Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные аспекты этиологии хирургической инфекции мягких тканей 15
1.1. Клинические особенности течения и видовой состав хирургической инфекции мягких тканей второго уровня 15
1.2. Биологические свойства возбудителей хирургической инфекции мягких тканей 24
1.3. Прогнозирование течения хирургической инфекции мягких тканей 32
1.4. Современные аспекты этиотропной терапии хирургической инфекции мягких тканей 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Общая характеристика обследованных больных 43
2.2. Методы клинико-лабораторного исследования 46
2.3. Методы бактериологического исследования 48
2.4. Методы оценки результатов лечения больных 57
2.5. Методы статистической обработки полученных результатов... 65
Глава 3. Клинико-бактериологическая характеристика инфекционного процесса у больных хирургической инфекцией мягких тканей второго уровня 68
3.1. Клиническая характеристика хирургических инфекций мягких тканей второго уровня 68
3.2. Видовой состав возбудителей хирургической инфекции мягких тканей второго уровня 83
3.2.1. Динамика видового состава возбудителей хирургической инфекции мягких тканей за 1994-2008 гг 83
3.2.2. Сравнительный анализ видового состава возбудителей различных форм хирургической инфекции мягких тканей второго уровня 90
3.3. Характеристика биологических свойств возбудителей хирургической инфекции мягких тканей второго уровня 127
3.4. Биологические свойства микроорганизмов, выделенных в монокультуре и ассоциациях у больных хирургической инфекцией мягких тканей второго уровня и при развитии гнойно- некротических осложнений 156
3.5. Экспериментальное изучение биологических свойств выделенных возбудителей хирургической инфекции 163
3.5.1. Характеристика межмикробных взаимодействий бактерий- ассоциантов, внебольничных и госпитальных микроорганизмов при развитии гнойно-некротических осложнений 163
3.5.2. Суточные ритмы антибиотикорезистентности возбудителей хирургической инфекции мягких тканей второго уровня 168
3.5.3. Регуляция способности микроорганизмов к формированию биопленок 185
Глава 4. Прогнозирование течения хирургической инфекции мягких тканей второго уровня 202
Глава 5. Результаты лечения больных хирургической инфекцией мягких тканей второго уровня 217
5.1. Результаты интраоперационного применения антибиотиков в лечении больных хирургической инфекцией мягких тканей 217
5.2. Клиническая оценка эффективности эмпирической антибактериальной терапии с учетом хронобиологических особенностей антибиотикочувствительности возбудителей 222
5.3. Результаты местного применения эфирного масла эвкалипта в лечении гнойных ран 228
Заключение 235
Выводы 260
Практические рекомендации 263
Указатель литературы
- Биологические свойства возбудителей хирургической инфекции мягких тканей
- Методы клинико-лабораторного исследования
- Видовой состав возбудителей хирургической инфекции мягких тканей второго уровня
- Прогнозирование течения хирургической инфекции мягких тканей второго уровня
Введение к работе
Актуальность проблемы
Хирургические инфекции мягких тканей являются наиболее частой причиной обращения пациентов за медицинской помощью (Савельев В.С. с соавт., 2009). В 5 странах Евросоюза (Франция, Германия, Италия, Испания и Великобритания) инфекции мягких тканей явились причиной около 1,3 миллиона госпитализаций в 2004 году, более половины из них составили поражения подкожной клетчатки – инфекции мягких тканей второго уровня (Pulgar S. et al., 2008). По экспертным оценкам, ежегодно в России эта патология наблюдается примерно у 700 тыс. пациентов (Белобородов В.Б., 2009). Проблемы хирургической инфекции остаются одними из наиболее приоритетных несмотря на внедрение новых высоких технологий в хирургии (Светухин А.М., Амирасланов Ю.А., 2003; Жуков Б.Н., Быстров С.А., 2008). Особенности клинической картины хирургической инфекции на современном этапе проявляются в увеличении числа тяжело протекающих и не поддающихся стандартному лечению осложненных форм гнойно-воспалительных заболеваний, учащении случаев атипичного, «стертого», длительного течения заболевания (Федоров В.Д., Светухин А.М., 2007).
Клинические особенности инфекционного процесса во многом обусловлены биологическими свойствами микроорганизмов, а именно – наличием у них патогенного и персистентного потенциалов (Бухарин О.В., 1999). В последнее десятилетие изучению механизмов выживания бактерий придается особое значение (Брудастов Ю.А. с соавт., 2006; Palmer R.J.Jr., Stoodley P., 2007). Бактериальные инфекции мягких тканей нередко являются полимикробными (Bowler P.G. et al., 2001). Однако характер межмикробных отношений при таких видах хирургической инфекции не изучен, равно как и при изменении видового состава возбудителей вследствие нозокомиального и эндогенного реинфицирования, являющегося одной из основных причин развития гнойно-воспалительных осложнений (Ерюхин И.А. с соавт., 2003).
Прогнозирование тяжелого течения хирургической инфекции, вероятность неблагоприятного исхода традиционно основывается на изменениях, происходящих в макроорганизме (Le Gall J.R. et al., 1993; Vincent J.L. et al., 1996). Однако в таких случаях не учитывается значимость этиологического компонента заболевания. Факторы персистенции микроорганизмов, контролирующие длительность пребывания возбудителя в организме, являются методическим ключом для построения математических моделей прогнозирования течения инфекционного процесса (Бухарин О.В. с соавт., 2009).
Недостаточная эффективность проводимого лечения хирургической инфекции в определенной мере объясняется наличием у микроорганизмов действенных механизмов защиты от внешних повреждающих факторов. Одним из таких механизмов является способность формировать бактериальные биоплёнки (Белобородова Н.В., Байрамов И.Т., 2008). Имеются указания, что до 80% инфекционных заболеваний связаны с образованием этих микробных структур (Сидоренко С.В., 2004). В ряде работ показана роль бактериальных плёнок в развитии инфекционных осложнений у больных стоматологического и урологического профиля (Тец В.В. с соавт., 2004, 2008; Shen Y. et al., 2009), единичные исследования посвящены формированию бактериальных плёнок при экспериментальной раневой инфекции (Davis S.C. et al., 2008; Kirketerp-Moller K. et al., 2008), клинические работы подобного характера отсутствуют. Идея временной организации биосистем получила развитие во многих областях биологии и медицины. Применительно к инфекционной патологии имеются разрозненные данные о хронобиологических особенностях микроорганизмов, их ростовых характеристик (Комаров Ф.И., 2000; Тимохина Т.Х. с соавт., 2007), однако отсутствуют работы по определению чувствительности бактерий к антибиотикам с учетом их хронобиологических особенностей.
Одним из эффективных способов профилактики развития инфекций области операционного вмешательства является периоперационная антибиотикопрофилактика (Манграм А. Дж. с соавт., 2003; Ефименко Н.И. с соавт., 2004), однако вопрос об эффективности интраоперационного введения антибиотиков в комплексном лечении больных хирургической инфекцией остается открытым.
Вышеизложенные моменты и предопределили целевую установку настоящего исследования.
Цель и задачи исследования
Цель исследования – изучить клинико-бактериологические особенности хирургической инфекции мягких тканей второго уровня и разработать подходы к прогнозированию осложнений и улучшению результатов лечения больных.
Для достижения этой цели были решены следующие задачи:
1. Выявить основные тенденции в динамике видового состава возбудителей хирургической инфекции за 1994-2008гг. по материалам результатов бактериологического обследования пациентов г. Оренбурга.
2. Определить видовой состав, антибиотикорезистентность и биологические свойства (плазмокоагулазную, фибринолитическую, гемолитическую активности, антилизоцимную и антикомплементарную активности, способность формирования биопленок) микрофлоры очагов хирургической инфекции мягких тканей второго уровня в динамике заболевания.
3. В экспериментальных условиях изучить характер симбионтных взаимоотношений микроорганизмов при различном течении хирургической инфекции, оценить возможности регуляции формирования биопленок бактериями.
4. Выявить хронобиологические особенности антибиотико- чувствительности возбудителей хирургической инфекции мягких тканей второго уровня, их влияние на эффективность антибактериальной терапии.
5. Установить наиболее информативные клинико-бактериологические показатели для прогнозирования течения хирургической инфекции мягких тканей второго уровня.
6. Оценить эффективность различных подходов к проведению антибактериальной терапии в лечении больных хирургической инфекцией мягких тканей второго уровня.
Научная новизна исследования
Установлено, что динамика видового состава возбудителей хирургической инфекции в 1994-2008 гг. по материалам результатов бактериологического обследования пациентов в г. Оренбурге проявилась в увеличении частоты выделения стафилококков и стрептококков – внебольничных возбудителей хирургической инфекции, а также повышении роли коагулазопозитивных стафилококков и некотором снижении – энтеробактерий. Выявлено увеличение доли метициллинрезистентных стафилококков и энтеробактерий – продуцентов бета-лактамаз расширенного спектра действия.
Выраженность клинических проявлений и характера течения хирургической инфекции мягких тканей второго уровня связаны с особенностями видового состава возбудителей и комплексом их биологических свойств: гемолитической, плазмокоагулазной, фибрино-литической активностей, антибиотикорезистентностью, антилизоцимной и антикомплементарной активностей, способностью формировать биопленки. Установлено, что при некротическом поражении подкожной клетчатки стабильно выделялись гемолитически активные бактериальные патогены, при неотграниченных гнойных процессах – стафилококки, способные к фибринолизу, а при отграниченных формах хирургической инфекции – коагулазоположительные стафилококки без фибринолитической активности. Микроорганизмы, выделенные при длительном течении заболевания, отличались высокими уровнями антилизоцимной активности и способности формировать биопленки. Иницирующая микрофлора, изолированная при осложненном течении хирургической инфекции, характеризовалась высоким уровнем антикомплементарной активности.
Возбудители хирургической инфекции мягких тканей способны формировать биопленки на поверхности участков некроза, фибринозных наслоений, грануляций, что приводит к увеличению длительности заболевания.
Выделены три этиологически значимых типа течения хирургической инфекции мягких тканей: инициированный монокультурой возбудителя, вызванный ассоциацией микроорганизмов и третий – характеризующийся сменой видового состава микрофлоры очага хирургической инфекции в ходе заболевания.
Высокий уровень антилизоцимной активности и способности формировать биопленки у микроорганизмов, выделенных в ассоциациях, по сравнению со штаммами, изолированными в монокультуре, объясняется особенностями симбионтных взаимоотношений бактерий-ассоциантов. Межмикробные взаимоотношения в ассоциациях характеризуются преимущественно стимулирующим эффектом в отношении ростовых характеристик и способности бактерий к инактивации лизоцима и образованию биопленок.
Развитие местных гнойно-некротических осложнений у больных хирургической инфекцией мягких тканей второго уровня в большинстве случаев сопровождается изменением видового состава возбудителей, происходящем в направлении: Streptococcus spp.Staphylococcus spp. Enterobacteriaceae spp. Pseudomonas spp. Такая динамика обусловлена антибиотикочувствительностью внебольничных и антибиотико-резистентностью госпитальных бактерий, подавлением нозокомиальными патогенами внебольничных бактерий (антагонизм, подавление ростовых характеристик и способностей формировать биопленки и инактивировать лизоцим), а также стимуляцией внебольничными штаммами госпитальных микроорганизмов (стимуляция ростовых характеристик, антилизоцимной активности, способности образовывать биопленки).
Выявлены суточные ритмы колебания уровня антибиотико-чувствительности микроорганизмов. Обнаружены «пики» резистентности у чувствительных штаммов и периоды чувствительности – у резистентных. Установлено, что в периоды наименьшей чувствительности преодоление микроорганизмом минимально подавляющей концентрации антибиотика приводит к селекции антибиотикорезистентных клонов бактерий.
Разработан способ прогнозирования развития послеоперационных местных гнойно-некротических осложнений, требующих повторного оперативного вмешательства при хирургической инфекции мягких тканей второго уровня (Патент РФ на изобретение № 2342656).
Интраоперационное применение антибиотиков в комплексном лечении больных хирургической инфекцией мягких тканей второго уровня способствует снижению частоты развития послеоперационных местных гнойно-некротических осложнений и уменьшению длительности послеоперационной антибактериальной терапии, сокращает сроки лечения пациентов. Местное применение эфирного эвкалиптового масла в лечении хирургической инфекции, направленное на подавление формирования биопленок, ускоряет элиминацию возбудителя и появление грануляций в ранах, сокращает сроки лечения больных.
Практическая значимость работы
Полученные в работе данные расширяют патогенетические представления о роли биологических свойств и межмикробных взаимоотношений бактериальных патогенов в течении хирургической инфекции мягких тканей второго уровня.
Практическое значение исследования заключается в разработке способа прогнозирования осложненного течения флегмон (Патент РФ на изобретение № 2342656), основанного на учете показателей, отражающих состояние пациента, патогенных и персистентных свойств возбудителя, а также интраоперационного применения антибиотиков и местного использования эвкалиптового масла в комплексном лечении больных хирургической инфекцией мягких тканей второго уровня. Предложенные способы могут быть использованы в работе хирургических отделений в качестве дополнительных диагностического и лечебных приемов.
Положения, выносимые на защиту
-
Разнообразие клинических форм хирургической инфекции мягких тканей второго уровня связано с особенностями видового состава возбудителей и их биологических свойств (патогенного и персистентного потенциалов, включая антибиотикорезистентность и формирование микробных биопленок).
-
Изменение видового состава микрофлоры очагов хирургической инфекции мягких тканей второго уровня при развитии местных гнойно-некротических осложнений в течение заболевания происходла в направлении: Streptococcus spp. Staphylococcus spp. Enterobacteriaceae spp. Pseudomonas spp., что было обусловлено антибиотикочувствительностью внебольничных и антибиотикорезистентностью госпитальных бактерий, антагонизмом госпитальных патогенов в отношении внебольничных штаммов с подавлением их ростовых характеристик, антилизоцимной активности и формированием биопленок с одновременной стимуляцией указанных признаков госпитальных микроорганизмов внебольничными штаммами.
-
Комплекс информативных клинических и бактериологических показателей при хирургической инфекции мягких тканей позволяет прогнозировать развитие послеоперационных гнойно-некротических осложнений.
-
Проведение интраоперационной антибактериальной терапии, подавление формирования микробных биопленок в очаге хирургической инфекции повышает эффективность этиотропной терапии хирургической инфекции мягких тканей второго уровня.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: IV, V и VII научно- практических конференциях врачей Приволжско-Уральского военного округа «Актуальные вопросы военной и практической медицины» (Оренбург, 2003, 2004, 2006); международном хирургическом конгрессе «Актуальные проблемы современной хирургии» (Москва, 2003); III, IV и V научно-практических конференциях «Внутрибольничные инфекции в стационарах различного профиля, профилактика, лечение осложнений» (Москва, 2005, 2006, 2007); V Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006); IX Международном конгрессе МАКМАХ/BSAC по антимикробной терапии (Москва, 2007); IX областной научно-практической конференции «Перспективы развития службы анестезиологии и реаниматологии Оренбургской области» (Оренбург, 2007); X Международном конгрессе МАКМАХ/ ESCMD по антимикробной терапии (Москва, 2008); VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ВБИ» (Оренбург, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 44 работы, из них 10 статей в рецензируемых журналах. Получен Патент РФ на изобретение №2342656 «Способ прогнозирования осложненного течения флегмон» (Бюл. №36, 27.12.2008).
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 172 отечественных и 148 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 41 таблицей и 42 рисунками, выписками из 8 историй болезни.
Биологические свойства возбудителей хирургической инфекции мягких тканей
Устойчивость паразитарных систем, позволяющая патогенам персистировать как в отдельно взятом макроорганизме, так и в пределах одной или нескольких популяций хозяина, очень, велика, о чем свидетельствует многовековой опыт борьбы с инфекционными болезнями. Иерархическая организация паразитарных систем во многом обеспечивает устойчивость последних к внешним и внутренним воздействиям (Литвин В.Ю., 1986). Данный принцип подразумевает наличие трех уровней организации паразитарных систем: организменныи, биоценотический и биостроматический. При этом существенно, что функционирование паразитарных систем на каждом уровне организации подчиняется собственным закономерностям. Причина этого - качественная трансформация процессов в паразитарной системе в ходе интеграции от уровня к уровню (Литвин В.Ю., 1986). Усложнение структурно-функциональной организации на разных иерархических уровнях приводит к тому, что устойчивость паразитарных систем возрастает от низших уровней к высшим. И если задача ликвидации элементарной паразитарной системы, как проявление отдельного заболевания, вполне реальна (излечение организма), то ликвидировать систему биоценотического уровня (т.е. заболеваемость в регионе) гораздо труднее, а ликвидация заболеваемости в мировом масштабе вообще проблематична.
Гибкость паразитарных систем в структурном отношении обеспечивается экологической пластичностью паразита, его способностью к использованию разных хозяев. Гетерогенность популяций хозяина и паразита - важнейшая движущая сила эпидемического процесса, которая является одним из решающих условий существования надорганизменных паразитарных систем (Беляков В.Д., 1983). Гетерогенность популяции паразита обеспечивает наиболее полную его адаптацию к различным и меняющимся в ходе взаимодействий условиям в организме отдельных хозяев, а также, в ряде случаев, к абиотическим условиям внешней среды. При снижении численности или даже исчезновении одной из частей популяций возбудителя другая ее часть сохраняется, поддерживая существование паразитарной системы.
Резервация паразита обеспечивает сохранение паразитарной системы в условиях, когда активная циркуляция возбудителя по каким-то причинам затруднена или временно исключена. Подобные неблагоприятные периоды паразит способен переживать в различных «средах резервации» - как в отдельных особях хозяев, так и в объектах внешней среды, которые являются источником нозокомиальной инфекции. Многочисленность хозяев и полигостальность паразита обеспечивает устойчивость паразитарных систем за счет интенсивной циркуляции возбудителя в условиях высокой численности и разнообразия хозяев. Неоднозначная зависимость паразита от хозяев наиболее выражена в открытых паразитарных системах. В таких случаях факторы, внешние по отношению к паразитарной системе, могут прямо или косвенно влиять на ее устойчивость. Паразитирующие микроорганизмы сталкиваются с проблемами выживания в адаптивно меняющейся среде хозяина, где они паразитируют и где хозяин контролирует инфекцию. Эти ответные реакции в виде воспаления, фагоцитоза, антительного ответа хозяина и есть препятствия для патогена, который для выживания в клетке должен совершенствовать свои тактические приемы, уклоняясь или преодолевая эти барьеры. Паразитирующие патогены научились справляться с ответной (защитной) реакцией хозяина.
Наиболее уязвимой мишенью у патогена для защитных сил хозяина является пептидогликан. Поэтому любые адаптационные процессы, направленные на защиту (или изоляцию) пептидогликановой структуры клеточной стенки, следует рассматривать в качестве механизмов персистенции бактерий (Бухарин О.В., 1990, 1994). С целью выживания в организме бактериальная клетка стремится защитить, либо сбросить свой пептидогликан, используя для этого ряд приемов: «маскировку» (механическая защита путем экранирования клеточной стенки и антигенная мимикрия - схожесть детерминант паразита и хозяина), «потерю» (образование L-форм бактерий), «атаку» (секреция факторов иммуносупрессии). В зависимости от вида патогена механизмы его персистирования различны (Прозоровский СВ., 1994; Бухарин О.В., 1994). Однако подавляющее большинство бактериальных патогенов продуцируют секретируемые факторы деградации защиты хозяина либо уклоняются от нее, обеспечивая себе персистирование в организме.
Среди многообразия известных секретируемых факторов персистенции: антилизоцимной активности (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., 1982), способности микроорганизмов инактивировать бактерицидный компонент препарата лейкоцитарного интерферона человека (Бухарин О.В., Соколов В.Ю., 1988), антииммуноглобулиновой активности (Михайлова Е.А. с соавт., 1990), антикомплементарной активности (Брудастов Ю.А., 1990), антигистоновой активности (Соколов В.Ю.,1993) и др., хотелось обратить особое внимание на антилизоцимный признак бактерий. Антилизоцимный признак микроорганизмов необходим бактериям для преодоления лизоцима макроорганизма в целях занятия и освоения новой экологической ниши. Новая среда обитания способствовала селекции штаммов с антилизоцимной активностью. Штаммы без этого признака элиминировались из организма и, естественно, не могли персистировать.
Лизоцим - один из самых первых факторов неспецифической противоинфекционной резистентности организма, который проникает в очаг повреждения уже в первые минуты агрессии, обеспечивая своим присутствием комплекс ранних мероприятий по защите макроорганизма от бактериальных патогенов (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990; Кочнев О.С. с соавт., 1993). Антилизоцимный признак был выявлен у стафилококков (Усвяцов Б.Я., 1986; Чернова О.Л., 1989; Дерябин Д.Г., 1989), кишечных палочек (Зыкова Л.С., 1986), протеев (Керашева СИ., Илинская Б.В., 1987), клебсиелл (Яблочков А.Л., 1989), составляющих значительную часть спектра возбудителей хирургической инфекции.
Методы клинико-лабораторного исследования
Тяжесть состояния обследованных больных (удовлетворительное, средней тяжести, тяжелое) определялось с учетом жалоб больного, основных гемодинамических показателей (артериальное давление; частота, наполнение и напряжение пульса на магистральных артериях), наличия или отсутствия одышки, изменения температуры тела, уровня лейкоцитов периферической крови, нейтрофильного сдвига лейкоформулы и значения лейкоцитарного индекса интоксикации, наличия признаков печеночной и почечной недостаточности (Кабанов А.Н. с соавт., 1993), локализации и величины очага хирургической инфекции.
Методы лабораторного исследования включали в себя: определение общего анализа крови (подсчет количества форменных элементов крови: эритроцитов, лейкоцитов, лейкоформулы; определение содержания гемоглобина, скорости оседания эритроцитов, гематокрита); уровня глюкозы, общего белка и белковых фракций, мочевины, креатинина в венозной крови; общего анализа мочи (Мельников В.В. с соавт., 1987).
Тяжесть состояния больных также оценивали с использованием шкал SOFA, характеризующую степень функциональных органно-системных расстройств (Vincent J.L. et al., 1996), и SAPS-II, в основе которой лежит суммарный учёт клинико-лабораторных параметров, преморбидного фона и возраста больных; (be Gall J.R . et al., .1993). Расчеты производили с: использованием автоматизированных программ в режиме on-line: http://wvvw.criticare.cliat.ru/s-003 .html (SOFA); http://www.criticare.chat.ru/s-002.html (SAPS-II). Ретроспективная.оценка динамики видового состава внебольничных.и госпитальных возбудителей хирургической инфекции в 1994-2008 гг. проведена по результатам бактериологических исследований, проведенных в , бактериологической лаборатории 1-й муниципальной городской клинической больницы скорой помощи города Оренбурга у 4869 больных хирургической-инфекцией мягких тканей, и у 2183 пациентов, повторно; , прооперированных по поводу гнойно-воспалительных осложнений;
У выделенных чистых культур микроорганизмов изучали их морфологию при окраске мазков по Граму, проводилось определение плазмокоагулазы по Дараньи, фибринолитической активности и лецитиназы по Чистовичу Г.Н. (Биргер О.М., 1982). Гемолитические свойства выделенных штаммов оценивались на 5% кровяном агаре по просветлению среды вокруг колоний. Для определения видовой принадлежности микроорганизмов использовали диагностические биохимические тест-системы MikroLaTest ("Lachema", Чехия). Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли методами диффузии в агар с использованием стандартных индикаторных дисков т стандартных разведений- в агаре (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указаниям МУК 4.2. 1890-04., 2004). В - работе было использовано 22 антибиотика: бензилпенициллин, ампициллин, оксациллин, карбенициллин, цефалексин, цефотаксим, цефтриаксощ цефепим, имипенем, меропенем, гентамицин, азитромицин; кларитромицин, линкомицин, фузидин Na, рифампицин, ванкомицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, амикацин, тобрамицин (НИЦФ; Санкт-Петербург).
Детекцию продукции бета-лактамаз оценивали по чувствительности к бензилпенициллину. Наличие пенициллинсвязывающего белка 2а (ПСБ2а) определяли по чувствительности к оксациллину, используя, диски, содержащие 1 мкг антибиотика. На основании этого стафилококки подразделялись- на метициллин (оксациллин) чувствительные (MS) и метициллинрезистентные (MR). Продукцию бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) выявляли скрининговым методом (определением чувствительности к двум цефалоспориновым антибиотикам третьего поколения: цефотаксиму и цефтриаксону) и подтверждали методом «двух дисков» (double-disk approximation test) по наличию вокруг диска с цефалоспорином III поколения (цефтриаксон) зоны подавления роста микроорганизма, «вытянутой» в сторону диска, содержащего аммоксициллин/клавуланат при расстоянии 30 мм между центрами дисков, (Сидоренко СВ., 2001;-Эйделынтейн М.В., 2001; Скала Л.З. с соавт., 2004).
Для количественной характеристики антибиотикорезистентности штаммов анализируемых групп использовался показатель «маркер-резистентности» (MP), предложенный Бондаренко В.М. с соавт. (1990) для энтеробактерий. Маркер резистентности представляет собой отношение числа детерминант резистентности ко всем используемым в исследовании антибиотикам к числу испытанных штаммов.
Суточные ритмьг антибиотикочувствительности микроорганизмов определяли у 15 штаммов Staphylococcus aureus, 10 штаммов коагулазонегативных стафилококков (S. epidermidis, S. haemolyticus,. S. capitis, S. warneri, S. xylosus), 15 штаммов энтеробактерий-(Escherichia coli, Providencia spp., Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae), 8 штаммах неферментирующих грамотрицательных бактерий (Pseudomonas aeruginosa). В эксперименте in vitro использовались 12-часовые (время, максимальной пролиферативной активности) агаровые культуры = микроорганизмов:» Определение минимальной подавляющей концентрации: (МІЖ) антибиотиков проводили с использованием метода серийных разведений в агаре в течение суток с 3-часовым интервалом. При определении МІЖ оксациллина (Оксациллин-АОКС, ОАО «Синтез», Россия) использовали концентрации от 0,125 до 16 мкг/мл, цефтриаксона -от 4 до 64 мкг/мл, меропенема (меропенем, АстраЗенека ЮК Лимитед, Великобритания) — от 2 до 32 мкг/мл, ципрофлоксацина (ципрофлоксацин, ПРОМЕД ЭКСПОРТС ПВТ, ЛТД, Индия), - от 0,25 до 16 мкг/мл.
Антилизоцимную активность микроорганизмов определяли по методике Бухарина О.В. (1999) фотометрическим методом. Бактериальную массу исследуемых культур засевали в 3 мл питательного бульона и культивировали в термостате при температуре 37С в течение 24 часов. Затем на спектрофотометре измеряли оптическую плотность бульонной культуры против питательного бульона. Супернатант отделяли от бактериальных клеток центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. В качестве тест-штамма использовали суточную агаровую культуру Micrococcus luteus АТСС 15307. Выросшие бактериальные клетки тест-штамма убивали хлороформом-в течение 60 минут, смывали, фильтровали через крупнопористый фильтр, отмывали 1/15 М фосфатным буфером (рН=6,2), после чего доводили оптическую плотность суспензии микрококка до 0,300. Раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл готовили на 1/15 М фосфатном буфере. Супернатант исследуемых культур микроорганизмов объемом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 минут при температуре 37С. Затем 0,5 мл смеси супернатанта и лизоцима добавляли к 2,0 мл суспензии тест-штаммаг микрококка и измеряли оптическую плотность полученной смеси через 30 с и 150 с на спектрофотометре против 1/15 М фосфатного буфера. В качестве контроля использовали смесь питательного бульона с лизоцимом в соотношении 9:1.
Видовой состав возбудителей хирургической инфекции мягких тканей второго уровня
За всю историю изучения проблемы хирургической инфекции с использованием бактериологических методов можно выделить несколько этапов, характеризующихся доминированием определенных групп возбудителей или появлением новьж. Первый этап, «стрептококковый», после широкого внедрения в медицинскую практику стрептоцида и других препаратов, сменился следующим, отличительной особенностью которого стало распространение в качестве основных возбудителей стафилококков и прежде всего золотистого. Во второй половине XX века, когда широкое распространение получили не только бета-лактамные антибиотики, но и антибактериальные препараты других групп, стало очевидным расширение спектра возбудителей хирургической инфекции за счет энтеробактерий, отчасти энтерококков, и, наконец, неферментирующих, бактерий. Представляется важным выявление динамики видового состава возбудителей хирургической инфекции не только в мировом масштабе, но и на местном уровне за ограниченные временные промежутки..
По результатам исследований, выполненных в бактериологической лаборатории 1-й муниципальной городской клинической больницы скорой помощи города Оренбурга у 4869 больных хирургической инфекцией мягких тканей, госпитализированных в стационар, произведена оценка динамики видового состава внебольничных возбудителей хирургической инфекции мягких тканей за 1994-2008 гг. (рисунок 1). Всего из очагов ХИМТ при первичных операциях изолировано 6783 штамма микроорганизмов. Основными возбудителями хирургической инфекции за анализируемый период являлись коагулазопозитивные стафилококки, преимущественно золотистый стафилококк (от 40% до 51,1%). После 2000 года отмечается некоторое увеличение доли коагулазонегативных стафилококков (с 3% до 14%), которые чаще выделялись в ассоциации с другими возбудителями -золотистым стафилококком, стрептококками, энтеробактериями. Доля стрептококков до 2001 года была невелика - от 8% до 11%, однако в последующем частота выделения этой группы возбудителей увеличилась до 14,6-16%. Частота встречаемости энтеробактерий была максимальной до 2001 года (от 42% до 35%). В дальнейшем представители этого семейства составляли только 14-16% спектра возбудителей. Низкая частота выделения энтерококков — от 3,2%о до 5,7% (практически всегда в ассоциации с другими возбудителями) не позволяет оценивать их как значимых внебольничных возбудителей хирургической инфекции.
Частота выделения неферментирующих бактерий была на протяжении всего анализируемого периода ниже 1%. Эти бактерии были изолированы исключительно у больных раневой инфекцией, занимавшихся самолечением или несистематически обращавшихся за амбулаторной помощью.
Анализ показателей заражаемости внебольничными возбудителями хирургической инфекции мягких тканей показал, что за весь период 1994-2008гг. коагулазопозитивные стафилококки (преимущественно золотистый стафилококк) являлись основными возбудителями (рисунок 2). Энтеробактерии были основными бактериальными патогенами в период 1994-1998 гг. В другие временные промежутки представители этого семейства встречались менее чем у 50% пациентов, что позволяет отнести энтеробактерии к категории дополнительных возбудителей.
Псевдомонады, энтерококки и стрептококки являлись случайными возбудителями, т.к. были выделены менее чем у 25% больных. Однако это не умаляет этиологической значимости стрептококков при определенных нозологических формах (например, при осложненных формах рожистого воспаления) показатель заражаемости которыми увеличился с 9,5% до 18%.
Оценка динамики видового состава госпитальных возбудителей хирургической инфекции в 1994-2008 гг. проведена по результатам бактериологических исследований, проведенных у 2183 пациентов. Эти больные были повторно прооперированны по поводу гнойно-воспалительных осложнений, развившихся после плановых и экстренных операций, а также по поводу гнойно-некротических осложнений, появившихся в ходе лечения различных форм хирургической инфекции. При развившихся гнойных осложнениях из очагов хирургической инфекции изолирован 4376 штаммов микроорганизмов (рисунок 3).
Pseudomonas aeraginosa (от 8 до 12 %). Энтерококки наиболее часто встречались в 1996г. и 1997 г. (23% и 25% соответственно). В последующем их доля уменьшалась и за последние пять лет (2003-2008 гг.) не превышала 12,8%. Следует отметить, что энтерококки практически никогда не были изолированы в монокультуре, а являлись ассоциантами других микроорганизмов. Достаточно высокая частота выделения энтеробактерий в 1994-1998 гг. (от 42,9% до 29,7%) в последующем уменьшилась, но составляла около четветри всего спектра нозокомиальных микроорганизмов (рисунок 3). Низкая частота выделения стрептококков (от 6,2% до 3,9%) за весь анализируемый период указывает на невысокое значение этой группы патогенов как возбудителей госпитальной хирургической инфекции мягких тканей. Аналогичная ситуация прослеживается при анализе частоты выявления коагулазоотрицательных стафилококков, которая составляла от 3% до 7%. Показатель частоты выделения коагулазоположительных стафилококков (преимущественно золотистого) демонстрировал значительные колебания во времени - около 22% в 1994-1995 гг., дальнейшее значительное снижение до 15% в 1996-1997 гг. и последующее увеличение. С 2004 г. коагулазопозитивные стафилококки стабильно составляли не менее 40 % спектра нозокомиальных патогенов .
При анализе показателей заражаемости госпитальными возбудителями хирургической инфекции мягких тканей (рисунок 4) выявлены определенные особенности. На протяжении всего периода 1994-2008 гг. наблюдалась тенденция к снижению показателя заражаемости энтеробактериями с 75% до 51%. Однако то, что энтеробактерий были выделены не менее чем у 50 % больных во всех временных промежутках, указывает на их важную роль основных нозокомиальных возбудителей. Коагулазопозитивные стафилококки (преимущественно золотистый стафилококк) в период 1994-1998 гг. являлись добавочными возбудителями (были выделены у 43% пациентов). В дальнейшем роль этой группы патогенов возросла до статуса основного возбудителя. Показатели заражаемости других групп микроорганизмов не превышали пороговые 25% случайных возбудителей. Однако стоит отметить, что неферментирующие бактерии, показатель заражаемости которыми составлял 15-12%, более чем в 2/3 случаев были изолированы в монокультуре, что указывает на их немаловажное значение как нозокомиальных патогенов.
При анализе антибиотикорезистентности внебольничных возбудителей хирургической инфекции, выделенных с 1994г. по 2008г. выявлено повышение маркера резистентности (MP) стафилококков с 2,3±0,1 до 2,7±0,1 (р 0,05), стрептококков - с 2,1 ±0,1 до 2,9±0,1 (р 0,05), энтерококков - с 2,4±0,1 до 3,1±0,1, энтеробактерий - с 3,3±0,1 до 4,1±0,1 (р 0,05) и псевдомонад - с 4,2±0,2 до 4,7±0Д. Увеличилось количество штаммов, устойчивых к 3 и более используемым в стационаре антибиотикам различных групп с 28,2% в 1994г. до 42,9% в 2008г. Обращает внимание выявление в 2004-2005 гг. внебольничных метициллинрезистентных стафилококков (12% и 25% соответственно) с дальнейшим увеличением частоты их выделения до 46% в 2008г., а также увеличение доли энтеробактерий (с 6% в 2003г. до 20% в 2008г.), продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра действия.
Основные изменения антибиотикорезистентности нозокомиальных возбудителей, выделенных с 1994г. по 2008г., заключались в повышении уровня резистентности стафилококков к оксациллину (с 28% до 62%) и гентамицину (с 16% до 36%). Резистентность госпитальных энтеробактерий, связанная с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра, за 2005-2008 гг. увеличилась с 13% до 28%. Отмечено повышение маркера резистентности (MP) стафилококков с 2,4±0,1 до 3,0±0,1 (р 0,05), стрептококков - с 2,4±0 2 до 2,9±0,2, энтерококков - с 2,8±0,1 до 3,3±0,1, энтеробактерий - с 3,7±0,1 до 4,6±0,1 (р 0,05) и псевдомонад - с 4,8±0,1 до 4,9±0Д. Практически все госпитальные псевдомонады были полиантибиотикорезистентны.
Прогнозирование течения хирургической инфекции мягких тканей второго уровня
Раннее прогнозирование характера течения заболевания позволяет своевременно предпринять определенные мероприятия по предупреждению неблагоприятных осложнений, и, следовательно, улучшить качество лечения пациентов, уменьшить длительность пребывания их в стационаре и материальные затраты на лечение. В клинической практике для ранней диагностики или прогнозирования осложнений на фоне основного патологического процесса и формирования реконвалесцентного бактерионосительства нашло применение определение персистентных характеристик микроорганизмов (Бухарин О.В., 1999). Ряд современных исследователей (Зак В.И., Швецов С.А., 1990; Брудастов Ю.А., 1992; Швецов С.А., 1994; Дерябин Д.Г. с соавт., 1996; Дерябин Д.Г., 1997; Курлаев П.П., 2000, Абрамзон О.М., 2002) указывают на возможность использования факторов персистенции для прогнозирования неблагоприятного течения заболевания при некоторых видах хирургической инфекции. Другие авторы прогнозировали течение инфекционного процесса по определению степени интоксикации у больных (Петров В.В. с соавт., 1993) или факторов естественной противоинфекционной резистентности пациентов (Кочнев О.С. с соавт., 1993; Слесаренко С.С. с соавт., 1994). В настоящей работе проведена попытка прогнозирования течения хирургической инфекции мягких тканей второго уровня на основании интеграции показателей, отражающих состояние макроорганизма с одной стороны и факторов патогенности микроорганизма с другой. Признаки, изучаемые при идентификации патологических состояний, обладают той или иной степенью специфичности. При этом, очевидно, диагностическая ценность этих признаков будет различной. С целью более объективной и стандартизированной оценки признаков для прогнозирования патологических состояний может быть предложен вероятностно-статистический подход. Математический анализ признаков значительно повышает полноту использования диагностической информации, а анализ комплексов показателей не только суммирует дифференцирующие способности признаков, но и выявляет новые дополнительные возможности распознавания, не содержащиеся ни в одном отдельном признаке (ГенесВ.С, 1967).
Малочувствительным к отсутствию отдельных признаков и сравнительно экономичным является метод последовательного анализа Вальда А. (1960), требующий примерно на 30 - 50% меньше наблюдений, чем любой метод, основанный на фиксированном количестве наблюдений. Метод Вальда близок к вероятностным методам, лежащим в основе алгоритмов, используемых для машинной диагностики, именно на нем основывается методика неоднородной последовательной процедуры. Неоднородная последовательная процедура не требует использования сложных приемов многомерной статистики, пригодна при любой форме распределения данных, легко реализуется с помощью табличных методов вычислительной диагностики, допускает пропуски в обследовании объекта, как в группе составления, так и при испытании. Ограничением применения метода является то, что он не использует информацию о связи признаков (ГублерЕ.В.,1970).
В данной работе сделана попытка применения неоднородной последовательной процедуры распознавания патологических состояний для прогнозирования течения хирургической инфекции мягких тканей второго уровня, а именно - местных гнойно-некротических осложнений, требующего повторного оперативного вмешательства.
Методика неоднородной последовательной процедуры распознавания включала в себя: подготовку перечня признаков; накопление наблюдений с достоверной верификацией диагноза осложнения; распределение частот признаков для дифференцируемых групп; определение отношения вычисленных из частот вероятностей, с которыми признак наблюдался у разделяемых групп; вычисление диагностических коэффициентов; вычисление информативности признаков; распределение признаков в порядке убывания их информативности; выбор пороговых значений суммы диагностических коэффициентов; проверку слепым методом полученной диагностической таблицы на случайной выборке и вынесение решения о принадлежности или непринадлежности пациента к той или иной группе.
Для составления диагностической таблицы была сформирована группа обследуемых из 125 человек. Все обследуемые были разделены на две подгруппы: подгруппу В, в которую вошли пациенты с осложнением (38) и подгруппу А — без осложнения (87).
Для вычисления информативности всего признака суммировали информативность его диапазонов. При выборе диагностических порогов, учитывая, что при высокой скоррелированности процент ошибок может быть выше намеченного уровня, остановились на диагностических порогах "-30" и "+30", при которых вероятность допустимой ошибки составляет 0,1% (Гублер Е.В., 1970). Положительной стороной данных порогов является то, что при них диагностическое решение более достоверно, но, с другой стороны, имеющейся информации может не хватить для принятия одного из решений о принадлежности обследуемого к той или иной группе. С этих позиций представляется целесообразным сократить разрыв между верхним и нижним порогами, однако подобный шаг может понизить достоверность диагностического решения.
Группу проверки диагностической таблицы составляли из обследуемых аналогичной выборки и для каждого обследуемого определяли возможность причисления к группе А или В. Накопление диагностической информации о каждом обследуемом производили исходя из того, что наиболее быстрый ответ и наименьшее количество ошибок отмечается, когда процедура неоднородного распознавания начинается с признаков, обладающих наибольшей информативностью, наиболее связанных с типом группы, подлежащей распознаванию и, вероятно, отражающих различные стороны взаимодействия макроорганизма и микроорганизма.
