Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Этиопатогенез, клиника и лечение хронического остеомиелита стр.11
1.2. Современные методы стимуляции регенерации костной ткани стр.17
1.3. Клеточные технологии в стимуляции репаративного остеогенеза стр.20
1.3.1. Общая характеристика стволовых клеток стр.20
1.3.2. Свойства стволовых клеток и их применение в клинической практике стр.25
1.3.3. Клеточная терапия в репаративном остеогенезе... стр.321
Глава 2. Материалы и методы исследования в эксперименте
2.1. Экспериментальные методы исследования стр.37
2.1.1. Общая характеристика эксперимента стр.37
2.1.2. Методы морфологического и иммунофенотипического анализа пуповинной крови животных стр.45
2.1.3. Методы исследования репаративных процессов в костной ткани стр.47
2.2. Методы статистической обработки результатов исследования стр.48
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Обоснование применения клеток пуповинной крови с целью стимуляции репаративной регенерации костной ткани стр.49
3.1.1. Анализ клеточного состава пуповинной крови крыс стр.50
3.1.2. Иммунофенотипическое и морфологическое исследование клеток пуповинной крови крыс стр.51
3.2. Клинико-морфологическая характеристика экспериментального остеомиелита бедренных костей лабораторных животных стр.56
3.3. Изучение эффективности репаративной регенерации после замещения костных полостей экспериментального остеомиелита клетками пуповинной крови стр. 64
3.3.1. Динамика клинико-морфологических изменений в инфицированных дефектах бедренной кости крыс после замещения клетками пуповинной крови стр.64
3.3.2. Динамика клинико-морфологических изменений в полостях бедренных костей крыс без замещения клетками пуповинной крови стр. 78
3.3.3. Анализ эффективности замещения клетками пуповинной крови костных полостей экспериментального остеомиелита стр.87
Заключение стр.93
Выводы стр.101
Практические рекомендации стр.102
Список литературы стр.104
- Этиопатогенез, клиника и лечение хронического остеомиелита
- Экспериментальные методы исследования
- Методы статистической обработки результатов исследования
- Обоснование применения клеток пуповинной крови с целью стимуляции репаративной регенерации костной ткани
Введение к работе
Проблема лечения хронического остеомиелита находится в
центре внимания хирургов и травматологов и не теряет своей
актуальности на протяжении многих лет. Среди гнойных
заболеваний на долю остеомиелита приходится от 3 до 10%
[23,38,53,105]. Широкое внедрение в практику травматологии и
ортопедии различных методов остеосинтеза, часто
необоснованное их применение при недостаточной квалификации специалистов и отсутствии возможности закрытия обширных дефектов тканей вызвало увеличение числа гнойных осложнений. Открытые переломы длинных трубчатых костей в 5,5-75,4% и огнестрельные ранения конечностей в 34-90% случаев осложняются посттравматическим остеомиелитом [27,3 8,53,105]. Послеоперационное нагноение при экстренно выполненном остеосинтезе у больных с открытыми переломами отмечается в 8-10 раз чаще, чем у оперированных в плановом порядке пациентов [62,114,118].
По тяжести клинического течения, трудности ранней диагностики, большому проценту осложнений, приводящих к инвалидности, эту патологию следует отнести к очень тяжелым гнойным заболеваниям. Удельный вес посттравматического остеомиелита длинных трубчатых костей в общей структуре инвалидности колеблется от 10,6 до 11,1% [26,53,105].
Несмотря на применение современных методов и средств борьбы с хирургической инфекцией, результаты лечения остеомиелита пока нельзя признать удовлетворительными. У 15-30% больных острый гематогенный остеомиелит переходит в хроническую форму, рецидивы при хроническом остеомиелите
5 даже после радикальной операции возникают у 10-49,1% пациентов [5,23,3 8,100]. Средняя длительность стационарного лечения больного с хроническим остеомиелитом составляет более 3-х месяцев, при осложненных формах, как правило, требуется многократная госпитализация [29,62].
Проблема лечения хронического остеомиелита заключается
не столько в выборе метода оперативного лечения, сколько в
способе пластического замещения послеоперационного костного
дефекта. Несмотря на значительные прорывы в научно-
технической , области медицины, проблема создания
универсального пластического материала для замещения костной
ткани остается до конца не решенной [62, 99]. Анализ отдаленных
результатов лечения хронического остеомиелита выявил ряд
существенных недостатков существующих способов костно
пластических операций: травматичность, длительную перестройку
трансплантатов в течение нескольких лет, необходимость
длительной госпитализации и иммобилизации больного
[23,29,38,62,99,100]. Такие методы, как мышечная, кожно-
фасциальная пластика, пломбирование полости синтетическими
материалами не приводят к восстановлению анатомической и
функциональной целостности кости [23,84,100,205].
Трансплантация аллогенной, ксеногенной и собственной костной
ткани также имеет ряд недостатков. Наиболее значимым является
дефицит донорского материала [47,67,99].
С учетом этого усилия хирургов направлены на поиски такого материала, который не только замещает послеоперационный дефект, но и способствует более быстрому восстановлению целостности костной ткани.
Наиболее перспективным и быстро развивающимся
направлением в медицине является клеточная терапия. В клиниках США и Европы клеточные технологии нашли свое применение в лечении гемобластозов, аутоиммунных нарушений, циррозов печени, дегенеративных заболеваний нервной системы, репродуктивной системы, повреждений костной, хрящевой и покровных тканей и т.д.
Современным направлением является разработка
биокомпозиционных материалов с иммобилизованными
стволовыми клетками, которые приводят к полноценной регенерации костной ткани в кратчайшие сроки [85,107,233].
Использование клеточных технологий эффективно в критических ситуациях, когда стоит вопрос о спасении жизни человека. Кроме того, снижается инвалидизация пациентов, качественно улучшается восстановление поврежденной ткани и ускоряются процессы заживления, снижающие сроки пребывания в стационаре и стоимость лечения [10,16,59,84].
Основным источником стволовых клеток костной ткани является костный мозг. Однако практическое применение костного мозга выявило ряд недостатков данного метода: инвазивность и болезненность процедуры забора, ограниченность материала в объеме, прогрессивное уменьшение содержания стволовых клеток с возрастом [17,80,217]. Вследствие этого рассматриваются альтернативные источники стволовых клеток для регенерации костной ткани. Наибольший приоритет отдается пуповинной крови, которая нашла свое применение в лечении гематологических заболеваний. Выделение мезенхимальных, эндотелиальных и плюрипотентной популяции стволовых клеток из крови пуповины обосновывает возможность ее трансплантации для лечения других заболеваний, в частности заболеваний
7 костной системы [109,162,218,225].
В Великобритании и Евросоюзе создан совместный проект исследования клеток пуповинной крови. Главной целью данной работы является получение костной ткани из клеток пуповинной крови.
Все вышеизложенное обусловило актуальность выполнения данной работы и изучения нового способа стимуляции костной регенерации.
Цель исследования
Стимуляция репаративной регенерации костной ткани путем трансплантации клеток пуповинной крови на модели экспериментального остеомиелита у лабораторных животных.
Задачи исследования
Воспроизвести модель экспериментального остеомиелита на лабораторных животных (крысах).
Разработать методы выделения и подготовки клеток пуповинной крови животных для трансплантации в костную полость.
Изучить морфологические и фенотипические характеристики клеток пуповинной крови экспериментальных животных.
Изучить особенности регенераторных процессов в костной ткани у экспериментальных животных после трансплантации клеток пуповинной крови и без нее.
8
5. Выработать рекомендации по применению метода
трансплантации клеток пуповиннои крови для стимуляции костной регенерации.
Научная новизна
Разработана методика получения пуповиннои крови у мелких
лабораторных животных (крыс). Изучены субпопуляционная
структура пуповиннои крови крыс методом
иммунофенотипирования и морфологические характеристики клеток при культивировании. Доказано, что в пуповиннои крови крыс имеются стволовые клетки, гемопоэтического и мезенхимального фенотипа.
Воспроизведена модель экспериментального остеомиелита на бедренных костях крыс. На фоне воспалительного процесса в костной ткани регенераторные процессы не приводили к полноценному восстановлению костной структуры. Впервые на модели экспериментального остеомиелита у животных проведено изучение эффективности трансплантации клеток пуповиннои крови и обоснована возможность замещения клетками пуповиннои крови костных полостей.
Новым является то, что используемые клетки пуповиннои крови не подвергались предварительному культивированию и направленной цитодифференцировке в остеогенном направлении, что значительно упрощает метод клеточной трансплантации. Показано, что замещение костных полостей свежевыделенными клетками пуповиннои крови обеспечивает быстрое формирование органоспецифичного костного регенерата и восстановление полноценной анатомической структуры поврежденной кости.
9 Теоретическая и практическая значимость работы
Отработана модель экспериментального остеомиелита у лабораторных животных (крыс), которая позволяет объективно оценивать возможности новых методов костной пластики, в том числе клеточной трансплантации.
Впервые предложено использовать клетки пуповинной крови мелких лабораторных животных для стимуляции репаративного остеогенеза на модели экспериментального остеомиелита. Разработана методика получения пуповинной крови у крыс, изучены морфологические и фенотипические характеристики данных клеток. Выявлена эффективность трансплантации недифференцированных клеток пуповинной крови при регенерации костной ткани в условиях инфицирования.
Результаты проведенного экспериментального исследования
являются теоретической и практической основой для разработки в
клинике новых методов пластического замещения
остеомиелитических дефектов костной ткани.
Основные положения, выносимые на защиту
Разработанный в эксперименте способ получения пуповинной крови крыс позволяет выделить взвесь функционально активных стволовых клеток гемопоэтического и мезенхимального ряда.
Воспроизведенный на крысах экспериментальный остеомиелит является адекватной моделью для испытания новых методов костной пластики, в том числе и метода клеточной трансплантации.
Клетки пуповинной крови лабораторных животных (крыс) обладают способностью стимулировать репаративный остеогенез без их предварительного культивирования и направленной цитодифференцировки.
Трансплантация свежевыделенных клеток пуповинной крови позволяет сократить сроки заживления инфицированных костных дефектов и добиться раннего восстановления анатомической целостности кости как органа.
Апробация диссертации
Основные результаты по теме диссертационного исследования доложены на 72-й итоговой конференции молодых ученых БГМУ (Уфа, 2007), на заседании Ассоциации хирургов РБ (Уфа, 2007), 11 Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва 2007), V конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).
Результаты исследований отражены в 6 публикациях, из них одна — в рецензируемом ВАК журнале.
Объем и структура работы
Диссертация содержит 139 страниц машинописного текста.
Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических
рекомендаций. Содержит 6 таблиц, иллюстрирована 27
рисунками. Список литературы включает 268 отечественных и зарубежных источников.
Этиопатогенез, клиника и лечение хронического остеомиелита
О воспалении кости упоминается в трудах Гиппократа, Абу Ибн; Сины, А. Цельса. Термин «остеомиелит» впервые был предложен Рейно в 1831 г. Однако подробная клиническая картина остеомиелита была описана Ланнелонгом только в 1879 г. Остеомиелит — полиинфекционное заболевание, в возникновении которого принимает "участие широкий спектр гноеродных микроорганизмов, характеризуется сложным комплексом инфекционно-воспалительных, травматико- ишемических и репаративных изменений в кости и парооссальных мягких тканях [25,27,36,38,41,63,78,83,99,105]. Основным возбудителем на протяжении многих лет является стафилококк, увеличилась инфицированность грамотрицательной палочковой флорой; анаэробная флора обнаруживается более чем у половины больных с хроническим посттравматическим остеомиелитом и у трети пациентов с инфицированными открытыми переломами длинных трубчатых костей [4,23,26,38,40,53,62,63,99,110,114,118]. По клиническому течению различают острый и хронический остеомиелит [27,38,41,63,99]. Хронический остеомиелит развивается, если в результате лечения острого остеомиелита, не наступило выздоровление, а патогенная микрофлора не подавлена и наступили некротически-деструктивные изменения в кости [27,38,40,54,62,63,105,118] Патогенетическим фактором развития хронического остеомиелита служит некротический процесс в кости с образованием секвестра, некротизированными участками в стенке костной полости, склеротическими изменениями кости [25,27,41,63,78,99,118]. Необходимо подчеркнуть, что из всех тканей человеческого организма кость наиболее подвержена хронической инфекции [38,44,78]. В связи с длительным, порой 25-30-летним течением заболевания происходит выраженная дистрофия костной ткани вокруг патологического очага. Формируется большое число сопутствующих остеомиелиту осложнений, таких, как трофические язвы и рубцовое перерождение мягких тканей, деформации и укорочения конечностей, ложные суставы и несросшиеся переломы, нарушение лимфо- и кровообращения [27,28,63,99,105]. В генезе таких осложнений немаловажное значение имеют обширные, инфицированные травматические раны, поздняя и неполноценно выполненная хирургическая обработка, наличие в организме очагов скрытой инфекции, чрезмерная травматизация ран во время операции, необоснованное применение металлических конструкций, нерациональная антибактериальная терапия [1,5,26,29,40,53,99,100,114,118,135]. Клиническая картина хронического остеомиелита зависит от реактивности организма, вирулентности возбудителя, возраста больного, локализации, распространенности и длительности процесса, наличия осложнений [38,40,53,63,105,118]. Характерной особенностью хронического остеомиелита является затяжное, длящееся годами течение заболевания, чередование периодов обострения и ремиссии. Основным и наиболее информативным методом диагностики хронического остеомиелита является рентгенологический метод [83,103,126]. Томографическое исследование позволяет выявлять мелкие, до 3-5 мм, секвестры. С помощью компьютерной и ЯМР томографии выявляются патологические изменения на любой глубине и протяженности, состояние окружающих суставов и мягких тканей. Радиоизотопная сцинтиграфия применяется для раннего выявления атипичных форм первично хронического остеомиелита, дифференциальной диагностики опухолей костной системы [38,63,90,99,118]. В диагностике также применяются фистулография, ультразвуковое исследование, термография, ангиография. Бактериологическое исследование необходимо для качественной и количественной оценки микробного состава воспаления, определения чувствительности флоры к антибиотикам [38,63,99]. Хроническая стадия остеомиелита, независимо от этиологического фактора и локализации, требует общих принципов лечения [62,99,118,135]. Основой этиопатологического лечения является радикальная хирургическая операция - удаление патологического очага, секвестров, некротических костных тканей, иссечение свищей с окружающими рубцами и грануляциями [38,63,64,99,100,105,118]. Хирургическое лечение больных с хроническим остеомиелитом условно можно разделить на два этапа. На первом этапе проводится радикальная хирургическая обработка гнойного очага с иссечением всех нежизнеспособных тканей [23,38,46,62,64,99,100,135]. Дополнительная санация механическими, химическими и физическими методами позволяет добиться практически полной стерилизации костной полости [4,5,23,38,40,64,68,83,99,135]. На втором этапе проводятся костнопластические операции. Если мнения о радикальности операции как этапа хирургического лечения хронического остеомиелита сходятся, то вопрос о пластическом замещении костного дефекта продолжает широко дискутироваться [5,23,38,46,99,108]. Методики замещения костной полости можно условно разделить на группы согласно происхождения пластического материала. Применение пломб из материалов небиологического происхождения. Материалы из корундовой, циркониевой, алюмоокисной керамики, полимеры, титановые и углеродные имплантанты не влияют на остеогенез, не замещаются костной тканью, часто осложняются переломами кости в области имплантанта, вследствие чего используются только в качестве протезов и фиксаторов [8,47,99,156]. Рассасывающиеся полимеры на основе трикальцийфосфата, гидроксиапатита и полигликоевой кислоты способны постепенно замещаться костной тканью, однако этот процесс длительный и сами материалы недостаточно прочные [8,9,19,47,71,154,156,157,171,195,245,264]. В клинике нашли применение препараты «ЛитАр», «Коллапан», «Биосистал» [19,47,48,61,71,74,94]. Применение синтетических заменителей в пластике остеомиелитических дефектов ограничивается высоким риском инфицирования [47,59,71,99].
Экспериментальные методы исследования
В соответствии с поставленными целью и задачами был выполнен хронический эксперимент на 79 половозрелых белых крысах линии «Вистар» обоего пола массой тела от 250 до 400 г. Животные содержались в одинаковых условиях обычного виварного режима при смешанном освещении. Кормление производилось два раза в день в соответствии с установленными нормами, обеспечение водой не ограничивалось. Размещались животные в пластиковых клетках, не более 10 крыс в каждой. Оперативные вмешательства и болезненные манипуляции проводились в экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики. Все манипуляции, связанные с болевым воздействием, осуществлялись с использованием ингаляционных анестетиков. Умерщвление животных производилось путем передозировки эфирного наркоза. Общая длительность эксперимента составила 6 месяцев. Содержание животных и манипуляции на них проводились согласно приказу МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г. Экспериментальное исследование носило поэтапный характер, на каждом этапе решались определенные задачи (таблица 1). В ходе эксперимента проводилась подсадка самок к самцам с целью оплодотворения. Беременность наступила у 25 самок. Забор пуповиннои крови осуществлялся у беременных крыс на максимальном сроке гестации (21-24 сутки). Сроки беременности определялись по косвенным признакам: отсчет сроков от момента подсаживания самцов, пальпаторное исследование живота, изменение поведения самок (малая подвижность, подготовка животными гнезд), кровянистые выделения из половых путей. На первом этапе производилась отработка технологии получения стволовых клеток из пуповиннои крови животных. С этой целью проведен эксперимент на 25 беременных самках, ориентировочно на 21-24 сутки беременности. Под эфирным наркозом в асептических условиях после обработки операционного поля производилась лапаротомия, выделение плодов. Сроки беременности подтверждались размерами плодов, их жизнеспособностью, наличием самостоятельного дыхания, двигательной активности. Не травмируя сосудистые связи, удалялись все оболочки с плода и пуповины. У плодового конца проводилась пункция сосудов пуповины иглой со шприцем, смоченным 6% раствор ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). При затруднении пункции сосудов возможен забор крови путем надсечения пуповины и сбора пассивно вытекающей крови в стерильную пробирку, содержащую 6% раствор ЭДТА. От одной беременной самки возможно получение 0,5-1,0 мл пуповиннои крови с содержанием 6% раствора ЭДТА в соотношении не менее 10:1 (рисунок 1). Для трансплантации в костный дефект готовили взвесь ядросодержащих клеток с соблюдением стерильности. С этой целью для осаждения эритроцитов смешивали пуповинную кровь с 33%-ным раствором полиглюкина в соотношении 1:2, седиментация длилась в течение 60-90 минут до четкой границы. Супернатант удаляли, оставшиеся клетки промывались в фосфатно-солевом буфере путем центрифугирования в течение десяти минут при 1500 об/мин. Надосадок удаляли, клетки ресуспендировали путем пипетирования. Таким образом, получали взвесь ядросодержащих клеток в количестве 1,8-2 105 в 1 мкл.
Методы статистической обработки результатов исследования
Иммунофенотипический анализ клеток пуповинной крови производился в отделении клинико-лабораторной диагностики ФГУ «Всероссийский Центр Глазной и Пластической Хирургии» на проточном цитофлюориметре Becton Dickinson FACSCalibur. К 100 мкл каждого образца пуповинной крови (п=9) добавляли по 5 мкл моноклональных антител («Catlag Labs», BD) к антигенам CD34, CD45, CD90, меченным флюорохромами FITC и РЕ. Образцы инкубировали 15-20 мин при постоянном перемешивании в шейкере при комнатной температуре (20-25С). Затем добавляли по 1 мл рабочего лизирующего реагента («Cal-Lyse», BD), перемешивали, инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, перемешивали осадок на вортексе, добавляли 2 мл промывающего буфера («CELL-Wash», BD). Центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, осадок перемешивали при добавлении 0,5 мл промывающего буфера. Анализ проводили при количестве событий 50 тысяч. В качестве отрицательного изотипического контроля использовались мышиные IgGl FITC и IgG2a РЕ. Результаты анализировали в рамках программы Cell Qest. Культивирование клеток пуповинной крови проводилось в проблемной научно-исследовательской лаборатории трансплантологии ГОУ ВПО «Башкирский Государственный Медицинский Университет». Отмытые мононуклеарные клетки пуповинной крови рассеивали в стерильные культуральные пластиковые флаконы ("Gostar", USA) с плотностью 1,5 млн. клеток в 1 мл. Питательная среда состояла из 90% среды ДМЕМ, 10% бычьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург) и 40мг/мл гентамицина. Клетки культивировались в СОг-инкубаторе («Jouan», Франция) в условиях СОг-5% при +37С в течение 15 суток. Через сутки после помещения в культуру неприкрепившиеся клетки удаляли и добавляли новую порцию среды. В дальнейшем среду меняли на 4 и 6-е сутки культивирования. Ежедневно проводили динамическое 47 наблюдение за первичными культурами клеток на инвертированном микроскопе с программным обеспечением (Leica, Германия) и регистрацией морфологических признаков. В ходе эксперимента осуществляли динамическое наблюдение за состоянием животных: изменения аппетита, двигательная активность, визуальное обследование состояния оперированных конечностей. Рентгенологическое исследование оперированных конечностей опытных животных выполнялось на рентгенологическом аппарате РУМ-20 в режиме 44 тА 0.1 кВ с экспозицией в 1 сек. Проводили сравнительный анализ рентгенологических данных на 30-е сутки после моделирования экспериментального остеомиелита; на 15, 30, 60, 90, 120-е сутки после трансплантации клеток пуповинной крови в костный дефект и без нее. Оценивали размеры костного дефекта, его форму, однородность структуры регенерата, состояние надкостницы, кортикальной пластины и костномозгового канала. Сразу после выведения из эксперимента всех животных подвергали аутопсии, во время которой оценивали состояние окружающих мягких тканей, наличие или отсутствие выпота в области операционного вмешательства, состояние надкостницы, кортикального слоя и костномозгового канала. Из области операции проводилось взятие пробы на бактериологический посев на среду Чистовича (желточно-солевой агар). Результат оценивали на 2-4 сутки. Забор материала для гистологического исследования проводили путем тщательного сепарирования мышц от костей, выделения сегментов костей длиной 1-1,5 см с областью костного регенерата. Костный материал фиксировали в 10% растворе формалина в течение 3 суток, подвергали декальцинации в 7% растворе азотной кислоты, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. Срезы толщиной 0,8 мм окрашивали гематоксилин-эозином. Всего приготовлено 250 гистологических препаратов. Микроскопическое исследование проводили на светооптическом микроскопе (Leica, Германия) с применением увеличения 100-400Х. Статистическая обработка результатов исследования проводилась стандартными методами: определение средней арифметической вариационного ряда (М), стандартного отклонения (SD), стандартной ошибки среднего (т), объем выборки (п). Для определения статистической значимости полученных результатов были использованы: для сравнения средних величин опытной и контрольной группы - критерий Стьюдента (t) для независимых выборок, для сравнения качественных показателей - угловое преобразование Фишера (ф ). Все статистические данные считались достоверными при уровне значимости а менее 5% (р 0,05). Статистическую обработку результатов проводили с применением современных программных пакетов математико-статистического анализа.
Обоснование применения клеток пуповинной крови с целью стимуляции репаративной регенерации костной ткани
Получение пуповинной крови проводилось из сосудов пуповины плодов крыс на максимально поздних сроках беременности. Забор осуществлялся у еще не рожденных крысят, в связи, с чем возможно возникновение противоречий в терминологии полученных клеток: фетальные или постнатальные взрослые клетки. Проводя аналогию с человеком, мы пришли к выводу о том, что клетки пуповинной крови занимают промежуточное положение между фетальными и взрослыми стволовыми клетками. Так как клетки получены у полностью сформированных, жизнеспособных плодов за 1-4 сутки до родов, мы отнесли их к взрослым клеткам и для простоты изложения обозначаем клетками пуповинной крови крыс. Проблема стимуляции костной регенерации клетками пуповинной крови требует тщательного экспериментального исследования. Перед нами стояла задача определить морфологические особенности регенераторных процессов в поврежденной костной ткани под воздействием клеток пуповинной крови и без нее. Для этого требовалось провести анализ клеточного состава пуповинной крови животного с целью подтверждения наличия в ней стволовых клеток. Затем в эксперименте на животных воспроизвести модель инфицированного послеоперационного дефекта костной ткани и произвести трансплантацию стволовых клеток в созданную полость. Изучение характера и динамики морфологических изменений костной ткани после пересадки клеток пуповинной крови и без нее позволило сделать выводы об эффективности данного метода и создало предпосылки для дальнейшего клинического применения. При анализе клеточного состава пуповинной крови крыс получены следующие данные (M±SD): эритроциты - 6,16±1,02 109/мл; лейкоциты - 18,4±1,6 10б/мл; тромбоциты — 584±81,3 106/мл; гемоглобин - 10,3±1,4 г/л; гематокрит — 27,8±4,3%; лимфоциты - 60,3±3,3%; моноциты - 20,3±2,3%; гранулоциты - 19,6±0,4%. Результаты исследования свидетельствуют, что пуповинная кровь лабораторных животных (крыс) в среднем содержит аналогичное количество ядросодержащих клеток (18,4±1,6 10 ), что и пуповинная кровь человека (15,22±5,2 106) [2,24,34,75]. Однако по содержанию мононуклеарной фракции показатели различаются: в пуповинной крови крыс содержится около 80 % мононуклеаров, а в пуповинной крови человека практически в 2 раза меньше. По данным литературных источников, стволовые клетки выделяются именно среди фракции мононуклеарных клеток [56,109,144,162,194,200,215,217,225]. При выделении фракции ядросодержащих клеток методом седиментации эритроцитов в полиглюкине получено 92% жизнеспособных клеток, что подтверждено методом суправитального окрашивания. Таким образом, предложенный метод получения взвеси клеток пуповиннои крови крыс для последующей трансплантации позволяет сохранить жизнеспособность и функциональную активность клеток. Как известно из литературных источников мезенхимальные стволовые клетки при культивировании характеризуются фибробластной морфологией, адгезивной способностью к пластику, способностью к колониеобразованию. Для подтверждения наличия стволовых клеток в пуповиннои крови крыс мы изучили их морфологические особенности при культивировании. С этой целью отмытые мононуклеарные клетки были рассеяны в культуры. Не прикрепившиеся к пластику клетки удалялись из культуры в процессе смены питательной среды. На 3-5 сутки в культуре определялись пластикадгезивные клетки округлой формы, небольших размеров, с крупными ядрами. По мере культивирования размеры клеток увеличивались, появлялись крупные многоядерные клетки и веретеновидные фибробластоподобные клетки. В целом популяция культивируемых клеток была гетерогенной по размерам (от 10 до 300 микрон) и по форме (круглые, треугольные и веретеновидные). На 15-е сутки формировались редко распределенные колонии, состоящие главным образом из фибробластоподобных клеток (рисунок 3).
