Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ИШЕМИЧЕСКИЕ И РЕПЕРФУЗИОННЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ТОНКОЙ КИШКИ В УСЛОВИЯХ НАРУШЕНИЯ МАГИСТРАЛЬНОГО КРОВОТОКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 10
1.1. Функциональная морфология тонкой кишки 10
1.2. Локальные и системные проявления ишемического повреждения тонкой кишки 11
1.3. Механизмы и маркеры развития системного воспалительного ответа 16
1.4. Методы изучения бактериальной транслокации из желудочно-кишечного тракта 28
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
2.1. Материалы и методы исследования in vitro 34
2.1.1. Приготовление бактериального радиопрепарата 34
2.1.2.Радиометрическое исследование бактериального радиопрепарата...35 2.1.3.Бактериологическое исследование бактериального радиопрепарата.35
2.2 Материалы и методы исследования in vivo 36
2.2.1. Распределение экспериментальных животных на группы 35
2.2.2. Оперативные вмешательства у животных 39
2.2.3. Методы исследования in vivo 44
2.3 Методы статистической обработки результатов 47
ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 49
3.1. Экспериментальная модель 49
3.1.1. Вариантная анатомия каудальных и краниальных брыжеечных сосудов лабораторного животного кролика 50
3.1.2. Морфологические изменения кишечной стенки в условиях кратковременного острого прекращения магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов 52
3.1.3. Микробный пейзаж желудочно-кишечного тракта кролика. 58
3.2. Получение бактериального радиопрепарата с устойчивой фиксацией радиоактивной метки 59
3.3. Проницаемость стенки тонкой кишки для Escherichia coli в условиях сохраненного магистрального кровотока 65
3.4. Проницаемость кишечной стенки для Escherichia coli при острой обратимой
тотальной ишемии 67
3.5. Морфофункциональные корреляции бактериальной транслокации при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов 75
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 79
ВЫВОДЫ: 89
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ: 90
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90
- Функциональная морфология тонкой кишки
- Материалы и методы исследования in vitro
- Вариантная анатомия каудальных и краниальных брыжеечных сосудов лабораторного животного кролика
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Необходимость острого прекращения магистрального кровотока в бассейне верхних брыжеечных сосудов возникает при выполнении расширенных хирургических вмешательств по поводу заболеваний билиопанкреатодуоденальной зоны, при операциях на супраренальном сегменте брюшной аорты, в условиях тяжелой абдоминальной травмы. Ишемия кишечной стенки при кратковременной (до 60 минут) окклюзии сосудов считается обратимой и, по мнению ряда авторов, не представляет угрозы для жизни больного (Кирпатовский И.Д., 1964; Кулик В.П., 1975). Имеющиеся в литературе разноречивые данные о повреждающем системном воздействии кратковременной ишемии не позволяют хирургу определить временной интервал, в течение которого выключение из кровообращения тонкой кишки не повышает риска развития системных осложнений. Дискутабельным остается вопрос о закономерностях развития бактериальной транслокации в условиях острого прекращения магистрального кровообращения тонкой кишки и ее роли в развитии синдрома системного воспалительного ответа (Gianotti L. et al., 1992; FeltisA. etal, 2000; Suzuki Y. etal, 2000).
Хирургические маневры при выполнении сосудистого этапа расширенной операции на органах билиопанкреатодуоденальной зоны включают различные формы нарушения магистрального кровотока по верхним брыжеечным сосудам: временное прекращение венозного оттока, временное прекращение артериального и венозного кровотока, временное и окончательное интраоперационное шунтирование, интраоперационная артерио-венозная перфузия тонкой кишки (Иванова Е.В., 1994; NakaoA., 1990; Tashiro S., 1991; Machado M.C., 2001; РасуловР.И., 2002). Имеются сообщения о возможности перевязки верхней брыжеечной вены при сформированном окольном кровотоке (Child С. G. 1954., Ильичева Е.А, 1999). В литературе нет убедительных данных, касающихся безопасного временного интервала прекращения магистрального портального оттока. Опасность развития реперфузионных повреждений, исходя из экспериментальных работ, возникает с момента повреждения слизистой тонкой кишки. В механизме ишемических и реперфузионных повреждений кишки в последнее время большое значение придается роли бактериальной транслокации и системного воспалительного ответа, активируемого цитокинами (TNF-alpha, IL-6 и др.), индуцирующего развитие полиорганной недостаточности (Grotz M.R., 1999; Suzuki Y., 2000). В настоящее время сроком максимальной допустимой переносимой тотальной ишемии кишечника считается один час, однако ранние морфологические изменения регистрируются уже при 5—10-минутной ишемии (Банин В.В., 1979). В литературе отсутствуют данные о сроках переносимой ишемии, не сопровождающейся развитием системного воздействия факторов, запускающих синдром системного воспалительного ответа. Именно этот временной интервал можно определить как безопасный с точки зрения профилактики генерализованной системной воспалительной реакции и полиорганной недостаточности в послеоперационном периоде.
РОС^НАЦІІОНАЛЬНАЯ І БИБЛИОТЕКА
Достижения радионуклидной диагностики, позволяющие изучать прижизненную динамику патологического процесса на ранних стадиях его развития, существенно расширили возможности оценки системного воздействия ишемических и реперфузионных повреждений (Flessner M.F., 1991; Perin F., 1996, ШелеховА.В., 1996; Галеев Ю.М., 2001). Многие авторы сообщают о недостаточной специфичности методов исследования бактериальной транслокации, что связано с отсутствием способов получения бактериального радиопрепарата, не содержащего свободного "шТс (Hung J.С. et al, 1996; Nibbering P.H. et al, 1998; Peters A.M., 1998; Corstens F.H. et al, 1999). Открытие особенностей метаболизма клетки в анаэробных условиях (Lloyd J.R. et al., 1997) указывает на новые возможности для нуклидных методов исследования бактериальной транслокации, однако этот факт не получил развития в экспериментальных работах.
Закономерности развития предимунного и иммунного ответов при различных видах повреждения тканей, известные факты о бактериемии и бактериальной транслокации, как одного из триггеров патологического процесса, сообщения о сопряженности бактериальной транслокации с повреждением слизистой оболочки тонкой кишки позволяют считать рассматриваемые патологические процессы взаимосвязанными. Уточнение закономерностей развития ранних реперфузионных повреждений при кратковременной тотальной ишемии (до 1 часа) тонкой кишки, вызванной нарушением магистрального кровотока, определили направленность настоящего исследования.
Цель работы
Изучить в эксперименте проницаемость кишечной стенки для резидентных бактерий при острой кратковременной тотальной ишемии тонкой кишки и на этом основании установить временной интервал прекращения магистрального мезентериального кровотока, определяющий развитие системной воспалительной реакции.
Задачи исследования
-
Разработать экспериментальную модель изучения проницаемости кишечной стенки для Е. coli при ранних ишемических и реперфузионных повреждениях тонкой кишки в условиях острого нарушения магистрального кровотока.
-
Определить морфологические изменения стенки тонкой кишки при окклюзии краниальных брыжеечных сосудов длительностью до 60 минут.
-
Изучить проницаемость кишечной стенки для Е. coli в условиях сохранения магистрального кровотока и при острой обратимой тотальной ишемии тонкой кишки.
-
Установить морфофункциональные корреляции бактериальной транслокации при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов.
-
Оценить роль бактериальной транслокации в развитии системной воспалительной реакции в ответ на ишемическое повреждение тонкой кишки.
Научная новизна
Доказана возможность получения в анаэробных условиях бактериального радиопрепарата с высокой концентрацией "шТс в жизнеспособной клетке.
Установлены точные временные характеристики ранних морф о функциональных изменений, отражающих воздействие острого нарушения магистрального мезентериального кровотока на слизистую оболочку тонкой кишки.
Доказано системное повреждающее действие восстановления магистрального кровотока после 30-минутной тотальной ишемии тонкой кишки, триггером которого является бактериальная транслокация.
Практическая значимость.
Модификация способа приготовления бактериального радиопрепарата позволила получить жизнеспособную культуру Е. coli, пригодную для проведения разноплановых научных исследований in vivo.
Установлен временной интервал прекращения магистрального кровотока в бассейне магистральных брыжеечных сосудов, определяющий необходимость интраоперационной профилактики реперфузионных повреждений.
Доказана инициирующая роль бактериальной транслокации в развитии системного воспалительного ответа, что определяет необходимость интраоперационного системного медикаментозного воздействия на резидентную и патогенную микрофлору тонкой кишки.
Внедрение в практику
Материалы диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность в госпитальной хирургической клинике Иркутского государственного медицинского университета на базе отделения хирургии портальной ги-пертензии Иркутской государственной областной клинической больницы, Республиканского онкологического диспансера г. Абакан (Республика Хакасия), Республиканская больница г. Улан-Удэ (Республика Бурятия), лаборатории радионуклидной диагностики ГУ НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН.
Результаты проведенного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургической клиники ИГМУ, Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН и Медицинского факультета БГУ.
Получена патентная справка (Заявка №2003115590/20 (016533). «Способ приготовления бактериального радиофармпрепарата», приоритет от 30 мая 2003 г).
Основные положения, выносимые на зашиту
-
Острая тотальная ишемия тонкой кишки в течение 20 минут не приводит к нарушению целостности эпителиальной выстилки кишечных ворсин и барьерной функции кишечной стенки в отношении резидентной микрофлоры.
-
Системное повреждающее действие 30-минутной ишемии тонкой кишки проявляется с первой минуты реперфузии массивным поступлением резидентной микрофлоры в системный кровоток, что определяет развитие синдрома системного воспалительного ответа.
Апробация работы
Материалы исследования представлены на Всероссийской конференции хирургов посвященной памяти В.Ф. Войно-Ясенецкого (Красноярск, 23—25 апреля 2003 г.), II регионарной научно-практической конференции молодых ученых (Иркутск, 2003).
Функциональная морфология тонкой кишки
Основной функцией тонкой кишки является переваривание и всасывание пищевых субстратов. Помимо этого она выполняет метаболическую, секреторную, транспортно-эвакуаторную, депонирующую, гормональную и защитную функции. Тонкая кишка состоит из четырех оболочек: слизистой с мышечной пластинкой, подслизистой основы, мышечной и серозной. На поверхности слизистой оболочки расположено множество ворсинок. Ворсинки представлены выпячиваниями собственной пластинки, покрытыми столбчатым эпителием и бокаловидными клетками. Высота ворсинок составляет 795±23 мкм. Ворсинки покрыты однослойным каемчатым эпителием, 90% его -энтероциты с исчерченной (щеточной) ШИК - положительной каемкой образованной микроворсинками. Среди каемчатого эпителия располагаются бокаловидные клетки с тонким основанием и широким дистальным отделом, который почти весь занимает круглая или овальная вакуоль. Глубина крипт составляет 166,48±мкм, отношение их к высоте ворсинок 1:3,5 [1].
В основании крипт расположены единичные трапецивидные клетки с крупными эозинофильными гранулами в апикальной части (клетки Пенета). В клетках Пенета обнаружены цинк, селен, лизоцим, IgA, IgG, что свидетельствует об их бактерицидной функции [108,142,120].
Клетки Пенета выделяют аминокислоты и белково - углеводные комплексы, которые поступают в просвет крипт и обеспечивают «интралюминарное питание» пролиферирующего эпителия. Есть данные о том, / что клетки Пенета «пытаются» компенсировать нарушенную функциюэкзокринной части поджелудочной железы. Эпителиальные клетки, покрывающие участки кишки, занятые лимфоидными узелками (пейеровыми бляшками) заметно отличаются и по строению и по своей функции от других видов энтероцитов, хотя и сохраняют общие для энтероцитов принципы структурной организации. На апикальной поверхности их расположены микроворсинки, но они значительно короче и шире, чем микроворсинки абсорбированных энтероцитов и выглядят они как микрополя, что и определило их название - М - клетки. М - клетки находятся в тесном контакте с инвагинирующими их цитоплазму лимфоцитами, макрофагами и плазматическими клетками» Функция М - клеток - захват и транспорт антигенов из просвета кишки к лимфоидной ткани. При этом макромолекулы проходят через клетки, не подвергаясь в ней деградации и секвестрации. Таким образом, благодаря М - клеткам становится возможной антигенная стимуляция местной иммунной системы тонкой кишки [86,153,112].
Базальная мембрана М - клеток отличается от базальной мембраны энтероцитов ворсинок и крипт значительно большей порозностью. Это способствует пассажу антигенов из просвета кишки в фолликулы и перемещению химических медиаторов из фолликулов в эпителий, а также миграции лимфоцитов [128].
Материалы и методы исследования in vitro
В качестве объекта для маркировки использована Escherichia coli Ощ- энтеропатогенный штамм кишечной палочки. В серии опытов in vitro отработаны условия получения бактериального радиопрепарата. За основу способа получения меченных радионуклидом бактерий был взят способ, описанный А.В. Шелеховым (1998) и модифицированный Ю.М. Галеевым (2001) г. В асептических условиях готовили емкости с твердой питательной средой «кровяной агар» объемом 8 мл и трехкратного посева культуры Escherichia coli на питательную среду, 24 часа культивации в термостате, затем вносили 99тТс пертехнетат из расчета 92,5 МБк на 1 мл среды в 5 мл физиологического раствора и помещали в термостат. Через 24 часа с поверхности питательных сред выполняли трехкратный смыв физиологическим раствором с последующим проведением диализа. Для фракционирования меченых бактериальных клеток и несвязанного полученную бактериально-изотопную смесь диализировали 0,9 % раствором NaCl в объеме 400 мл на гемодиализаторе CRS-12 (Gambro, Германия) со скоростью подачи диализирующего раствора — 50-60 мл/мин на протяжении 75 минут с обязательным радиометрическим контролем содержимого внутреннего и внешнего контуров через каждые 15 мин. Методика выполнена в 8 опытах (группа контроля). В последующем эксперименте условия получения бактериального радиопрепарата были изменены путем изменения аэробной среды на анаэробную, применения простого агара в качестве питательной среды, пятикратного посева культуры Escherichia coli на питательную среду. Модифицированным способом бактериальный радиопрепарат получен в 8 наблюдениях (основная группа).
Вариантная анатомия каудальных и краниальных брыжеечных сосудов лабораторного животного кролика
Первой от абдоминального отдела аорты отходит диафрагмальная артерия, снабжающая кровью диафрагму. Чревная артерия вскоре после своего отхождения от брюшной аорты делится на 3 ветви: желудочную артерию, селезеночную артерию и печеночную артерию.
Дистальнее чревной артерии от передней стенки аорты отходит краниальная брыжеечная артерия, которая отдает ветви к поджелудочной железе и снабжает кровью весь кишечник кролика (п=6). Артерию сопровождает одноименная вена (рисунок 3.1, 3.2).
В процессе изучения анатомии кролика нам удалось выяснить наличие дополнительной каудальной брыжеечной артерии (п=1), кровоснабжающей тонкую кишку. Артерию сопровождает одноименная вена. Для моделирования тотальной ишемии тонкой кишки ее необходимо перевязывать (рисунок 3.2).
Наличие у кролика осевого магистрального кровоснабжения кишечника с редко встречающейся дополнительной каудальной артерией, стало основанием для заключения пригодности данной экспериментальной модели для выполнения задач исследования.
![Значение феномена транслокации бактерий из желудочно-кишечного тракта в патогенезе хирургической инфекции при повреждениях (экспериментально-клиническое исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4601/181815.png "Значение феномена транслокации бактерий из желудочно-кишечного тракта в патогенезе хирургической инфекции при повреждениях (экспериментально-клиническое исследование) [Электронный ресурс] Копылов Вадим Анатольевич")
