Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1 ИММУННЫЙ ОТВЕТ 14
Иммунологические факторы 14
Молодой возраст 15
АВО несовместимость 16
HLA несовместимость 16
1.2 ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ПОЛУЛУННЫХ КЛАПАНОВ СЕРДЦА.
19
Развитие и морфология створок аортального клапана 19
Структурно-функциональные свойства аортального клапана 21
Стратегии и основные достижения тканевой инженерии 23
Тканевая инженерия клапанов на основе биологических матриц 26
Тканевая инженерия клапанов на основе синтетических матриц 30
Дальнейшие перспективы 33
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 37
2.1. Оценка жизнеспособной алло- и девитализированной ксено- и
аллоткани в системном кровотоке на модели крупного
животного 37
Методика получения и обработки биоматериала 37
Экспериментальная модель и техника операции 45
2.2. Методы исследования тканей 47
2.2.1 Микроскопический анализ 47
Анализ жизнеспособности тканей до и после имплантации 48
Измерение кальция в образцах 49
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 50
3.1. Результаты изучения биоматериала на модели собаки 50
3.1.1. Результаты операции по имплантации заплаты с моностворкой в дефект
грудной аорты собаки 50
3.1.2. Результаты исследования влияния криосохранения и девитализирующей
обработки на ксено- и аллоткань 51
3.1.3. Результаты исследования эксплантированного через 4 месяца
биоматериала 55
Результаты макроскопического исследования 55
Результаты микроскопического исследования 57
Результаты измерения содержания связанного кальция в биоматериале
через 4 месяца после имплантации 67
3.2. Обсуяедение полученных результатов 68
3.2.1 Обоснование выбора экспериментальной модели 68
3.2.2. Обсуждение результатов, полученных при изучении влияния
девитализирующей антикальцинозной обработки дигитонином и ЭДТА на
ткань 72
3.2.3. Обсуждение результатов полученных после оценки эксплантированной
через 4 месяца девитализированной алло- и ксеноткани и жизнеспособной
аллоткани 82
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 90
ВЫВОДЫ 92
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
АК - аортальный клапан.
ВПС - врожденный порок сердца.
ГА - глютаровый альдегид.
ГАГ - гликозаминогликаны.
ГМК - гладкомышечные клетки.
ДМСО - диметилсульфоксид.
ИБС - ишемическая болезнь сердца.
ИТЭБ - институт теоретической и экспериментальной биофизики.
ИК - искусственное кровообращение.
ММА - Московская Медицинская Академия.
МОК - минутный объем кровообращения.
ОБА - общая бедренная артерия.
СИ - сердечный индекс.
ТИ - тканевая инженерия.
ЭБ - этидиум бромид.
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусный альдегид.
ЭПР - эндоплазматический ретикулум.
HLA - главный комплекс гистосовместимости человека.
PERV - свиной эндогенный ретровирус.
PGA - полигликолиевая кислота.
PHAs - полигидрокси алканоаты.
Р4НВ - поли-4-гидроксибутират.
РНО - полигидроксиоктаноат.
PLA - полимолочная кислота.
PLGA - кополимер PGA и PLA.
SIS - подслизистый слой тонкого кишечника.
Введение к работе
Наиболее общим подходом в лечении пороков клапанов сердца на конечном этапе заболевания является их замена. В США в год выполняется более 60000 операций протезирования клапанов сердца и более 170000 - в мире (164). Кроме того, каждый год в США примерно 15000 детей рождается с врожденными пороками сердца, у многих из них поражен один или более клапанов сердца (120). Протезирование клапанов сердца эффективно предотвращает прогрессирование сердечной недостаточности, но имеет множество недостатков. В настоящее время существуют три основных типа заменителей клапанов сердца: механические клапаны, биопротезы (ксеногенная ткань фиксированная, например, глютаровым альдегидом (ГА)) и аллографты -клапаны, полученные от человеческих доноров (120). Каждый из этих клапанов имеет ограничения и специфические недостатки. Использование механических протезов ассоциировано с риском тромбоэмболических и геморрагических осложнений и требует пожизненной антикоагулянтной терапии. Эти клапаны так же не имеют устойчивости к инфекции, с которой чрезвычайно сложно справиться без удаления протеза (72). Биопротезы, фиксированные ГА, не требуют антикоагулянтной терапии, но они гораздо менее долговечны (82). Криосохраненные аллографты, так же не требуют антикоагулянтной терапии, однако они содержат жизнеспособные клетки и могут, таким образом, вызывать развитие иммунного ответа (120). Ни один вид доступных протезов клапанов сердца не имеет способности к росту, что особенно важно для детей (120).
Учитывая недостатки существующих протезов клапанов сердца, усилия многих исследователей направлены на создание жизнеспособного неиммуногенного клапана сердца при помощи методов тканевой инженерии. Идеальный клапан, по мнению Harken (73), не должен создавать обструкции кровотоку, быть нетромбогенным, устойчивым к инфекции, химически
инертным, атравматичным для клеток крови, долговечным, и легко имплантируемым (73).
Есть два основных подхода к созданию биоинженерных тканей, которые используются последнее время. При первом используются бесклеточные ксеногенные или аллогенные клапаны с последующим засеванием или с ожидаемой репопуляцией клетками хозяина после имплантации. Рядом авторов в эксперименте показана целесообразность такого подхода.
Второй подход заключается в создании полимерной основы в форме
клапана сердца, с последующей трасплантациеи на нее аутологичных клеток
(177). После прикрепления, клетки формируют собственный
экстрацеллюлярный матрикс. Теоретически, таким образом можно получить жизнеспособный аутологичный клапан, который может быть имплантирован пациенту, у которого исходно были получены клетки (177). Такой клапан может иметь потенциал к росту, самообновлению, быть устойчивым к инфекции и нетромбогенным. Пионерами этого направления являются Mayer и коллеги. В своих исследованиях они использовали смешанную клеточную культуру эндотелиальных клеток и миофибробластов, полученную из артерии овцы.
Большой прогресс достигнут в тканевой инженерии (ТИ) клапанов сердца, но многое еще предстоит сделать. Однако, оптимальная обработка, не повреждающая соединительную ткань биологического матрикса, целесообразность заселения матрикса, его дизайн, источник клеток для заселения, in-vitro условия и многие другие направления продолжают активно исследоваться. Конечной целью должно явиться создание аутологичного самообновляющегося клапана способного противостоять гемодинамическому воздействию системной циркуляции.
В России впервые по инициативе В.И.Бураковского криосохраненные жизнеспособные аллогенные клапаны стали применяться в НЦССХ
им.А.Н.Бакулева РАМН. В 1990 году В.П. Подзолков и в 1992 году Г.И. Цукерман выполнили первые успешные операции по имплантации этих протезов при хирургической коррекции сложных врожденных и приобретенных пороков сердца. До настоящего времени НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН сохраняет приоритет в этом направлении кардиохирургии. За истекшее время была отработана принципиальная технологическая схема, созданы условия для производства криосохраненных аллографтов и первый в России банк криосохраненных аллографтов.
В 1992 - 2003 гг. в клинике ППС НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН было имплантировано 80 жизнеспособных криосохраненных аллографтов, в том числе 70 - при коррекции аортального порока, главным образом при инфекционном эндокардите (в том числе произведено 12 операций аутолегочного протезирования аортального клапана с имплантацией легочного аллографта (операций Росса)), 10 митральных аллографтов имплантировано в трикуспидальную позицию больным с эндокардитом трехстворчатого клапана.
Послеоперационная оценка функции аллографта основывалась на ультразвуковых методах, магнитно-резонансной томографии и клинических методах обследования. Пациенты повторно обследовались в различные сроки после операции. Срок первого обращения находился в пределах от 6 месяцев до 3 лет. Наибольший срок наблюдения превышает 10 лет. Данные обследования выявили адекватную функцию пересаженных аллографтов у большинства взрослых пациентов (6-11,18-20).
В России ТИ клапанов сердца все еще находится на начальных этапах развития. Однако в НЦССХ РАМН им.А.Н.Бакулева последние годы ведутся исследования в этом направлении. В ходе нашей совместной работы с ИТЭБ РАН разработана оригинальная девитализирующая антикальцинозная обработка биотканей для снижения иммунного ответа и кальциноза. Методика исследовалась на модели крысы с имплантацией девитализированной ткани под
кожу на 2 месяца. Степень дегенерации биоматериала оценивалась по уровню кальциноза ткани после эксплантации. Была установлена высокая эффективность нашей методики в плане предотвращения кальциноза. (1-5,13). Основываясь на экспериментальных данных с 2004 года начато клиническое применение девитализированных аллографтов для реконструкции выводного отдела правого желудочка при операции Росса и для протезирования аортального клапана при различных видах его патологии (16). Накопленный клинический материал на данном этапе не позволяет выявить значимых различий между жизнеспособными и девитализированными аллографтами (15,17). В связи, с чем было решено провести сравнительную оценку криосохраненных жизнеспособных и девитализированных аллографтов в хроническом эксперименте на модели крупного животного с имплантацией биоматериала в кровоток. Учитывая труднодоступность аллографтов и ограниченное количество протезов маленького диаметра, так же решено было исследовать в эксперименте клапаны ксеногенного происхождения девитализированные по нашей методике.
Цель и задачи работы. Основной целью работы является экспериментальная оценка различных видов клапанных трансплантатов и обоснование возможности их использования в сердечно-сосудистой хирургии.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Оценить влияние процесса криоконсервации и стерилизации на жизнеспособность аллографта и на состояние его соединительнотканного матрикса.
Изучить характер изменений, происходящих с клетками и соединительнотканным матриксом алло- и ксеноматериала, в результате девитализирующей обработки.
8 L
Провести сравнительный макро- и микроскопический анализ изменений, происходящих в имплантатах из девитализированной аллогенной и жизнеспособной аллогенной тканей, через 4 месяца после имплантации.
Выявить особенности адаптации девитализированной ксеногенной ткани в сравнении с жизнеспособным алломатериалом при имплантации в системный кровоток.
Научная новизна исследования.
Настоящее исследование отражает один из этапов работы, проводимой совместно НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН и ИТЭБ РАН по разработке новых образцов биологических клапанов для кардиохирургии.
Научная новизна работы заключается в исследовании принципиально нового, не имеющего мировых аналогов, вида обработки биологических материалов. В работе впервые определены основные закономерности морфологических изменений девитализированных дигитонином и ЭДТА ксено-и аллогенных сосудистых тканей на модели собаки с имплантацией биоматериала в системный кровоток сроком на 4 месяца. По результатам хронического эксперимента выявлены благоприятные характеристики девитализированной аллоткани, позволяющие надеяться на ее успешное клиническое применение. Выявлены критические параметры обработки, в будущем требующие модификации и усовершенствования.
Разработана хирургическая модель для оценки биологических тканей в системном кровотоке без использования искусственного кровообращения и предложен вариант ее усовершенствования.
Практическая ценность.
В результате комплекса научно-поисковых работ определены направления дальнейших исследований, которые в будущем позволят создать аутологичный жизнеспособный заместитель клапанов сердца и сосудов.
Оценка полученных экспериментальных данных показала, что в имплантированной в кровоток собакам жизнеспособной аллогенной ткани происходили изменения, сходные, с таковыми в ткани аллографтов, имплантированных человеку. На основании этого можно предположить, что модель собаки позволит более точно прогнозировать судьбу тканей при имплантации человеку. Сравнительная оценка эксплантированных через 4 месяца тканей показала, что девитализированная аллогенная ткань является наиболее перспективной с точки зрения отсутствия развития иммунного ответа и сохранения структурной целостности имплантата. Все это позволяет надеяться на успешное клиническое применение данного вида биоматериала.
Положения, выносимые на защиту.
Девитализированная дигитонином и ЭДТА аллогенная ткань по результатам экспериментального исследования обладает хорошими пластическими качествами. В организме реципиента она оставалась полностью инертной и не подвергалась дегенеративным изменениям в сроки до 4-х месяцев, вследствие отсутствия кальциноза и иммунной реакции.
Девитализация ткани ксеногенного происхождения при помощи дигитонина и ЭДТА приводила к структурной дегенерации из-за развития выраженной иммунной реакции.
Криосохраненная жизнеспособная аллогенная ткань обладает удовлетворительными качествами при имплантации в кровоток. Однако выявленные признаки умеренной структурной дегенерации и иммунного ответа могут привести к последующему развитию дисфункции аллографта в отдаленные сроки.
Работа была выполнена в отделении неотложной хирургии приобретенных пороков сердца (руководитель - проф., д. м. н. Р. М. Муратов), совместно с лабораторией по экспериментальной разработке новых биоматериалов для сердечно-сосудистой хирургии (руководитель - д.м.н. Д.В.Бритиков), в отделе моделирования и изучения патологии сердца и сосудов с оперблоком и виварием (руководитель - проф.д.м.н. М.В. Соколов). Совместные исследования по клеточной инженерии проводились на базе лаборатории тканевой инженерии (руководитель - проф.д.ф.-м.н. B.C. Акатов) Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Совместные исследования по гистологической оценки проводились совместно с лабораторией патоморфологии (руководитель - проф. д.б.н А.Б.Шехтер) ММА им. И.М.Сеченова.
Автор выражает глубокую благодарность директору Научного центра сердечно - сосудистой хирургии, академику РАМН Л. А. Бокерия за предоставленную возможность выполнения работы и общее руководство исследованиями, руководителю отделения неотложной хирургии приобретенных пороков сердца профессору д. м. н. Р. М. Муратову, за постоянную помощь в работе над диссертацией, а так же руководителю лаборатории по экспериментальной разработке новых биоматериалов для сердечно-сосудистой хирургии д.м.н Д.В.Бритикову, руководителю лаборатории тканевой инженерии ИТЭБ РАН профессору д.ф.-м.н. B.C. Акатову, ведущему научному сотруднику лаборатории патоморфологии ММА им. И.М.Сеченова к.б.н. З.П.Миловановой и сотрудникам отдела моделирования и изучения патологии сердца и сосудов с оперблоком и виварием Н.И.Лившиц и Т.К.Шурим за постоянную помощь и активное участие в проведении работы.
Автор также выражает глубокую благодарность всем сотрудникам НЦССХ РАМН, принявшим участие в проведении исследований.
