Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы .11
1.1 Характеристика стимуляторов роста животных из группы – агонистов и методы их определения 11
1.2 Препарат рактопамин и его фармако-токсикологическая характеристика 24
1.3 Применение рактопамина как стимулятора роста в животноводстве 38
2 Собственные исследования 47
2.1 Материалы и методы исследований 47
2.1.1 Метод иммуноферментного анализа для определения стимулятора роста – рактопамина .50
2.1.2 Методика построения калибровочной кривой по стандартным растворам рактопамина 52
2.1.3 Методика определения предела обнаружения рактопамина в мясе и печени .52
2.1.4 Методика расчета предела количественного определения рактопамина в мясе и печени 52
2.1.5 Методика определения извлекаемости рактопамина из проб мяса индейки .53
2.1.6 Изучение влияния температурной обработки мяса и печени на содержание рактопамина .53
2.1.7 Статистическая обработка экспериментальных данных 54
2.2 Результаты исследований 55
2.2.1 Совершенствование метода иммуноферментного анализа для определения рактопамина в мясе .55
2.2.1.1 Построение калибровочной кривой по стандартным растворам рактопамина .55
2.2.1.2 Определение предела обнаружения и предела количественного определения рактопамина при исследовании свинины 58
2.2.1.3 Определение предела обнаружения и предела количественного определения рактопамина при исследовании говядины и говяжьей печени 60
2.2.1.4 Определение предела обнаружения и предела количественного определения рактопамина при исследовании мяса индейки 63
2.2.2 Определение стимулятора роста – рактопамина в мясе и печени импортного и отечественного происхождения 67
2.2.2.1 Исследование свинины .67
2.2.2.2 Исследование говядины 69
2.2.2.3 Исследование говяжьей печени .71
2.2.2.4 Исследование мяса индейки 72
2.2.3 Изучение влияния температурной обработки мяса и печени на содержание рактопамина .73
2.2.3.1 Влияние процессов замораживания и варки на содержание рактопамина в свинине 74
2.2.3.2 Влияние процессов замораживания и варки на содержание рактопамина в говядине и говяжьей печени 76
2.2.3.3 Влияние процессов замораживания и варки на содержание рактопамина в мясе индейки 78
2.3 Обсуждение результатов исследования 80
Заключение .89
Предложения для практики 90
Список литературы .91
- Препарат рактопамин и его фармако-токсикологическая характеристика
- Применение рактопамина как стимулятора роста в животноводстве
- Методика определения извлекаемости рактопамина из проб мяса индейки
- Определение стимулятора роста – рактопамина в мясе и печени импортного и отечественного происхождения
Препарат рактопамин и его фармако-токсикологическая характеристика
В Российской Федерации (РФ) в медицинской практике используют препарат под торговой маркой - Кленбутерол Софарма, в котором в качестве активного вещества использован кленбутерол. Данный препарат применяют при бронхиальной астме, при симптоматическом лечении хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), при бронхообструктивном синдроме (Инструкция по медицинскому применению препарата Кленбутерол Софарма, 2012).
Известно, что использование – агонистов в клинической практике приводит к расширению бронхов и улучшению бронхиальной проходимости, гликогенолизу в скелетных мышцах и повышению силы мышечного сокращения, гликогенолизу в печени и увеличению содержания глюкозы в крови, снижению тонуса матки, тахикардии, вазодилатации, нарушению метаболизма, снижению чувствительности – адренорецепторов. Данные эффекты фармакологически прогнозируемы (Хартман Э., 1972; Smith D.J., 1998).
Новое исследование американских ученых показало, что число случаев гибели скота, связанных с использованием – агонистов в кормах, намного превышает данные официальной статистики производителей этого препарата. Так, исследователи из Техасского технического университета обнаружили, что в период между 2011 и 2012 годами более 3800 голов крупного рогатого скота, пребывавшего на 10 откормочных площадках, погибло в результате введения рактопамина и зилпатерола в их рацион. Так, исследователи заявляют, что «сама по себе смерть скота редкое явление на фидлотах, поэтому данные, представленные в нашей работе, убедительно свидетельствуют, что рост числа случаев гибели животных в период зернового откорма связан именно с применением стимуляторов роста".
В ответ производители этих препаратов - фармацевтические компании Zilmax и Elanco Animal Health раскритиковали методику исследователей и отметили, что данные кормовые добавки одобрены Управлением по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA).
Методы анализа стимуляторов роста в продуктах животноводства. В настоящее время для определения стимуляторов роста применяют физико-химические и химико-биологические методы.
Физико-химические методы количественного анализа стимуляторов роста основаны на использовании реакций, с помощью которых выявляют и учитывают особенности их химической структуры. Определение содержания стимуляторов роста возможно лишь после их предварительного извлечения и очистки, которые достигаются экстракцией, ультрацентрифугированием, хроматографией и т.д.
К физико-химическому методу относятся метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и метод газовой хроматографии – масс-спектрометрии (ГХ-МС). Эти методы имеют ряд недостатков, ограничивающих их широкомасштабное применение, к которым относятся высокая стоимость используемого оборудования, сложность приготовления проб для анализа, необходимость привлечения высококвалифицированных специалистов. Эти методы отнимают много времени, сложны в постановке (Галкин А.В., Комаров В.И., Иванова Е.А., 1998; Комаров А.А., Крапивкин Б.А., 2006; Тарасов И.Е., 2010). Химико-биологические методы. В качестве биологического метода наибольшее развитие получил радиоиммунологический анализ (РИА), который был предложен в конце 50-х годов. Разработка РИА являлась поворотным моментом в развитии анализа, положившим начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений.
Однако, наряду с несомненными достоинствами, РИА имеет и определенные недостатки, к которым можно отнести следующие: 1) ограниченный срок жизни радиоактивной метки, что вызывает необходимость постоянной замены реактивов; 2) относительно дорогое специальное оборудование для регистрации радиоактивности; 3) возможность радиоактивного заражения окружающей среды при осуществлении большого количества анализов, что вызывает необходимость соблюдения специальных мер предосторожности и высокой квалификации обслуживающего персонала.
Экспресс-методы. В последние годы в мировой практике используют скрининговые экспресс-методы контроля безопасности пищевых продуктов. Среди них лидирующее положение занял иммуноферментный метод анализа (ИФА).
Основные принципы ИФА были предсказаны немецким ученым Полем Эрлихом на рубеже XX века. Размышляя о механизме функционирования защитных систем организма, он сформулировал идею «антител», выработанных организмом при проникновении в его ткани чужеродных объектов, названных «антигенами». Конкретный тип чужого объекта и способ защитной реакции на вторжение могут быть установлены организмом в результате сверхспецифического взаимодействия антител и антигенов, точно подходящих друг к другу.
Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из наиболее активно развивающихся направлений иммунохимии, как в нашей стране, так и за рубежом. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность иммунохимического анализа, сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки. В патентной и научной литературе появляется все больше сведений о рекордных пределах обнаружения веществ данным методом. Высокие результаты достигаются благодаря использованию способности ферментов — биокатализаторов создавать каскадные системы усиления различных химических сигналов.
Основным достоинством метода ИФА является высокая стабильность реактивов, простота методов регистрации, скорость постановки анализа и дешевизна оборудования. Все это позволяет применять данный метод в медицине, сельском хозяйстве, биологической промышленности, охране окружающей среды, а также в научных исследованиях (Белоусов В.И., Матрёшин А.В., Мамаев М.А., и др., 2000; Галкин А.В., Комаров В.И., Иванова Е.А., 1998; Егоров А.М., 1991; Островская А.В., 2004; Тарасов И.Е., 2010 и др.). Резюме Таким образом, проведенный анализ литературных источников по применению препаратов из группы – агонистов в качестве стимуляторов роста животных и птицы свидетельствует, с одной стороны, что они стимулируют рост мышечной массы и регулируют соотношение жировой и мышечной тканей при выращивании сельскохозяйственных животных, что обеспечивает получение постного мяса, пользующегося большим спросом на рынке. При их использовании отмечается снижение отложения жира в тушах на 20-30% при одновременном увеличении мышечной массы до 30% у КРС и у свиней до 16%; препараты безопасные для здоровья животных и применяются с целью повышения эффективности животноводства в ряде стран.
С другой стороны, имеются доказательства, что применение – агонистов приводят к значительным нарушениям здоровья животных (сердечно – сосудистый стресс и другие отрицательные явления).
Применение рактопамина как стимулятора роста в животноводстве
Материалом для исследований служили образцы мяса свиней, крупного рогатого скота и говяжьей печени, мяса индейки отечественного и импортного происхождения, которые отбирали на ряде предприятий (ООО «Проторг+», ООО «Рамфуд») и продовольственных рынках г. Москвы и Московской области (ТК «Петровско-Разумовский», ТЦ «ЮНИОН»), а также образцы, поступившие в ФБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору. Всего исследовано 136 проб, в том числе: свинины – 36; говядины – 46; говяжьей печени – 23; мяса индейки – 31, из них 75 проб отечественного происхождения, 61 проба импортного происхождения (Аргентина, Белоруссия, Бразилия, Германия, Дания, Испания, Литва, Парагвай, США, Украина, Уругвай, Франция).
Отбор проб проводили согласно ГОСТ 7269-79 «Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести»; ГОСТ 7702.2.0-95 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям»; ГОСТ Р 51447-99 « Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб». Пробы, упакованные в полиэтиленовую пленку (ГОСТ 10354-82), доставляли в лабораторию и исследовали на наличие рактопамина в день доставки, допускали хранение образцов не более 2 суток с момента отбора при температуре 2-8С, а также при длительном хранении при - 18С (до 2 месяцев).
Также использовали следующие нормативные документы: ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия»; ГОСТ 6709-72 «Вода дистиллированная. Технические условия». Подготовка проб мяса и печени состояла из нескольких этапов: пробы без жировой ткани измельчали с помощью гомогенизатора «Ultratyuraks», отбирали навеску 3 г гомогенизированной пробы (рисунок 3) в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой на 50 мл, добавляли 8 мл ацетонитрила, 1 мл этилацетата (рисунок 4) и перемешивали на устройстве Vortex (рисунок 5). Встряхивали в течение 30 минут на ротаторе RM-1L Intelli-Mixer, путем переворачивания пробирки вверх-вниз (рисунок 6). Центрифугировали на центрифуге Vеlocity 18R при ускорении 4000 g при комнатной температуре (20…25С) в течение 10 минут (рисунок 7). Переносили 4 мл супернатанта (соответствует 1 г пробы) в другую пробирку и испаряли его досуха при температуре 60С в микроиспарительной системе «ЕVA» (рисунок 8). Растворяли сухой остаток в 2 мл н-гексана, добавляли 1 мл буфера для разбавления проб из комплекта поставки и встряхивали на устройстве Vortex в течение 30 секунд. Центрифугировали при ускорении 4000 g при комнатной температуре в течение 10 минут. Осторожно отбирали нижнюю фазу исследуемого раствора в чистую пробирку. Для анализа использовали 20 мкл нижней фазы на одну лунку. Концентрацию рактопамина в исследуемых растворах в микрограммах на 1 кг (мкг/кг) определяли по калибровочной кривой соответственно относительной оптической плотности, измеренной и вычисленной для этих растворов. Для компьютерной обработки результатов измерений использовали специализированное программное обеспечение RIDASoft.
Метод иммуноферментного анализа для определения стимулятора роста – рактопамина. Определение стимулятора роста – рактопамина осуществляли с помощью иммуноферментного анализа с использованием тест-системы RIDASCREEN Ractopamin R9901 (производство R-Biopharm AG, Германия), где в основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами при протекании ферментативной цветной реакции. Планшет, входящий в состав набора RIDASCREEN Ractopamin, сенсибилизирован антителами «захвата», специфическими к антителам к рактопамину (рисунок 9).
Спектрофотометр LEDETECT 96, снабженный фильтром с длиной волны на 450 нм субстрат/хромоген; стоп-реагент; буфер, для разбавления проб; состав для приготовления 10мМ фосфатного моющего буфера (рН=7,4) (Германия), с использованием спектрофотометра LEDETECT 96, снабженный фильтром с длиной волны на 450 нм (Австрия) (рисунок 10), микроизмельчитель тканей (гомогенизатор) «Ultratyuraks» с частотой 8000-24000 об/мин (Германия), центрифугу с установленным ускорением 4000 g Velocity 18R (Швейцария), устройство для испарения экстрактов «ЕVA» (Германия), устройство для перемешивания Vortex (Латвия), устройство для встряхивания проб RM-1L Intelli
Методика определения извлекаемости рактопамина из проб мяса индейки
Препарат рактопамин был разработан фармацевтической компанией Elanco Animal Health, отделом Eli Lilly, продается под названием Paylean для применения свиньям, Optaflexx - для крупного рогатого скота и Tomax - для птицы (индейкам). Он относится к группе - агонистов, представляет собой соединение, принадлежащий к классу фенэтаноламинов. По своему физиологическому действию он является негормональным стимулятором роста.
– агонисты не являются стероидными гормонами, но по действию их можно сравнить со стероидами. Они обладают сильным антикатаболическим эффектом и способствуют увеличению мышечной массы. Кроме того, эти препараты оказывают значительное жиросжигающее действие, что обеспечивает получение постного мяса, пользующегося большим спросом на рынке.
Рактопамин был утвержден Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США (FDA – Food and Drug Administraion) в 1999 году и Канадским агентством продовольственной инспекции (CFIA – Canadian Food Inspection Agency) под торговой маркой Paylean в 2005 году для использования в свиноводческой промышленности, а в начале 2003 года – для крупного рогатого скота (Еримбетов К.Т., 2007; Каленюк В.Ф., Матвеев В.А., Комкова Е.Е. и др., 1993; Кальницкий Б.Д., Аитова М.Д., Еримбетов К.Т. и др., 1994; Комаров А.А., 2002; 2006; Alemanno A., Capodieci G., 2012; Banned B.E.M., 2010; Bottmiller H., 2012; Minton B., 2010; The free encyclopedia http://en.wikipedia.org.; Sinclair P., 2011).
Так, согласно литературным данным по применению препаратов из группы – агонистов, в том числе рактопамина, в качестве стимуляторов роста животных и птицы сообщается, что они стимулируют рост мышечной массы и регулируют соотношение жировой и мышечной тканей при выращивании сельскохозяйственных животных, что обеспечивает получение постного мяса, пользующегося большим спросом на рынке. При их использовании отмечается снижение отложения жира в тушах на 20-30% при одновременном увеличении мышечной массы до 30% у КРС и у свиней до 16%; препараты являются безопасными для здоровья животных и применяются для этих целей в ряде стран (США, Канада, Бразилия, Мексика, Австралия, Аргентина, Южная Корея, Япония и другие страны) (Eng K., 1990; Меркел Р.А., Буркетт Р.Л., Бабикер А.С., 1989; Topel D.G., 1987; Hancock J. D., Peo E.R., Lewis A.J., 1988; Irvin K.M., Watkins L.E., 1988; Holden P. J., 1990; Gill C., 1990; Aalhus J. L., Jones S.D.M., Schaefer A.L., 1990; Pereira F.A., Fontes D.O., Silva F.C.O et al., 2008; Pereira F.A., Fontes D.O., Vasconcellos F.C.O. et al., 2011).
Имеются доказательства, что применение – агонистов, в том числе рактопамина, приводят к значительным нарушениям здоровья человека и животных. Так, установлено, что у человека при употреблении мяса животных с наличием рактопамина может отмечаться нарушение сердечного ритма (тахикардия), мышечный тремор, гипокалемия, тахифилаксия, чувство беспокойства, головные боли, усиленная потливость, сонливость, мышечные спазмы, повышение артериального давления, тошнота, что особенно опасно для людей с сердечно – сосудистыми заболеваниями. При хроническом поступлении – агонистов в организм человека могут наблюдаться нарушения обмена веществ, онкологические заболевания (Комаров А.А., Латышев О.Е., 2006; Комаров А.А., 2006; Banned B. E. M., 2010; Minton B., 2010).
У животных при применении рактопамина с кормом отмечается сердечно -сосудистый стресс, тремор скелетной мускулатуры, повышенную агрессивность и гиперактивность (http://www.fsvps.ru, 2013). Новое исследование американских ученых, опубликованное в журнале «PLoS ONE», показало, что препарат рактопамин плохо сказывается на здоровье скота, который начинает хромать и, в конечном итоге, просто отказывается передвигаться из-за боли в мышцах. Так, по их данным, в 2011-2012 гг. более 3800 голов КРС погибло в результате применения рактопамина и зилпатерола (http://foodcontrol.ru, 2014). По сообщению B.W. James, М.D. Tokach, R.D. Goodband et al. (2004) и J.N. Marchant Forde, D.C. Lay JR, E.A. Pajor et al. (2003) рактопамин, который скармливается свиньям, выращиваемым в США, вызывает у них стрессовое состояние, увеличивает частоту пульса и оказывает отрицательное воздействие на обмен веществ.
В связи с этим, рактопамин запрещен в 160 странах, в том числе в ЕС, РФ, Китае, Тайване и других странах, т.к. не решен вопрос его безвредности (Banned B.E.M., 2010). Кроме того, в РФ и Таможенном союзе рактопамин не допускается не только к применению, но и продукция, в которой обнаружен рактопамин в любой концентрации подлежит уничтожению или реэкспорту (если он технически возможен) (Власов Н.А., http://www.fsvps.ru, 2012).
Было проведено исследование для определения фармакологической реакции людей на рактопамин. Добровольцам давали однократную дозу препарата (40 мг гидрохлорида рактопамина). Рактопамин быстро всасывался, средний период его полураспада составлял примерно 4 часа. Рактопамин не был обнаружен в плазме через 24 часа после приема. Было показано, что меньше 5% от общего количества рактопамина с выделениями (в моче), представляли исходный препарат и метаболиты конъюгаты моноглюкурониды и моносульфаты, причем основным представленным метаболитом был моносульфат (The free encyclopedia http://en.wikipedia.org.; Fritz R. Ungemach, 2004).
Становится весьма актуальным решение вопросов контроля безопасности продукции в связи с применением рактопамина в животноводстве, а также определения обоснованного максимального допустимого уровня (МДУ) его содержания в мясе и мясопродуктах. Окончательно не решен вопрос обоснованности МДУ его содержания в мясе и мясопродуктах.
Определение стимулятора роста – рактопамина в мясе и печени импортного и отечественного происхождения
Для снижения риска для потребителя необходимо, на наш взгляд, осуществление постоянного ветеринарного контроля за импортом мяса в Российской Федерации на наличие рактопамина в нем, что должно осуществляться в системе «Плана государственного ветеринарного лабораторного мониторинга остатков запрещенных и вредных веществ в организме животных, продуктах животного происхождения и кормах» (2012), который позволит исключать его попадание с продуктами животноводства в организм человека.
В настоящее время, стала весьма актуальной необходимость проведения исследований по разработке и применению скрининговых экспресс-методов выявления стимуляторов роста (в частности, рактопамина) в продуктах убоя сельскохозяйственных животных, которые на первом этапе контроля позволяли бы исключать поступление в Российскую Федерацию мяса и субпродуктов, содержащих рактопамин.
В странах ЕЭС и США методы иммуноферментного анализа признаны эффективными способами контроля и доведены до статуса национальных стандартов (Белоусов В.И., Матрёшин А.В., Мамаев М.А. и др., 2000). Кроме того, как сообщает ряд авторов, ИФА обладает некоторыми преимуществами перед хроматографическими методами, позволяя быстро и достаточно дешево анализировать большое число проб (Нестеренко И.С., Вылегжанина Е.С., Филиппова К.М., Панин А.Н. и др., 2014). Существующий же метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (предел обнаружения 0,1-1 мкг/кг) имеет ряд недостатков, ограничивающих его широкомасштабное применение, к которым относятся высокая стоимость используемого оборудования, сложность приготовления проб для анализа. Этот метод отнимает много времени, сложен в постановке (Галкин А.В., Комаров В.И., Иванова Е.А., 1998; Комаров А.А., Крапивкин Б.А., 2006; Тарасов И.Е., 2010), являющийся официальным нормативным методом.
В этой связи, нами проведены исследования по изучению возможности применения метода иммуноферментного анализа для обнаружения рактопамина в мясе и печени (свинине, говядине и мясе индейки).
На первом этапе, выполнено ряд опытов по совершенствованию метода иммуноферментного анализа для указанных целей с построением калибровочной кривой, определением предела обнаружения (чувствительность метода) и предела количественного определения. Нами было установлено, что предел обнаружения составил для свинины 0,345 мкг/кг, говядины – 0,390 мкг/кг, говяжьей печени – 0,390 мкг/кг и мяса индейки – 0,400 мкг/кг, а предел количественного определения составил для свинины 0,561 мкг/кг, говядины – 0,708 мкг/кг, говяжьей печени – 0,762 мкг/кг и мяса индейки – 0,688 мкг/кг (протокол № 3 от 25.05.2012; протокол № 4 от 25.09.2013).
На заключительном этапе, были проведены исследования производственных проб мяса и печени отечественного и импортного происхождения. Исследованы также положительные по рактопамину пробы (протокол № 1 от 30.01.2012). Рактопамин был обнаружен в двух пробах свинины из Дании в количестве 0,516 мкг/кг и 0,906 мкг/кг, а также в четырех пробах в говяжьей печени из США – 8,100 мкг/кг); в говядине и мясе индейки рактопамин не был обнаружен (протокол № 3 от 25.05.2012; протокол № 4 от 25.09.2013).
Кроме того, учитывая опасность для здоровья человека наличия рактопамина в мясе, с целью определения возможности снижения уровня стимулятора роста – рактопамина в мясе, было изучено влияние температурной обработки мяса и печени – его замораживания с последующим хранением и процесса варки. Используя метод иммуноферментного анализа, исследовали пробы свинины, говядины, говяжьей печени и мясо индейки на содержание рактопамина после замораживания при минус 18 С и длительного хранения в течение 30, 60 и 270 суток, а также процесса варки в кипящей воде до достижении температуры 100С с последующим исследованием через 30, 60 и 120 минут (протокол № 5 от 15.01.2014).
Впервые установлено, что процессы замораживания мяса (при температуре минус 18С) и его хранения (до 270 суток), а также варки (в течение 30, 60 и 120 минут при температуре 100С) не снижают уровня содержания рактопамина в пробах мяса в сравнении с его исходной концентрацией (срок наблюдения). Это дает основание считать, что экспортируемое и содержащее рактопамин мясо и субпродукты не должны подлежать к реализации на пищевые цели, независимо от вида их обработки (охлаждение, замораживание, варка, длительное хранение), что подтверждает решение о запрете мяса с наличием рактопамина, независимо от его хранения и переработки.
Как сообщают Белоусов В.И., Матрёшин А.В., Мамаев М.А. и др. (2000), Цеденова В.А. (2002), если стимуляторы накопились в мясе – они останутся в том же количестве и в колбасе, и в сосисках, и других продуктах переработки. Это обстоятельство еще раз подтверждает положение о том, что мясо с наличием рактопамина не должно поступать на пищевые цели, а утилизироваться.
На основании проведенных исследований разработано «Методическое пособие по количественному определению стимулятора роста – рактопамина в мясе и печени на основе метода иммуноферментного анализа» (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 08.02.2012 г.), рекомендованное для применения как в научно-исследовательских учреждениях, так и ветеринарных лабораториях для ускоренного скринингого контроля наличия рактопамина в свинине, говядине, говяжьей печени и мясе индейки, в частности, импортируемых в Российскую Федерацию из различных стран, а также в порядке контроля внутреннего производства (при возникающей необходимости).
