Молекулярно-генетические основы развития предрасположенности к артериальным тромбозам [Электронный ресурс] Сироткина, Ольга Васильевна

Содержание к диссертации

Введение

1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 13

1.1. Гемостаз и тромбоз 13

1.2. Наследственные тромбофилии 19

1.3. Генетические детерминанты, определяющие состояние тромбофилии...20

1.3.1. Ген фактора V свертывания крови 20

1.3.2. Ген протромбина 22

1.3.3. Ген Р-фибриногена 23

1.3.4. Ген ингибитора активатора плазминогена типа 1 25

1.3.5. Ген Ша субъединицы рецептора тромбоцитов Ilb/IIIa 27

1.3.6. Ген метилентетрагидрофолат редуктазы 30

1.3.7. Ген фактора VII свертывания крови 36

1.4. Патогенез ишемического инсульта и инфаркта миокарда 38

2. Материалы и методы 41

2.1. Характеристика обследуемых групп 41

2.2. Методы исследования 43

2.2.1. Выделение ДНК из периферической крови человека 43

2.2.2. Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ 45

2.2.3. Определение биохимических показателей плазмы крови 54

2.3. Статистическая обработка результатов исследования 59

3. Результаты исследования 60

3.1. Контрольная группа 60

3.1.1. Распределение аллельных вариантов генов, определяющих склонность к тромбофилии, в контрольной группе 60

3.1.2. Анализ биохимических показателей в контрольной группе 61

3.2. Группа пациентов, перенесших ишемический инсульт .64

3.2.1. Анализ частотных распределений мутаций и полиморфизмов изучаемых генов у пациентов, перенесших ишемический инсульт 64

3.2.2. Анализ результатов биохимического исследования в группе пациентов, перенесших ИИ 65

3.2.3. Кооперативный вклад генетических и приобретенных факторов в риск развития ИИ 76

3.2.4. Анализ аллельного распределения генов, определяющих склонность к тромбофильным состояниям, у пациентов в зависимости от семейной истории сердечно-сосудистых заболеваний 80

3.2.5. Распределение частот аллелей анализируемых генов в зависимости от количества перенесенных ИИ 82

3.2.6. Ген-генные взаимодействия в группе пациентов с ИИ 83

3.3. Группа пациентов, перенесших инфаркт миокарда в молодом возрасте.85

3.3.1. Анализ частотных распределений мутаций и полиморфизмов изучаемых генов у пациентов, перенесших ИМ в молодом возрасте 85

3.3.2. Анализ биохимических показателей в группе пациентов, перенесших ИМ 86

3.3:3. Анализ аллельных распределений исследуемых генов в зависимости от семейной истории сердечно-сосудистых заболеваний 89

3.3.4. Приобретенные факторы риска и развитие инфаркта миокарда в молодом возрасте 91

3.3.5. Анализ кооперативного вклада генетических и приобретенных факторов риска в развитие ИМ у мужчин молодого возраста 94

3.3.6. Распределение аллелей исследуемых генов у пациентов, перенесших несколько инфарктов миокарда 102

3.3.7. Ген-генные взаимодействия в группе пациентов с ИМ 103

4. Обсуждение 105

Выводы 121

Список литературы 123

• Ген фактора V свертывания крови
• Распределение аллельных вариантов генов, определяющих склонность к тромбофилии, в контрольной группе
• Анализ частотных распределений мутаций и полиморфизмов изучаемых генов у пациентов, перенесших ИМ в молодом возрасте
• Распределение аллелей исследуемых генов у пациентов, перенесших несколько инфарктов миокарда

Введение к работе

В последние десятилетия достигнуты впечатляющие успехи в области молекулярной генетики человека, позволившие от формального описания законов наследования перейти к полной расшифровке человеческого генома. Понимание механизмов генетического контроля протекающих в организме метаболических процессов меняет представления об этиологии и молекулярных основах патогенеза как моногенных наследственных заболеваний, так и состояний, определяющих предрасположенность к широко распространенным полигенным или мультифакториальным болезням, а также может объяснить различную чувствительность индивидуумов к неблагоприятным факторам внешней среды, инфекционным агентам и фармакологическим препаратам. Таким образом, молекулярная генетика создает базис для разработки нетрадиционных методов лечения, профилактики заболеваний и индивидуальной, генетически обоснованной фармакотерапии.

Одной из актуальных проблем современного здравоохранения является выяснение молекулярно-генетических основ развития сердечнососудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной летальности населения промыщленно развитых стран мира. В США на ССЗ приходится 42% всех случаев смерти. Из них на ишемическую болезнь сердца приходится 51%, 27% - на сердечную недостаточность, 16% - на ишемический инсульт мозга, 6% - на другие сердечно-сосудистые заболевания (Преображенский Д.В. и соавт., 2002). По данным рабочей группы ВОЗ (1997 г.), Россия по смертности от ишемической болезни сердца и инсульта занимает одно из первых мест в Европе. Следует отметить, что в нашей стране наблюдается преобладание церебрального инсульта над острым инфарктом миокарда (Скоромец А.А., 1997). С момента создания технологий выделения индивидуальных генов из различных биологических объектов, ведутся исследования по определению

структурной организации генов, определяющих функционирование метаболических циклов, нарушения в которых приводят к развитию сердечно-сосудистой патологии. В первую очередь это гены, продукты которых либо вовлечены в липидный гомеостаз, либо оперируют в системе свертывания крови, или влияют на физиологию стенки сосудов.

В основе развития инфаркта миокарда и ишемического инсульта головного мозга лежат два процесса - атеросклероз и тромбоз соответствующих артерий. При этом следует обратить внимание на тот факт, что атеросклеротические изменения сосудов характерны для лиц пожилого возраста, у молодых пациентов больший вклад в формирование патологии вносят нарушения в системе коагуляции, приводящие к повышенному тромбообразованию. Анализ эпидемиологических исследований показывает, что повышение уровня ряда факторов свертывания крови, таких как фибриноген, фактор VII свертывания крови, фактор Виллебранда, фактор VIII, увеличение агрегационных свойств тромбоцитов, изменение содержания в крови компонентов фибринолитической системы являются факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, включая инфаркт миокарда и ишемический инсульт (Folsom A.R., 2001; Баркаган З.С., 1996; Руксин ВВ., 1998). Данные изменения в плазменном и тромбоцитарном звеньях гемостаза генетически детерминируются. Однако вклад мутационных повреждений генов, кодирующих факторы свертывания крови, тромбоцитарные рецепторы и компоненты системы фибринолиза, в увеличение риска развития артериальных тромбозов к настоящему времени однозначно не определен. Результаты работ, посвященных этому вопросу, носят противоречивый характер и сильно зависят от этнических, половых и возрастных особенностей исследуемых популяций (Simmonds R.E. et al, 2001; Hassan A., Markus H.S., 2000).

Известно, что инфаркт миокарда и ишемический инсульт являются полигенными заболеваниями, приобретенными факторами риска которых

выступают курение, избыточный вес, нарушения липидного обмена, артериальная гипертензия, стрессы (Мартынов Ю.С., 1988; Скопина Е.И., 2001; Оганов Р.Г., 1992; Погосова F.B., 2002). Логично предположить, что взаимодействие между различными факторами риска, включая генетические детерминанты, обусловливающие склонность к тромбофилии, будут играть ведущую роль в генезе данных заболеваний. Вопрос о том, какие именно взаимодействия приобретенных и генетических факторов, а также ген-генные сочетания, определяют предрасположенность к развитию артериального тромбоза, особенности течения и возможные рецидивы болезни, остается открытым.

Все вышесказанное явилось основой для проведения настоящего исследования.

Цель исследования:

Целью данного исследования явилось определение молекулярно-генетических основ развития предрасположенности к артериальным тромбозам церебрального и коронарного русла и выявление взаимодействий между приобретенными и генетическими факторами, которые повышают риск формирования данной патологии.

Задачи исследования:

1. Определить частоты встречаемости аллельных вариантов генов F5, F7, FGB, F2, GP Ilia, MTHFR, PAI-1 у здоровых мужчин молодого возраста (до 45 лет).

2. Определить частоты встречаемости вышеперечисленных генов среди мужчин, перенесших ишемический инсульт в молодом возрасте.

3. Определить частоты встречаемости вышеперечисленных генов среди мужчин, перенесших инфаркт миокарда в молодом возрасте.

4. Оценить влияние изучаемых генотипов на показатели гемостаза в исследуемых группах.

5. Определить уровень общего гомоцистеина плазмы крови у мужчин, перенесших ишемический инсульт в молодом возрасте и оценить зависимость уровня общего гомоцистеина плазмы крови от аллельных вариантов гена метилентетрагидрофолат редуктазы и приобретенных факторов риска развития артериальных тромбозов.

6. Определить вклад межгенных взаимодействий и взаимодействий приобретенных и генетических факторов риска в развитие предрасположенности к артериальным тромбозам церебрального и коронарного русла.

Научная новизна полученных результатов.

1. Впервые дана оценка распределения аллельных вариантов генов F5, F7, FGB, F2, GP Ша, MTHFR, PAI-1 среди мужчин г. Санкт-Петербурга, перенесших ишемический инсульт или инфаркт миокарда в возрасте до 45 лет. Впервые показано протективное действие инсерционного промоторного полиморфизма гена фактора VII свертывания крови в отношении развития ишемического инсульта у мужчин молодого возраста.

2. Подтвержден вклад PI*² аллеля гена GP Ша в риск развития инфаркта миокарда у мужчин молодого возраста.

3. Установлено, что к развитию ИИ или ИМ у пациентов с семейной историей сердечно-сосудистых заболеваний и без нее предрасполагают различные генетические нарушения. Впервые показано, что лейденская мутация гена фактора V свертывания крови повышает риск развития артериальных тромбозов у мужчин в отсутствии семейной истории сердечно-сосудистых заболеваний.

Впервые в российской популяции проведен анализ зависимости показателей гемостаза от генетических детерминант, определяющих склонность к развитию ишемического инсульта и инфаркта миокарда. Показано, что функциональная активность тромбоцитов повышена у носителей Р1 аллеля гена GP Ша, уровень фибриногена плазмы крови повышается при наличии у индивидуума А аллеля гена Р-фибриногена или 4G аллеля гена ингибитора активатора плазминогена типа 1. Впервые в российской популяции проанализирован уровень общего гомоцистеина у мужчин, перенесших ишемический инсульт, и определена зависимость уровня общего гомоцистеина от генотипа С677Т MTHFR у названных пациентов. Впервые установлено, что Т677 аллель гена MTHFR ассоциируется с повышенным риском развития ишемического инсульта у лиц с семейной историей сердечно-сосудистых заболеваний.

Впервые проанализировано взаимодействие между приобретенными факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и генетическими детерминантами, определяющими склонность к тромбофилии, у лиц мужского пола г. Санкт-Петербурга. Показан кооперативный эффект курения и F V Leiden или P1^A1 GP Ша, десятикратно повышающий риск развития инфаркта миокарда. Установлено, что сочетание F V Leiden и нарушения обмена липидов увеличивает риск развития артериальных тромбозов церебрального и коронарного русла.

Впервые в мировой практике проведен анализ межгенных взаимодействий семи вышеуказанных детерминант у пациентов, перенесших ишемический инсульт или инфаркт миокарда, и оценен вклад сочетанных генотипов в риск развития артериальных тромбозов различной локализации. Показано, что риск развития ишемического инсульта и инфаркта миокарда возрастает при сочетанном носительстве

_plAi/A2 _{Gp ПІа и C677T MTH}FR или P1^A1/A2 GP Ilia и A1/A2 5'F7, кроме того в риск развития ишемического инсульта вносят вклад неблагоприятные сочетания А1/А2 5'F7 и С677Т MTHFR, а в риск развития инфаркта миокарда - Р1^А,/А2 GP Ша и 4G/5G PAI-1 или С677Т MTHFRh4G/5GPAI-1.

Практическая значимость работы.

На основании полученных результатов показана целесообразность определения наличия генетических детерминант, обусловливающих склонность к повышенному тромбообразованию, в первую очередь pi^A1/A2 полиморфизма гена GP Ша и лейденской мутации гена фактора V, у курящих мужчин с целью профилактики развития инфаркта миокарда.

Для определения группы высокого риска развития ишемического инсульта и инфаркта миокарда у мужчин с нарушениями обмена липидов рекомендовано определение лейденской мутации гена фактора V.

Для определения группы высокого риска развития ишемического инсульта среди лиц, имеющих отягощенный семейный анамнез по этому заболеванию, рекомендовано определение мутации С677Т MTHFR. Это даст возможность проводить генетически обоснованную фармакотерапию повышенными дозами фолиевой кислоты и витаминами Вб и В^ с целью предотвращения повышения уровня общего гомоцистеина плазмы крови.

С целью профилактики развития инфаркта миокарда в молодом возрасте необходимо раннее выявление лиц мужского пола, являющихся носителями pi^A1/A2 полиморфизма гена GP Ша. Это имеет большое практическое значение, так как лица с различными генотипами PI GP Ша могут обладать различной чувствительностью к антиагрегантной терапии аспирином.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Инсерционный промоторный полиморфизм гена фактора VII свертывания крови (А1/А2 5'F7) встречается достоверно реже среди пациентов мужского пола, перенесших ишемический инсульт в возрасте до 45 лет, по сравнению с контрольной группой. Данный полиморфизм является протективным в отношении развития церебрального артериального тромбоза и его отсутствие повышает риск развития ишемического инсульта.

2. Полиморфизм Р1^А1/А2 _Гена GP Ша является фактором риска развития инфаркта миокарда у мужчин в возрасте до 45 лет. Риск развития инфаркта миокарда у носителей данного полиморфизма значительно возрастает при сочетании с курением.

3. Лейденская мутация фактора V свертывания крови вносит вклад в риск развития артериального тромбоза в церебральном и коронарном русле при взаимодействии с нарушениями обмена липидов.

Апробация работы.

Результаты работы были доложены на V Всероссийской конференции "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения" (Москва, Россия, 2000), на конференции, посвященной 100-летию Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, Россия, 2000), на юбилейной конференции СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова "100-лет кафедре факультетской терапии им. акад. Г.Ф. Ланга, важнейшие достижения и верность традициям!" (Санкт-Петербург, Россия, 2000), на VI Всероссийской конференции "Атеротромбоз и артериальная гипертензия" (Москва, Россия, 2001), на 10-ом Международном конгрессе по генетике человека (Вена, Австрия, 2001), на 10-ой научно-практической конференции неврологов "Нейроиммунология" (Санкт-Петербург, Россия, 2001), на научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом

здравоохранении" в рамках Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, Россия, 2002), на 17-ом Международном конгрессе по тромбозам (Болонья, Италия, 2002). По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц, иллюстрирована 17 рисунками и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 224 научных источника (25 - на русском языке и 199 - на иностранном).

Ген фактора V свертывания крови

У 40-60% пациентов с диагносцированным тромбозом наблюдается резистентность к активированному протеину С (АПС-резистентность), которая проявляется отсутствием ингибиторного эффекта при добавлении активированного протеина С в плазму больного. В норме активированный протеин С расщепляет активный фактор V в трех позициях - Arg506, Arg306 и Arg679, а также инактивирует фактор Villa (Dahlback В. et al, 1993, Dahlback В., 1995, Hooper W.C., Evatt B.L., 1998). В основе АПС-резистентности лежит точечная мутация - замена G на А в 1691 нуклеотидной позиции гена фактора V свертывания крови, названная лейденской (F V Leiden) (Bertina R.M. et al, 1994). Результатом лейденской мутации является замена аргинина на глутамин в 506 положении аминокислотной последовательности белка, что нарушает сайт расщепления фактора V активированным протеином С. Таким образом не происходит регулирования образования тромбина по принципу обратной связи. Частота встречаемости данной мутации в европейской популяции колеблется от 2% до 7%, однако крайне редка в странах Азии и Африки (Rees D.C. et al, 1995). У пациентов с тромбозом глубоких вен частота F V Leiden достигает 20%, относительный риск развития заболевания у гетерозиготных носителей возрастает в 7 раз, а у гомозиготных - в 80 раз (Rosendaal F.R. et al, 1995). Данные о влиянии лейденской мутации фактора V свертывания крови на развитие артериальных тромбозов носят противоречивый характер. Так, ряд исследователей говорят о повышенном риске развития инфаркта миокарда у носителей F V Leiden, тогда как другие отрицают влияние этого мутационного повреждения на формирование коронарного тромбоза (Boekholdt S.M. et al, 2001). F V Leiden чаще встречается у пациентов, перенесших инфаркт миокарда в пожилом возрасте (Marz W. et al, 1995; Baranovskaya S. et al, 1998). Неоднозначное мнение сложилось и о вкладе лейденской мутации в развитие ишемического инсульта. Частота F V Leiden варьирует у больных, перенесших инсульт, в зависимости от возраста, пола, критериев отбора в исследуемую группу (Ridker P.M. et al, 1995; Margaglione M. et al, 1999; Gunther G. et al, 2000; Madonna P. et al, 2002). В 1998 году были описаны еще две мутации фактора V - F V Cambridge и F V Hong Kong. Данные мутации приводят к замене аргинина в 306 положении на треонин или глицин. Их частота встречаемости мала и вклад в развитие АПС-Р невелик, но следует учитывать тот факт, что полная инактивация фактора Va возможна только при разрезании его АПС по всем трем сайтам (Williamson D. et al, 1998; Chan W.P. et al, 1998). Мутационным повреждением фактора V объясняется примерно 95% случаев АПС-резистентности. Состояния АПС-Р могут быть также связаны с повышенным уровнем в крови фактора VIII, антифосфолипидными антителами, приемом оральных контрацептивов, беременностью (Dahlback В., 1997; Hooper W.C., Evatt B.L., 1998). Кроме того ковалентное соединение гомоцистеина с активным фактором V является одной из причин АПС-Р при гипергомоцистеинемии (Undas A. et al, 2001). На антикоагулянтную активность протеина С влияет уровень фосфолипидных компонентов плазмы крови - дефицит этих компонентов снижает антикоагулянтные свойства комплекса АПС-протеин S и может служить фактором риска развития тромбозов (Deguchi Н. et al, 2001).

Ген протромбина. Тромбин, являясь основным ферментом коагуляционного каскада, не только превращает фибриноген в фибрин, но и активирует факторы V, VIII, XI и XIII, а также тромбоциты. Логично, что высокий уровень в крови предшественника тромбина - протромбина будет служить фактором риска тромбозов. При изучении пациентов с семейной историей тромбофилии непонятного генеза была обнаружена замена G на А в 20210 позиции 3 -нетранслируемого региона гена протромбина (F2). У гетерозиготных носителей этого полиморфизма было отмечено повышение уровеня протромбина на 50% (Poort S.R. et al, 1996). Мутация G/A 20210 локализована в области эндонуклеазного разрезания пре-мРНК и полиаденилирования. В 2001 году Gehring et al показали, что данная замена ведет к накоплению мРНК и увеличению синтеза белка (Gehring N.H. et al, 2001). F2 G20210A редко встречается в популяции (1-4%), но частота встречаемости полиморфизма среди больных с венозными тромбозами достигает 20% (Rosendaal F.R. et al, 1998; Leroyer С. et al, 1998). Риск развития тромботических осложнений особенно растет при сочетании F2 G20210A с F V Leiden, а у женщин - при приеме оральных контрацептивов (Martinelli I. et al, 1999). Кроме того, у пациентов с комбинацией лейденской мутации и мутации в гене протромбина тромбозы развиваются в более молодом возрасте и имеют атипичную локализацию (Ehrenforth S. et al, 1999). В отличии от венозных тромбозов, вклад F2 G20210A в риск развития тромбозов артериальных варьирует в различных исследованиях. Мета-анализ для инфаркта миокарда показал очень противоречивые данные, особенно в группе больных до 55 лет - OR колебался от 0.76 до 2.48 (Boekholdt S.M. et al, 2001). Аналогичные результаты получены и в отношении развития тромботического ишемического инсульта. Только De Stefano V. получил подтверждение взаимосвязи между полиморфизмом протромбина и риском цереброваскулярных заболеваний у молодых пациентов, причем гетерозиготное состояние увеличивало риск церебральной ишемии в 3.8 раза, а гомозиготное - в 208 раз (De Stefano V. et al, 1998), остальные исследователи не нашли подобной ассоциации (Longstreth W.T. et al, 1998; Ferraresi P. et al, 1997; Ridker P.M. et al, 1999). He обнаружено увеличение риска развития ишемического инсульта у новорожденных с сочетанием F2 G20210A и других генетических нарушений, тогда как асфиксия, сепсис, диабет у матери играли роль ведущих пусковых факторов (Gunther G. et al, 2000).

Распределение аллельных вариантов генов, определяющих склонность к тромбофилии, в контрольной группе

Для анализа частот мутационных повреждений генов фактора V свертывания крови, протромбина, Р-фибриногена, фактора VII свертывания крови, PAI-1, рецептора тромбоцитов ІІЬ/ІПа и MTHFR (F V Leiden, F2 G/A 20210, G/A -455FGB, 4G/5G PAI-1, P1A,/A2 GP Ша, C677T MTHFR, A1/A2 5 F7) в контрольной группе нами было проведено генотипирование вышеперечисленных детерминант у 199 здоровых мужчин. Распределение генотипов, а также частоты мутантных аллелей в группе контроля приведены в таблице 3.

Распределение генотипов исследуемых мутаций и полиморфизмов находится в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга.

Не было выявлено ни одного носителя FV Leiden и 20210G/A F2 в гомозиготном состоянии.

Частоты полиморфных аллелей генов факторов свертывания крови V и VII, GP Ша, MTHFR и PAI-1 в контрольной группе здоровых мужчин не отличаются от таковых в популяции г. Санкт-Петербурга (Шейдина A.M., 2000; Волкова М.В., 2000). Частоты -455А-аллеля гена р-фибриногена и 20210А-аллеля гена протромбина в данной контрольной группе меньше, чем в популяции: 24.1% и 27.9% (р=0.06), 0.3% и 2.7% (р=0.01), соответственно (Schwartz E.I. et al., 1999).

У лиц контрольной группы был определен уровень фибриногена плазмы крови (ФГ, г/л), антиген фактора Виллебранда (VWF Ag,%) и максимальная скорость агрегации тромбоцитов (Vmax, %/сек). Результаты представлены в таблице 4.

Чтобы определить зависимость данных фенотипических признаков от генетических и внешних факторов анализировали: 1)уровень ФГ при различных генотипах FGB и PAI-1, а также в зависимости от курения, нарушения липидного обмена, индекса массы тела (ИМТ, кг/м2) и семейной истории ИМ; 2)максимальную скорость агрегации тромбоцитов при разных генотипах GP ІПа, в зависимости от курения, нарушения липидного обмена, индекса массы тела (ИМТ, кг/м2) и семейной истории ИМ; 3)антиген фактора Виллебранда, как маркер повреждения эндотелия, при генотипах MTHFR и в зависимости от курения, нарушения липидного обмена, индекса массы тела (ИМТ, кг/м2) и семейной истории ИМ. Результаты приведены в таблице 5. Уровень фибриногена плазмы крови в контрольной группе был выше у лиц с семейной историей сердечно-сосудистых заболеваний, с 4G4G генотипом PAI-1 и избыточным весом. Максимальная скорость агрегации тромбоцитов была больше у мужчин с нарушением обмена липидов. У носителей ТТ генотипа MTHFR наблюдалась тенденция к повышению антигена фактора Виллебранда.

Группа пациентов, перенесших ишемический инсульт. 3.2.1. Анализ частотных распределений мутаций и полиморфизмов изучаемых генов у пациентов, перенесших ишемический инсульт.

При генотипировании FVLeiden, 20210G/A F2, А1/А2 5 F7, G/A-455FGB, Р1А1/А2 GP Ilia, 4G/5G PAI-1 и C677T MTHFR у пациентов с ИИ были получены следующие результаты (Таблица 6). Частоты аллелей вышеперечисленных генов не отличались в ИИ группе и в контроле, за исключением А1/А2 5 F7. Мутация фактора VII свертывания крови была детектирована у пациентов только в гетерозиготном состоянии. Инсерционный аллель гена фактора VII свертывания крови встречался у ИИ больных реже, чем в контрольной группе - 7.7% и 13.6%, различия были статистически достоверны (р 0.05). Носительство данной мутации уменьшало риск острого ишемического инсульта вдвое - OR=0.52 (СІ 95% 0.29-0.94), соответственно отсутствие А2 аллеля увеличивало риск развития ИИ у мужчин молодого возраста - OR=1.91 (СІ 95% 1.06-3.43).

Среди ИИ больных не было найдено ни одного носителя лейденской мутации фактора V и Pl полиморфизма гена GP Ша в гомозиготном состоянии. Кроме того, ни у кого из обследуемых не был обнаружен 20210G/A полиморфизм гена протромбина.

Анализ частотных распределений мутаций и полиморфизмов изучаемых генов у пациентов, перенесших ИМ в молодом возрасте

При генотипировании FVLeiden, 20210G/A F2, А1/А2 5 F7, G/A-455FGB, Р1А1/А2 GP Ша, 4G/5G PAI-1 и С677Т MTHFR в группе пациентов, перенесших ИМ, были получены следующие результаты (Таблица 16).

- по сравнению с контрольной группой

В группе больных частота РҐ -аллеля была достоверно выше по сравнению с контролем, относительный риск развития ИМ у носителей данного аллеля возрастал вдвое - OR= 1.94(С195% 1.34-2.79).

Частоты аллелей других генов не отличались у пациентов с ИМ и здоровых мужчин. 3.3.2. Анализ биохимических показателей в группе пациентов, перенесших ИМ.

У ИМ пациентов определяли уровень фибриногена плазмы крови (ФГ, г/л), антиген к фактору Виллебранда (VWF Ag, %) и максимальную скорость агрегации тромбоцитов (Vmax, %/сек) (Таблица 17).

Как видно из приведенных результатов, ни один из исследуемых биохимических параметров не отличался в общей группе ИМ пациентов от показателей у здоровых мужчин (Таблица 4, Таблица 17). Так же, как и в контрольной группе, у пациентов проанализировали ФГ, VWF Ag и Vmax при различных генетических и приобретенных факторах риска развития ИМ. Результаты данного сравнительного анализа приведены в таблице 18.

Уровень фибриногена у пациентов зависел от генотипа Р-фибриногена и был достоверно выше у носителей А-аллеля по сравнению с больными, имеющими дикий генотип, и лицами контрольной группы с А-аллелем.

Пациенты, перенесшие ИМ, с pi генотипом GP Ша показывали статистически значимое увеличение максимальной скорости агрегации тромбоцитов по сравнению с носителями Р1А1А1 или Р1А генотипа.

Содержание в крови антигена фактора Виллебранда повышалось у курящих пациентов, а также у лиц с семейной историей ИМ. Чтобы найти взаимосвязь между высоким уровнем фибриногена в крови, аллельным вариантом гена FGB и развитием инфаркта миокарда, были выделены подгруппы с ФГ 4г/л - 49 человек, перенесших ИМ, и 39 человек контрольной группы. Результаты отражены в таблице 19.

Частота мутантного А-аллеля у пациентов по сравнению с контролем была достоверно выше - 30.6% и 16.3%, соответственно (р=0.001). Также выше была частота А-аллеля у пациентов с ФГ 4г/л по сравнению с группой больных, имеющих уровень фибриногена в пределах нормы - 30.6% и 22.1%, соответственно, но различия не были статистически достоверны (р=0.06). Носительство РОВ-455А-аллеля увеличивало риск развития ИМ у лиц с уровнем фибриногена больше 4г/л в три раза - OR=3.12 (СІ 95% 1.47-6.65). 3.3.3. Анализ аллельных распределений исследуемых генов в зависимости от семейной истории сердечно-сосудистых заболеваний.

Пациенты, перенесшие ИМ, имели положительный семейный анамнез по сердечно-сосудистым заболеванием чаще, чем здоровые индивидуумы, составившие контрольную группу (Таблица 2), и различие было статистически достоверным (р=0.0001). Относительный риск развития ИМ у пациентов с семейной историей ССЗ составил OR=2.23 (СІ 95% 1.64-3.03). Сравнение частотных распределений анализируемых генов показало, что у больных с отягощенной наследственностью и без нее превалируют различные генетические детерминанты (Таблица 20).

Распределение аллелей исследуемых генов у пациентов, перенесших несколько инфарктов миокарда

Было проанализировано распределение генотипов и частот аллелей изучаемых генов у 135 (65.2%) больных с одним ИМ и среди 72 (34.8%) пациентов, перенесших более одного ИМ. Частоты лейденской мутации фактора V, G/A 20210 F2, Р1А1/А2 GP Ша, 4G/5G PAI-1, С677Т MTHFR и инсерции 10 п.н. в промоторной области гена фактора VII не различались в зависимости от количества перенесенных ИМ.

В группе перенесших несколько ИМ наблюдалась тенденция к увеличению частоты А-аллеля гена Р-фибриногена по сравнению с контролем (р=0.1) и по сравнению с перенесшими один ИМ (р=0.07). Частота А-аллеля в контроле, в группе с одним ИМ и с несколькими ИМ составила 24.1%, 22.6% и 29.9%, соответственно. Причем количество гомозигот АА было достоверно больше среди пациентов, перенесших больше одного ИМ, чем среди больных с одним ИМ - 8 человек из 72 (11.1%) и 4 человека из 135 (3.0%)(р=0.02).

В группе пациентов с ИМ было достоверно больше лиц, имеющих одновременно и Р1 2 аллель GP Ша, и Т аллель MTHFR, чем в контрольной группе - 32 (15.5%) и 12 человек (6.4%), соответственно (р=0.003). Относительный риск развития ИМ при сочетанном генотипе возрастал в 3 раза - OR=3.01 (СІ 95% 1.70-5.36), тогда как Т аллель MTHFR сам по себе не давал никакого вклада в риск развития заболевания, а для РҐ 2 аллеля гена GP Ша OR=1.94(CI 95% 1.34-2.79).

Сочетание PI 2 аллеля GP Ша и 4G4G генотипа PAI-1 также чаще встречалось в группе пациентов по сравнению с контролем - 10.1% (21 человек) и 2.7% (5 человек), соответственно (р=0.002). Относительный риск развития ИМ у носителей данной комбинации был равен 4.71 (CI 95% 2.20-10.09), причем наличие только одного 4G4G генотипа PAI-1 не несло риска развития ИМ у мужчин до 45 лет.

Еще одно ген-генное взаимодействие увеличивало риск ИМ, при том, что отдельно взятые детерминанты не влияли на развитие заболевания. Аддитивный эффект наблюдался для 4G4G генотипа PAI-1 и носительства Т аллеля MTHFR в гетерозиготной или гомозиготной форме. Неблагоприятное сочетание встречалось у 39 пациентов (18.8%) и у 23 человек контрольной группы (11.6%), OR=1.77 (СІ 95% 1.06-2.96).

Инсерция 10 п.н. в промоторной области гена фактора VII свертывания крови является протективнои мутацией в отношении артериальных тромбозов. Однако, частота инсерционного аллеля не отличалась у пациентов и в контроле. Но, А1/А2 5 F7 в гетеро- или гомозиготном состоянии вместе с нормальным генотипом GP Ша превалировал у здоровых мужчин из группы контроля. Частота носительства А2 аллеля F7 и PlAlA1 GP Ша составляла 15% (31 человек) в группе больных и 21.2% (42 человека) в контроле (р=0.07). Это сочетание уменьшало относительный риск развития ИМ более, чем в 2 раза, OR=0.41 (СІ 95% 0.27 104

0,62). Соответственно отсутствие протективного аллеля гена F7 вместе с носительством РГ аллеля GP Ша повышало риск развития инфаркта миокарда: OR=2.45 (СІ 95% 1.43-4.18).

В заключении данного раздела настоящей работы можно сделать следующие выводы: 1) Полиморфизм Р1А1/А2 гена GP Ша ассоциируется с повышенной агрегацией тромбоцитов и является фактором риска развития инфаркта миокарда у мужчин в возрасте до 45 лет, причем риск развития инфаркта миокарда у носителей данного полиморфизма значительно возрастает при сочетании с курением. 2) Взаимодействие лейденской мутации фактора V свертывания крови с такими факторами риска развития ССЗ, как курение или нарушение обмена липидов, резко увеличивает риск развития ИМ у мужчин молодого возраста. 3) Отсутствие протективного аллеля А2 5 F7 увеличивает риск развития ИМ у мужчин с отягощенным семейным анамнезом по ССЗ. В отсутствии семейной истории ССЗ в риск развития ИМ вносят вклад лейденская мутация фактора V и полиморфизм промоторной области гена Р-фибриногена. 3) В генезе инфаркта миокарда значительную роль играют взаимодействия между приобретенными и генетическими факторами риска развития ССЗ, а также выявленные межгенные взаимодействия. Благодаря достижениям молекулярной медицины в настоящее время известно, что в основе развития полигенных заболеваний, к которым относятся артериальные тромбозы, лежит взаимодействие приобретенных и генетических факторов риска. Формирование артериальных тромбозов, в том числе ИИ и ИМ, включает в себя два процесса - атеросклероз и тромбообразование. Эпидемиологические исследования показали, что главными факторами риска развития атеросклероза являются возраст, мужской пол, нарушения липидного обмена, АГ, ожирение, курение, диабет, малоподвижный образ жизни и отягощенный наследственный анамнез. Следует отметить, что некоторые из этих факторов риска имеют и генетическую, и внешнюю компоненту. Атеросклероз развивается, как результат хронических изменений в клетках сосудистой стенки, в течении многих лет. С другой стороны, артериальные ишемии являются следствием тромботической окклюзии сосудов, пусковым элементом которой послужил разрыв атероматозной бляшки или эрозия эндотелия. В соответствии с этим, уровень циркулирующих гемостатических факторов играет ведущую роль в патогенезе атеротромбоза (Folsom A.R., 2001).

Изменения в плазменном и тромбоцитарном звеньях гемостаза генетически детерминируются. Однако вклад мутационных повреждений генов, кодирующих факторы свертывания крови, тромбоцитарные рецепторы и компоненты системы фибринолиза, в увеличение риска развития артериальных тромбозов однозначно не определен. Результаты работ, посвященных этому вопросу, носят противоречивый характер и сильно зависят от этнических, половых и возрастных особенностей исследуемых популяций (Simmonds R.E. et al, 2001).

Похожие диссертации на Молекулярно-генетические основы развития предрасположенности к артериальным тромбозам [Электронный ресурс]

Изучение полиморфизма RAGE-гена как фактора предрасположенности к развитию псориазаШульман Анна Яковлевна

Структура и взаимодействие наследственных и средовых факторов предрасположенности к развитию атопических болезней у детейТюменцева, Елена Станиславовна

Прогнозирование индивидуальной предрасположенности к развитию злокачественных новообразований легких, желудка и молочной железы у жителей промыш ленного городаЛежнин, Владимир Леонидович

Роль полиморфизма Т174М гена ангиотензиногена в формировании предрасположенности к развитию артериальной гипертензии, особенностях ее течения и выборе гипотензивного препарата в зависимости от генотипАндреева Мария Геннадьевна

Клинико-генетический анализ предрасположенности к развитию атеросклероза у детей и подростковЛарионова Валентина Ильинична

Липиды крови и ДНК- полиморфизмы апопротеиновых генов у детей и подростков в оценке предрасположенности к развитию атеросклерозаВасина, Валентина Ильинична

«Новая диагностическая панель для выявления наследственной предрасположенности к развитию рака молочной железы и рака яичников»Батенева Елена Ильинична

Генетическая предрасположенность к развитию пиококковой инфекции и результаты антибактериальной терапии атопического дерматита у детейГинтовт Елизавета Алексеевна

Роль мутации гена СНЕК2 в формировании наследственной предрасположенности к развитию рака яичникаКрылова Надежда Юрьевна

Роль особенностей обмена дофамина в индивидуальной устойчивости к стрессу и предрасположенности к развитию депрессивных состоянийБельтюкава, Татьяна Анатольевна