор и NOS терминатор.
В качестве матрицы использовали выделенную и очищенную ДНК из термообработанных и нативных продуктов. Перед выполнением ПЦР рассчитывали количество реакций. Расчет производили по следующей формуле:
Количество реакций = 2 х количество проб + 4 контроля ПНР Маркировали необходимое количество пробирок для исследуемых образцов, также 2 пробирки для положительного контрольного образца (контроль эффективности ГЩР) и 2 пробирки для отрицательного контрольного образца (контроль контаминации). Пример для 10 проб: 2x10 проб + 4 контроля ПНР = 22 реакции Из-за потерь реагентов, обычно возникающих при пипетировании, готовили смесь с 1 дополнительной реакцией на каждые 10 реакций и 4 дополнительно на каждые 50 реакций.
Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей: смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ - по 2,5 мМ каждого), 2,5 мкл реакционного буфера В, 3,5 мМ MgCk, по 1,7 пкМ прямого и обратного праймера (для 35S), по 1,6 пкМ прямого и обратного зонда (для 35S), по 3,2 пкМ прямого и обратного праймера (для NOS), по 2,1 пкМ прямого и обратного зонда (для NOS), по б пкМ прямого и обратного праймера (для ВПК), по 4,5 пкМ прямого и обратного зонда (для ВПК), 2,5 ед. Taq-полимеразы и 2 мкл ДНК.
В пробирки вносили 2 мкл деионизированной воды в отрицательный контроль, 2 мкл ДНК исследуемых образцов и 2 мкл ДНК в положительный контроль. Данный порядок используется для избежания перекрестной контаминации. Режим амплификации при анализе был использован следующий: Таблица 7 Режим амплификации качественного определения ГМИ.
ПЦР проводили по собственной разработанной программе, в автоматическом режиме, на амплификаторах с детекцией в режиме реального времени: «АНК-32», «АНК-16» производства ИАнП РАН, МГТУ им. Баумана, ЗАО «Синтол» (Россия) и «ICycler» производства Bio-Rad (США).
В качестве матрицы для количественного определения ГМИ использовали выделенную и очищенную ДНК из термообработанных и нативных продуктов. Перед выполнением ПЦР рассчитывали количество реакций. Расчет производил по следующей формуле: Количество реакций = 2х количество проб + 4 калибровочных образца + 2 отрицательных контроля. Маркировали необходимое количество пробирок для исследуемых образцов, таюке 4 пробирки для калибровочных образцов и 2 пробирки отрицательного контроля (контроль контаминации). Пример для 10 проб: 2 х 10 проб + 4 калибровочных образца + 2 отрицательных контроля = 26 реакции Из-за потерь реагентов, обычно возникающих при пипетировании, готовили смесь с 1 дополнительной реакцией на каждые 10 реакций и 4 дополнительно на каждые 50 реакций. Для количественного определения модифицированной сои линии 40-3-2 в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, была предложена следующая методика. Она основана на выявление гена лектина Lee и модифицированного гена, определяющего устойчивость к глифосату.
Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей: смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ - по 2,5 мМ каждого), 2,5 мкл реакционного буфера В, 3,5 MMMgCl2, по 3 пкМ прямого и обратного праймера (для Lee), по 1,8 пкМ прямого и обратного зонда (для Lee), по 6 пкМ прямого и обратного праймера (для RR), по 1,8 пкМ прямого и обратного зонда (для RR), 2,5 ед Taq-полимеразы и 2 мкл ДНК.
В пробирки вносили 2 мкл деионизированной воды в отрицательный контроль, 2 мкл ДНК исследуемых образцов и 2 мкл ДНК в калибровочные образцы. Данный порядок используется для избежания перекрестной контаминации. Режим амплификации при анализе был использован следующий:
Методика идентификации ГМО с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003)
На следующем этапе нами разработана модифицированная методика определения ГМО на основе ДНК-чипов. В отличие от известного метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003) в качестве подложки нами были использованы мембранные фильтры. Схема анализа представлена на рисунке 10.
Схема определения ГМО на основе ГЩР и последующей ДНК-гибридизации с ДНК-зондами, иммобилизованными на ДНК-чипах.
Из исследуемых образцов выделяли матричную ДНК с использованием детергента СТАБ и магнитосорбции, проводили мультиплексную ї амплификацию со специфическими праймерами в присутствии меченых биотином дезоксинуклиозидтрифосфатов, затем проводили гибридизацию с ДНК-зондами, иммобилизованными в виде точек на мембранные чипы, после реакции с конъюгатом (стрептавидинфосфатаза), субстратом и красителем, результаты реакции оценивали визуально по степени окрашивания точек с гибридными молекулами. ДНК-зонды получали предварительно в реакции амплификации, очищали на хроматографических колонках и иммобилизовали на мембранные чипы.
Как показали проведенные исследования, модифицированная методика давала возможность определять ДНК 35S-npoMOTOpa, NOS-терминатора, гена Lee лектина и крахмальной синтазы SSllb. (рис. 11). Чувствительность анализа составляла 10 пг ДНК.
Методика давала возможность обнаруживать ГМО, как в нетермообработанных, так и в термообработанных продуктах и кормах (табл.19 и 20). Таблица 19 Результаты определение ГМО с помощью ДНК-чипов.
Количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме «реального времени» В случае обнаружения в образце модифицированной ДНК (35S промотор, NOS терминатор, и др.., проводили количественную оценку. Для этого использовали методику количественного анализа ГМО методом ПЦР в режиме «реального времени».
В количественной методике использовалась усовершенствованная пробоподготовка с использованием детергента СТАБ и магнитосорбции и также мультиплексная реакция.
Количественная оценка результатов анализа примесей ГМО в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, проводилась по калибровочной кривой Для ее построения использовалиь калибровочные стандартные образцы с процентным содержанием ГМО. Стандарты используются и как положительные контроли. Параметры калибровочной прямой такие как значение среднего квадратичного отклонения R и коэффициент калибровочной кривой А используются для количественного расчета содержания ГМО в исследуемых образцах.
В исследованиях использовались стандарты ДНК, прооизводства IRMM Geel, Бельгия и стандарты ЗАО «Синтол») Стандарты содержали растительные компоненты соответствующей линии ГМИ и модифицированную ДНК. В первой реакции на ген лектина, который присутствует как в ГМ так и в обычной сое, использовали гибридизационный зонд, который метился флуоресцентным красителем R6G, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2. Во второй реакции на специфичный модифицированный ген для сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2применяли гибридизационный зонд, меченный флуоресцентным красителем ROX, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2.
Калибровочный стандарт 0,5% Калибровочный стандарт 0,5% Калибровочный стандарт 1% Калибровочный стандарт 1% Калибровочный стандарт 2% Калибровочный стандарт 2% Калибровочный стандарт 5% Калибровочный стандарт 5% Образец 1 соя 40-3-2 Образец 1 соя 40-3-2 Образец 2 соя не ГМИ Образец 2 соя не ГМИ Образец 3 кукуруза Мои 810 Образец 3 кукуруза Моп 810 Отрицательный контроль Отрицательный контроль 23,88 цикл 23,85 цикл 24,06 цикл 23,98 цикл 23,93 цикл 23,88 цикл 23,92 цикл 24,09 цикл 20,79 цикл 20,95 цикл 21,56 цикл 21,67 цикл реакция не прошла реакция не прошла реакция не прошла реакция не прошла К»млы Цикл 1 М 3U8? j
Калибровочный стандарт 0,5% Калибровочный стандарт 0,5% Калибровочный стандарт 1% Калибровочный стандарт 1% Калибровочный стандарт 2% Калибровочный стандарт 2% Калибровочный стандарт 5% Калибровочный стандарт 5% Образец 1 соя 40-3-2 Образец 1 соя 40-3-2 Образец 2 соя не ГМИ Образец 2 соя не ГМИ Образец 3 кукуруза Моп 810 Образец 3 кукуруза Моп 810 Отрицательный контроль Отрицательный контроль прошла прошла прошла прошла прошла прошла Таблица 21 Анализ результатов ПЦР в режиме реального времени.
Анализ исследования принимается, если; значение порогового цикла для . гена: лектина менее 28, а для модифицированного гена реакция не прошла. Значит выделилось достаточное количество ДНК сои для проведения анализа. Значение порогового цикла для модифицированного гена менее 35. Значит, выделилось малое количество ДНК сои. Для проведения корректного анализа рекомендуется внести большее количество ДНК в ПНР смесь.
Значение порогового цикла для модифицированного гена более 35. Значит, выделилось малое количество ДНК сои. Для проведения корректного анализа рекомендуется внести большее количество ДНК в ПЦР смесь. Проведенный анализ показал специфичность данной методики и вомжность прведения количественной оценки результатов. Аналогичные результаты получены при проведении количественного анализа содержания гена крахмальной синтазы SSllb.
Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения
Как показали проведенные исследования модифицированная методика давала возможность определять трансгенные вставки ДНК 358-промотора NOS-терминатора векторных молекул, а так же непосредственно чужеродных генов.
При этом методика давала возможность обнаруживать ГМО, как в нетермообработанных, так и в термообработанных продуктах и кормах.
В случае обнаружения в образце генов вставки 35S промотор, NOS терминатор и Lee лектина, проводили количественную оценку и идентификацию трансгенной ДНК сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату. Для этого использовали методику количественного анализа ГМИ в ПНР в режиме «реального времени».
В количественной методике использовалась усовершенствованная пробоподготовка с использованием детергента СТАБ и магнитосорбции и также мультиплексная реакция. Первая реакция - ген лектина, присутствующий как в ГМ, так и. в обычной сое. Используемый гибридизационный зонд МЄТИЛИ флуоресцентным красителем R6G. Вторая реакция - фрагмент ДНК специфичный для сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2. Используемый гибридизационный зонд метили флуоресцентным красителем ROX. В качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2. Аналогичным, образом проводили количественную оценку трансгенной ДНК по кукурузе линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку. Методика ПНР в режиме «реального времени» позволяла проводить количественную оценку содержания трансгенной ДНК. Методика количественного анализа была апробирована на трансгенных растениях, а таюке на искусственно приготовленных мясных фаршах с растительными; трансгенными компонентами; Чувствительность анализа - 0,01 %.
Идентификация; сырья, и продукции является важным элементом при подтверждении ее соответствия нормативным документам (технические регламенты, стандарты). Не соответствие сырья или продукции указанным. параметрам идентификации является введением в заблуждение потребителя.
Фальсификация продукции - это несоответствие компонентного состава нормативным документам, по которым она изготовлена. При этом может происходить ухудшение потребительских свойств товара и наиболее свойственных ему характеристик.
Наиболее часто подвергаются фальсификации мясные и рыбные: полуфабрикаты, мясная и. рыбная готовая продукция; Данная продукциям является источником; высоко усвояемого животного белка с. оптимальным : соотношением незаменимых аминокислот, поэтому при; ее фальсификации; могут проявляться негативные последствия; отражающиеся на здоровье-. человека;
При идентификации сырья и; продуктов животного и растительного происхождения используются различные: методы: молекулярно-генетические, морфологические, органолептические, биохимические, иммунологические, физико-химические.
На следующем; этапе проведено сравнение, различных методов; определения ГМО при: мониторинговых исследованиях продуктов и кормов.
В Российской Федерации; для реализации населению и использованию в пищевой промышленности; разрешено несколько линий и сортов генномодифицированных растений; (кукурузы, сои, картофеля, сахарной свеклы, риса). Кроме того, на мировом рынке в обороте находятся продукция, включающая следующие генномодифицированные источники: томаты, рапс, кабачковые, папайя, дыня.
Проведенные мониторинговые исследования показали? соответствие анализируемых продуктов и кормов нормативной документации, стандартам и ТУ, и только в отдельных случаях были выявлены недекларированные продукты и корма, содержащие ГМО.
В мясных изделиях обнаружено от 1 до 3 % продукции, содержащей фальсифицированные примеси растительных компонентов с трансгенной соей или картофелем (котлеты мясокартофельные, полуфабрикаты замороженные в оболочке, котлеты мясорастительные, пельмени замороженные, сосиски, колбаса вареная).
При мониторинге кормов было выявлено от 11 до 25 % продукции, несоответствующей нормативной документации и содержащей ГМО: сочные корма (сенаж, клубнеплоды), зернофураж, полнорационные комбикорма, заменитель цельного молока (ЗЦМ).
Сравнительные исследования известных и разработанных методик показали, что методы на основе иммунохроматографии достаточно эффективны и экспрессны и могут быть использованы в качестве скрининговых тестов для выявления ГМО в растительном сырье, зеленых кормах, комбикормах, ЗЦМ в нетермообработанных полуфабрикатах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения: Разработанные модифицированные методики на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией и ДНК-чипов, сравнимой с классическими методами с применением тест-систем фирмы «SureFood» и метода" идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003) и могут использоваться для выявления ГМО как в термообработанной, так и не в термообработанной продукции и кормах. Для количественной оценки содержания ГМО использовалась модифицированная методика ПЦР в режиме «реального времени».
