Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. История изучения генетики псориаза 11
1.2. Основные теории этиопатогенеза псориаза 13
1.3'. Место псориаза в структуре наследственной патологии человека 17
1.4. Причины и риск возникновения мультифакториального заболевания (псориаза) 19
1.5. Гены и хромосомы, ассоциированные с предрасположенностью к псориазу, 21
1.6. Медицинская генетика и псориаз , 28
1.7. Методы ДНК-диагностики: полимеразная цепная реакция 31
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объем и материалы исследований 35
2.2. Методы исследования 35
2.2.1. Выделение геномной ДНК из лейкоцитарной фракции крови ,36
2.2.2. Полимеразная цепная реакция 39
2.2.3. Рестрикционный анализ ,41
2.2.4. Электрофорез в агарозном геле 43
2.2.5. Клиническое обследование и генеалогический анализ, ,46
2.2.6. Статистические методы 50
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Характеристика групп обследуемых 52
3.2. Результаты изучения взаимосвязи полиморфизма RAGE-гена с риском развития псориаза и особенностями его клинического течения 68
3.3. Анализ значения средовых факторов в возникновении псориаза и комплекс профилактических мероприятий, направленных на снижение риска возникновения заболевания 74
Заключение 77
Выводы 88
Список литературы 89
Введение к работе
Проблема псориаза является одной из самых актуальных в современной дерматологии. Это обусловлено значительной распространенностью заболевания (от 1 до 5% населения планеты), хроническим, нередко тяжелым течением, неясностью этиологии и патогенеза, и, как следствие этого, несовершенством современных методов лечения /12,16,33/. Также следует отметить, что в последние десятилетия отмечается неуклонный рост заболеваемости псориазом, в том числе среди детей /18/. В настоящее время удельный вес больных псориазом среди всех больных дерматозами составляет 12-15%/25/.
О медико-социальной актуальности проблемы псориаза свидетельствуют данные, приводимые Национальным фондом псориаза США (NPF - National Psoriasis Foundation):
Количество больных: 1996 г.- 6,4 млн. чел., 2001 г. - более 7 млн. чел.
Средний возраст начала заболевания - 28 лет.
Дети моложе 10 лет составляют 10-15%.
Псориатический артрит выявляется в 10-30% случаев.
Регистрируется 150-260 тыс. новых случаев заболевания в год.
Расходы на лечение составляют 1,6-3,2 млрд. долл. в год.
Ежегодно около 400 чел. умирают от связанных с псориазом причин.
Ежегодно более 1,5 млн. чел. обращаются за медицинской помощью по поводу псориаза.
Эти данные аналогичны таковым по Российской Федерации /24/. В
настоящее время число больных псориазом в России составляет
приблизительно 3 млн. человек; отмечается тенденция к росту
заболеваемости среди лиц трудоспособного возраста, увеличению числа
тяжелых, непрерывно рецидивирующих форм заболевания. Сложившаяся
ситуация предполагает поиск новых путей профилактики псориаза и
создания методов прогнозирования его течения. Научной основой разработки
системы медицинской профилактики считаются результаты
эпидемиологических исследований. В связи с широким распространением неинфекционной патологии (сердечно-сосудистые, онкологические, кожные заболевания) с 50-х гг. двадцатого столетия термин «эпидемиология» стал применяться не только по отношению к инфекционным болезням. Для того чтобы программа клинической профилактики была эффективной, она должна быть целенаправленной /27/. то есть профилактические мероприятия необходимо проводить в первую очередь в отношении лиц, имеющих генетическую предрасположенность к псориазу.
На современном этапе развития медицины разработка новых
этиопатогенетических, фармакогенетических методов лечения
заболеваний с генетической предрасположенностью, в том числе и
псориаза, становится возможной в значительной мере благодаря выявлению изменений в организме больного на молекулярно - генетическом уровне (точечный нуклеотидный полиморфизм) /22/. Эти методы требуют внедрения новых высокотехнологичных методов исследования, какими
являются методы ДНК-диагностики, в том числе, с использованием полимеразной цепной реакции. Благодаря этим технологиям появилась возможность изучать полиморфизм генов, ассоциированных с предрасположенностью к псориазу. Кроме того, по данным литературы подобные исследования в Российской Федерации крайне малочисленны.
Настоящая работа представляет собой проблемно-ориентированное поисковое исследование, создающее научно-технический задел для реализации масштабных проектов в области молекулярно-генетических исследований мультифакториальных дерматозов и развития персонифицированной медицины.
Риск развития псориаза в зависимости от степени родства с больным пробандом составляет при первой степени родства - 5,6-6,3%, при второй степени - 3,1%, при третьей степени - 1,35% /20/. Эти данные получены с использованием популяционно-статистического, клинического и генеалогического методов исследования.
Методологический и технологический прорыв в развитии
молекулярной генетики и постгеномных технологий последнего десятилетия
позволил проводить исследования на новом - молекулярно-генетическом
уровне.
Цель исследования.
Изучение нуклеотидного полиморфизма RAGE-гена в российской популяции
как фактора предрасположенности к псориазу с целью прогнозирования
течения заболевания.
Задачи исследования:
Выявление клинически значимых генетических маркеров псориаза в RAGE-гене человека.
Анализ полиморфизма RAGE-гена и его роли в развитии псориаза.
Разработка молекулярного метода диагностики предрасположенности к псориазу на основе анализа полиморфизма RAGE-гена.
Разработка комплекса профилактических мер, направленных на снижение риска манифестации псориаза.
Научная новизна.
Впервые в Российской популяции изучался полиморфизм RAGE-гена. Предложен и апробирован метод определения генетических маркеров псориаза в соматических клетках (лейкоцитах крови) человека.
На основании анализа результатов клинического обследования, генеалогического анализа и молекулярно-генетических методов исследования выявлены закономерности в клинических проявлениях псориаза в зависимости от типа нуклеотидного полиморфизма RAGE-гена.
На основе полученных данных установлена диагностическая ценность определения полиморфизма RAGE-гена как фактора риска развития заболевания.
Предложен метод молекулярной диагностики предрасположенности к псориазу.
Практическая значимость.
Проведенные исследования обосновывают необходимость внедрения в
клиническую практику молекулярных методов диагностики
предрасположенности к псориазу. Была сконструирована тест-система для ДНК-диагностики мутаций в RAGE-гене и разработан метод генодиагностики мутаций RAGE-гена как фактора риска развития псориаза.
Внедрен в практику комплекс мер первичной профилактики псориаза, что позволяет снизить риск манифестации заболевания у лиц с генетической предрасположенностью к этому дерматозу. Внедрение результатов исследования.
Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре
дерматовенерологии Самарского государственного медицинского
университета, в научно-исследовательской работе и учебном процессе
Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического
института.
Апробация работы.
Основные положения и выводы диссертации доложены и обсуждены:
на научно-практической конференции ФГУ «ЦНИКВИ Росздрава» г.Москва 20 мая 2005 года;
на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов; Москва. 7-10 июня 2005;
на научно-практической конференции, посвященной 50-летию кафедры кожных и венерических болезней ГОУ ВПО Тверской ГМА 19 мая 2006 года;
на II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов; Санкт-Петербург 25-28 сентября 2007 года.
По материалам исследования опубликовано 7 печатных работ. Основные положения, выносимые на защиту:
Достоверно значимым маркером псориаза в RAGE-гене является сайт2184А/С
Ассоциированным с псориазом в сайте 2184A/G является аллель G.
Тяжелая форма вульгарного псориаза, более раннее его начало и анамнестически отягощенная наследственность ассоциированы с аллелем G в сайте 2184A/G RAGE-гена.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы и глав, содержащих материалы и методы исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, содержащего 129 источников, из них 35 отечественных и 94 иностранных. Работа изложена на 104 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 21 рисунком.
История изучения генетики псориаза
В настоящее время интерес к изучению генетики человека резко возрос. В 1990 году начата работа по международной программе Human Genome Project («Геном человека»), основной целью которой является полное секвенирование генома человека, что будет иметь беспрецедентное значение для биомедицинских технологий и практической медицины (гено-средовые взаимоотношения, ДНК-диагностика и ДНК-терапия). В середине 2000 года был получен пилотный вариант секвенирования генома человека, однако работа в рамках данного проекта еще продолжается /22/.
Клиническая генетика располагает целым рядом методов изучения наследственности человека: генеалогический, близнецовый, цитогенетический, популяционно-статистический, биохимический, метод генетики соматических клеток и молекулярно-генетический /20,32/. Самым старым из этих методов является генеалогический; его сущность заключается в составлении и анализе семейных родословных. Основываясь именно на генеалогическом методе, еще в начале двадцатого столетия Мае Kena et al. констатировал семейный характер псориаза у 30% больных; Hecht et al. проследил родословную 32 больных псориазом до 2-4-го поколения и пришел к такому же выводу. Hoede et al. (1957 г.) в докладе на 17 конгрессе Немецкого дерматологического общества отнес «чешуйчатый лишай», как в прошлом называли псориаз, к группе дерматозов, при которых наследственность играет существенную роль. Петрачек с соавторами, наблюдая 1645 больных псориазом, проходивших лечение за 10 лет в Пражской дерматологической клинике, обнаружил семейный характер заболевания в 11,1% случаев. Л. А. Соболев отмечал наследственный характер псориаза в 20%, Фюрст - в 36%, А. П. Кордон - в 15%. Lane и Marschall et al., изучив родословную 231 больного псориазом, установили семейный характер заболевания в 20% случаев. Dorn et al. наблюдал в течение двух с половиной лет 312 больных псориазом (168 мужчин и 144 женщины): у 41% больных заболевание носило наследственный характер. По сообщению П. В. Никольского (1928 г.), наследственность при псориазе прослежена до 5-го поколения /35/. Штейнберг (1951 г.) указывал, что дети один из родителей которых болен псориазом, заболевают примерно в 4 раза чаще, чем дети здоровых родителей. По данным на 2006 год в США больны псориазом 0,6-4.8% населения, из них 30% имеют родственника первой степени родства больного псориазом.
Используя близнецовый метод клинической генетики, было установлено, что конкордантность по псориазу монозиготных близнецов более чем в 3 раза выше, чем дизиготных, что наглядно показывает роль генотипа в формировании этого заболевания /12,19/.
Основываясь на популяционно-статистическом методе, в задачи которого входит изучение роли наследственности и среды в возникновении болезней с наследственной предрасположенностью, выявлено, что при псориазе доли генетической и средовой компонент равны 60-70% и 30-40%) соответственно /12,105/. В последние годы появились исследования, которые предполагают, что помимо давно установленной ассоциации псориаза и псориатического артрита, могут иметь место и другие коморбидные псориазу состояния, такие как ожирение, сахарный диабет 2-го типа, дислипидемия, гипертоническая болезнь, что также дает повод задуматься о генетическом родстве вышеуказанных патологий /66,78/.
Объем и материалы исследований
Обследовано 115 человек в возрасте от 6 до 72 лет, из них мужчин было — 48 (41,7%), женщин - 67 (58,3%). Все обследуемые были разделены на 4 группы: I группа (основная) состояла из больных псориазом (52 человека); II группа (сравнения) - 17 человек, в том числе 9 больных атопическим дерматитом, 5 - красным плоским лишаем, 3 - ихтиозом; III группа состояла из здоровых родственников больных псориазом (39 человек); IV группу (контрольную) составили здоровые добровольцы (7 человек). Родственники пробандов (больных псориазом, через которых осуществлялась регистрация обследуемой семьи), страдающие псориазом, были отнесены в первую группу.
Для проведения молекулярно-генетических исследований у всех обследуемых осуществляли забор венозной крови в объеме 5 мл.
Методы исследования: -клиническое обследование; -генеалогический анализ;
-молекулярно-генетические методы: полимеразная цепная реакция, рестрикционный анализ, метод электрофореза в агарозном геле; -статистические методы;
Выделение геномной ДНК из лейкоцитарной фракции крови проводилось по методу Boom с соавторами. Объект для обработки: кровь с антикоагулянтом EDTA-Na. Оборудование: микроцентрифуга/вортекс FV-2400;
твердотельный термостат («Термит», ТУ 9452-004-46482062- 2002, ЗАО «НПФ ДНК-технология»);
высокоскоростная микроцентрифуга Eppendorff 5415 D. Реактивы:
? раствор I: 5,4 М гуанидин тиоцианат (кат.№ G 6639, фирма Sigma, США), 0,2% раствор тритон Х-100 (кат.№ Т 9284, фирма Sigma, США), 0,1 М трис-HCl (кат.№ Т 6791, фирма Sigma, США), рН 7,4;
? сорбент: 50% водная суспензия макропористого стекла МПС-2000-ВГХ (ТУ 38-1018332);
? раствор II: 4 М гуанидин тиоцианат (кат.№ G 6639, фирма Sigma, США), 0,025 М этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль ( кат.№ Е 9884, фирма Sigma, США), 0,1 М трис-HCl (кат.№ Т 6791, фирма Sigma, США), рН 7,4;
? раствор III: 50% раствор спирта этилового ректификованного медицинского (ФС 42-3072), 50 мМ натрия хлорида (ТУ 6-09-3896), 20 мМ трис-HCl (кат.№ Т 6791, фирма Sigma, США), рН 7,3; ТЕ буфер: 10 мМ трис-НСІ (кат.№ Т 6791, фирма Sigma, США), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль (кат.№ Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,0, приготовленный на деионизированной воде, полученной на установке Milli Q фирмы Millipore, США ( кат.№ ZPMG 23004).
Процедура:
К 1 мл крови добавляли 1 мл раствора Канкеля (0,35 М Сахароза, 10 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 5mM MgC12, 1% Triton Х-100), перемешивали и центрифугировали при 3000 об. 10 мин.
Затем надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали в 1 мл раствора Канкеля с помощью пипетки или на вортексе и центрифугировали при 3000 об. 10 мин. Таким образом, осадок промывали 3 раза. Супернатант сливали.
Полученные в процессе отмывки образцы лейкоцитарной фракции крови разводили в 100 мкл физиологического раствора, переносили в стерильные пробирки 1,5 мл (типа «Eppendorf») и использовали для выделения ДНК. К 100 мкл физиологического раствора, содержащего лейкоциты, в пробирке 1,5 мл (типа «Eppendorfr ), добавляли 300 мкл раствора I. Пробы инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, 1-2 раза перемешав на вортексе. После окончания лизиса в раствор добавляли 10 мкл суспензии сорбента, тщательно встряхивали на вортексе и охлаждали при темепературе +8С в течение 2 минут. Затем еще раз встряхивали и осаждали при температуре +8С еще в течение 5 минут. Пробирки центрифугировали в течение 15 секунд на микроцентрифуге при 8-12 тыс.об/мин., супернатант отбросывали.
К осадку добавляли 100 мкл раствора II и встряхивали его на вортексе. Сорбент осаждали центрифугированием при 8-12 тыс.об/мин. в течение 15 сек. Супернатант отбрасывали.
Процедуру отмывки повторяли еще два раза с использованием 1,0 мл раствора III так, как это описано выше.
Дополнительным центрифугированием при 8-12 тыс.об/мин. с последующим отбрасыванием супернатанта, убирали остатки раствора III.
Пробирки помещали в твердотельный термостат «Термит» и подсушивали пробы в течение 5 минут при температуре 45-55С, оставляя пробирки открытыми.
В пробирки с сорбентом добавляли 50 мкл ТЕ буфера, закрывали их, перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 5 минут при температуре 45-55С.
Пробирки центрифугировали 15 секунд при 8-12 тыс.об/мин., водную фазу (супернатант) использовали в качестве исследуемого образца геномной ДНК человека для последующей постановки реакций аиплификации. Хранили при температуре 2-8С.
Если требуется длительное хранение, то супернатант необходимо снять с осадка и перенести в чистую пробирку, после чего можно заморозить при температуре —20С. Для определения полиморфизма RAGE-гена нами была сконструирована тест-система, основанная на полимеразной цепной реакции. В предложенной тест-системе профиль амплификации представляет собой 40 циклов, проводимых в следующем режиме: о 1-й этап - денатурация ДНК. В нашем исследовании денатурации подвергалась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитарной массы цельной крови после предварительной отмывки лейкоцитов раствором Канкеля при температуре 93 С длительностью шага 10 секунд; о 2-й этап - отжиг (омелинг): в разработанной нами тест-системе отжиг праймеров осуществлялся при температуре 64 С длительностью шага 10 секунд; о 3-й этап — элонгация: происходила при повышении температуры до 72 С, с длительностью шага 10 секунд. Амплификацию ДНК проводили в присутствии специально подобранных праймеров, которые позволяли фланкировать участок ДНК, содержащий RAGE-ген и провести его амплификацию для последующего изучения методом рестрикции.
Характеристика групп обследуемых
Под наблюдением находилось 115 человек в возрасте от 6 до 72 лет. Средний возраст в группе больных псориазом составил 33,7 года, в группе сравнения - 36,8 года, в контрольной группе - 33,3 года и в группе здоровых родственников 35,1 года. Среди больных псориазом было 22 мужчины и 30 женщин; в группе сравнения — 10 мужчин и 7 женщин; в контрольной группе - 2 мужчины и 5 женщин; в группе здоровых родственников - 14 мужчин и 25 женщин (таблица 5)
а). Пациент К., 32 лет, распространенный экссудативный псориаз, тяжелой степени, псориатическая ониходистрофия; болен с 12 лет, начало заболевания связывает со стрессом (переезд на новое место жительство, смена школы), полной ремиссии никогда не наступало. Отец пациента, 53 лет, псориаз, вульгарная форма, легкой степени тяжести: периодически возникающие псориатические бляшки в области разгибательных поверхностей локтевых суставов (рис.12). У обоих обследуемых генотип по сайту RAGE 2184A/G - GG, по сайту RAGE 1704G/T - GT, по сайту RAGE G82S - дикий тип (GG).
Пациентка О., 16 лет, псориаз, вульгарная форма, средней степени тяжести, больна с 15 лет, начало заболевания связывает со стрессом и обострением хронического тонзиллита. Отец пациентки, 40 лет, болен псориазом с 18 лет (легкая степень тяжести заболевания). Мать пациентки, 37 лет, клинически здорова (рис 13). Генотип пациентки по сайту RAGE 2184A/G - AG, по сайту RAGE 1704G/T - GT, по сайту RAGE G82S - дикий тип; генотип матери пациентки по сайту RAGE 2184A/G - AG, по сайту RAGE 1704G/T - GT, по сайту RAGE G82S - дикий тип (GG); генотип отца пациентки по сайту RAGE 2184A/G — АА, по сайту RAGE G82S - дикий тип (GG).
в). Под нашим наблюдением находился пациент И. - мужчина 25 лет, болен псориазом с 20 лет. Первые псориатические высыпания возникли на месте нанесения татуировки (разгибательная поверхность плеча), сделанной во время срочной службы в армии. Затем высыпания приобрели распространенный характер.
г). Пациент П. - мужчина 54 лет, который связывает начало заболевания с приемом препарата «Атенолол» (бета-адреноблокатор) по поводу ишемической болезни сердца и гипертонической болезни. Впоследствие обострение псориаза возникло после начала приема препарата «Беталок», также относящегося к группе бета-адреноблокаторов.
С целью установления возможной взаимосвязи полиморфизма RAGE-гена с частотой возникновения псориаза и особенностями клинического течения заболевания проводилось изучение ассоциации между частотой регистрации различных аллелей трех сайтов RAGE-гена (2184A/G, 1704G/T и G82S), клиническими признаками псориаза и анамнестическими данными. Статистически обработав данные и проанализировав их, нам удалось установить, что среди больных псориазом (основная группа) с наличием аллеля G в сайте RAGE 2184A/G тяжелая форма заболевания встречалась в 50% случаев, в отсутствии аллеля G — в 7,69%. Частота возникновения тяжелой формы псориаза в группе с наличием аллеля G выше с достоверностью 96,6% (уровень значимости р=0,034). Вульгарная форма псориаза у больных с аллелем G была диагностирована в 83,33% случаев, без аллеля G - в 79,31%. Отягощенная по псориазу наследственность у больных с наличием аллеля G в сайте RAGE 2184A/G установлена в 60% случаев, в то время как в отсутствии аллеля G — в 44%.
