Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
Глава 2. Материал и методы исследования 35
2.1 Материал исследования 35
2.2 Методы обследования больных 42
2.3 Клиническая характеристика больных до операции 45
Глава 3. Выделение и обработка сосудов пуповины 47
3.1 Механическая обработка пуповины 48
3.2 Методики консервации сосудов пуповины 51
3.2.1 Хранение сосудов пуповины в антибиотиках 51
3.2.2 Обработка глутаровым альдегидом 55
3.2.3 Обработка этиловым спиртом 58
Глава 4. Результаты экспериментальных исследований 61
4.1 Результаты гистологических исследований 61
4.2 Упруго-прочностные испытания сосудов пуповины 66
4.3 Техника и результаты экспериментальных операций 77
4.4 Обсуждение 86
CLASS Глава 5. Клиническое применение артерий пуповины CLASS 89
- Материал исследования
- Хранение сосудов пуповины в антибиотиках
- Обработка этиловым спиртом
- Упруго-прочностные испытания сосудов пуповины
Материал исследования
Материалом для исследования служили нативные пуповины новорожденных в количестве 60 шт., взятые в родильном доме №3 ЗАО и Институте акушерства и гинекологии РАМН после нормальных родов или кесарева сечения.
20 пуповин были отбракованы, так как имели псевдоузлы и патологическую извитость, что не позволило выделить фрагменты артерий и вен достаточной длины. Были выделены артерии и вены пуповины (80 артерий и 40 вен соответственно) длиной от 15 до 40 см. После проверки с помощью гидравлической пробы состоятельности стенки сосудов 10 артерий и 5 вен были помещены в смесь антибиотиков (каждый экземпляр отдельно, в условиях стерильного бокса, чтобы исключить контаминацию микроорганизмами). 10 артерий и 5 вен были помещены в 0,625% раствор глутарового альдегида после предварительного надевания на стеклянную палочку (вены) или венозный катетер диаметром 3 мм (артерии пуповины), где они фиксировались в течение 14 дней с промежуточной обработкой додецилсульфатом натрия (1%) по схеме, принятой в НЦССХ им. А.Н. Бакулева. Оставшаяся часть артерий и вен пуповин была помещена после выделения и отмывания по описанной ранее методике в 70% раствор этилового спирта.
В предварительных опытах нами было использовано еще 20 пуповин, взятых при тех же условиях, что и описанные группы, для отработки оптимальных концентраций растворов спирта. Из этих пуповин выделено 20 артерий и 10 вен (с учетом выбраковки), которые после проведения предварительных экспериментов были утилизированы и не вошли в настоящее исследование.
После прохождения соответствующих сроков обработки и стерилизации артерии и вены пуповины использовались для дальнейших экспериментов.
Фрагменты сосудов после прохождения соответствующего цикла обработки помещались во флаконы с питательной средой (тиогликолевой и Сабуро) и помещались в термостат при температуре +37С на 12 дней для оценки стерильности. При наличии роста микрофлоры материал отбраковывался (в нашем случае отбраковка происходила только в предварительных экспериментах в основном за счет роста грибковой микрофлоры, ни один образец из вошедших в данное исследование не дал роста).
Определение упруго-прочностных свойств артерий и вен пуповины.
Для определения упруго-прочностных характеристик отбирали участки артерий и вен пуповины со сходными условиями обработки в количестве по 20 штук каждого вида длиной по 35-40 мм. После проведения полного цикла обработки глутаровым альдегидом, различными растворами спирта и модификации гепарином, а также после 40-суточного хранения нативных артерий проводили испытания. Перед их началом образцы отмывали в стерильном физрастворе и хранили в нем до начала испытаний не более 4 часов.
Для испытаний по требованию ГОСТа необходимо было вырезать образцы в виде лопаток вдоль и поперек стенки сосудов. С учетом малого диаметра сосудов (диаметр артерий не превышал 3 мм) и невозможности вырезания лопаток мы ограничились участками цилиндрической формы (кусочки нативного сосуда), которые при зажимании в разрывной машине можно было с известной долей приближения считать как две толщины стенки сосуда (за счет сплющивания в зажимах). Ширину образцов принимали равной ширине сплющенного сосуда. Вырезать образцы в окружном по отношению к стенке сосуда направлении не представлялось возможным, поэтому испытания проводили только по одному направлению.
Растяжение полосок биотканей и его зависимость от приложенного усилия регистрировали графически на самописцах приборов.
Определяли условный предел прочности (ав), максимальные деформации, касательные модули упругости (Е) для линейных участков диаграмм растяжения, F max- максимальное усилие при котором происходило разрушение образца.
Испытания проводили на разрывной машине фирмы "Zwick", любезно предоставленной заведующей лабораторией химии и технологии материалов проф. СП. Новиковой, с компьютерным контролем параметров испытаний.
Толщину образцов измеряли микрометром со стандартным усилием прижима. Исходную длину задавали 30 мм. Для исключения ошибок при измерении удлинения задавали минимальную начальную нагрузку 0,05 Н. Модуль упругости измеряли при малых значениях нагрузки на начальном этапе растяжения, где имелась линейная зависимость удлинения от силы нагрузки. Скорость испытаний при определении модуля упругости составила 5 мм/мин. После определения модуля скорость испытаний увеличивали до 25 мм/мин и подвергали образцы нагрузке до разрыва. Измеряли относительное напряжение в момент разрыва, при максимальной нагрузке.
Испытания прекращали по спаду нагрузки более 90%. Обработка полученных результатов проводилась в автоматическом режиме по программе испытаний. В качестве контрольных групп использовали забранные в асептических условиях в морге лучевые и внутригрудные артерии, которые в настоящее время являются наиболее предпочтительным материалом для АКШ. Аллогенные артерии забирали от трупов лиц не старше 40 лет, погибших от несчастного случая, при отсутствии признаков заболевания сосудов и с давностью наступления смерти не позднее 24 часов (для исключения влияния аутолиза) при хранении трупа при температуре не выше 4С.
Для проведения гидравлических испытаний использовали канюли разного диаметра, соответствующие внутреннему диаметру артерии и вены пуповины, с присоединенным манометром со шкалой до 500 мм рт.ст. Сосуд фиксировали на канюле, противоположный конец его пережимался, и создавали воздушное давление от 0 до 400 мм рт.ст. Давление повышали до тех пор, пока не происходило разрушение стенки сосуда.
Оценка влияния различных методов обработки на гистологическую структуру артерий и вен пуповины.
Препараты артерии и вены пуповины подвергали гистологическим исследованиям в Лаборатории патологической анатомии с прозектурой НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН (руководитель - д.м.н. Р.А. Серов). Для оценки технологии фиксации артерий и вен пуповины на микроструктурном уровне использовали гистологические срезы, взятые из различных участков сосуда до и после процедуры химической обработки или хранения в антибиотиках. Для этого отбирали участки стенки сосудов (артерии и вены пуповины в средней их части, при отсутствии видимых повреждений). После прохождения всех этапов обработки препараты фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, после чего делали заливки в парафин по стандартной методике, резали на микротоме, окрашивали гематоксилином и эозином, фуксилином и по методу Ван-Гизона, после чего исследовали в световом микроскопе при увеличении от 10x40 до 15x80. Гистологические препараты фотографировались через специальную фотоприставку к микроскопу в цифровом формате, а также изображение выводилось на экран компьютера, что позволяло визуально оценивать большую площадь исследуемого среза.
В качестве контроля использовали необработанные образцы тканей.
Девитализация сосудов пуповины. Девитализацию выделенных артерий и вен пуповины осуществляли по методу, разработанному Акатовым B.C., Соловьевым В.В., Рындиной Н.И. и др. (патент РФ № 2231997, от 10.07.2004). Для этого помещали выделенные сосуды пуповины в раствор с концентрацией 10 ммоль ЭДТА и добавляли в него дигитонин (ПАВ) из расчета 50 мг на 200 мл раствора. Для исключения возможности контаминации материала добавляли 80 мг гентамицина и 2 мл. раствора флуконазола. В полученное количество раствора с рН=6,0 укладывали артерии и вены пуповины с тем условием, чтобы количество раствора по массе в 6-7 раз превышало массу биологической ткани. Емкость герметично закрывалась и ставилась на лабораторный шейкер для интенсивного встряхивания. В таком режиме сосуды обрабатывались в течение 24 часов, после чего переносились в раствор антибиотиков, где, пройдя стерилизацию, хранились до момента имплантации.
Хранение сосудов пуповины в антибиотиках
Эта методика рассматривалась нами как наиболее предпочтительная. В настоящее время имеющийся в НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН обширный опыт применения аллографтов, в том числе и венозных, подтверждает перспективность этого направления.
Известно, что иммунный ответ на пересаженную ткань обусловлен в основном наличием двух типов антигенов. Антигены 1 типа имеются на мембране всех клеток организма. Антигены 2 типа присутствуют только на мембранах иммунокомпетентных клеток. Поэтому предлагается „мягко" уничтожить клеточные элементы в стенке донорского сосуда, что приведет к значительному снижению иммуногенности. Удаление клеток должно быть «мягким», так как при жестких некротических воздействиях наступает лизис мембран клеток и выход протеолитических ферментов в межклеточное пространство, что в свою очередь может серьезно нарушить архитектонику коллагеновых волокон в ткани и привести в конечном итоге к снижению механической прочности.
Чтобы избежать этого мы использовали комбинированное воздействие некротического агента дигитонина, который, связываясь с холестерином мембран клеток приводит к образованию пор в ней, и ЭДТА, которая, являясь хелатором, захватывает накопившийся в клетках кальций и способствует профилактике кальциноза имплантата после операции. После нахождения в растворе ЭДТА и дигитонина в течение 2 суток сосуды пуповины переносили в раствор антибиотиков, где и осуществлялась их окончательная деконтаминация.
По нашим данным и данным литературы хранение свежих аллографтов в растворе антибиотиков в течение 50 дней не приводит к существенному снижению прочности, поэтому мы считаем вправе определить максимальный срок хранения обработанных сосудов пуповины не более 50 дней. После этого срока процессы аутолиза уже достаточно серьезно повреждают матрикс, поэтому лучше максимально уменьшить этот срок. В нашем исследовании сосуды хранились не более 40 дней, после чего имплантировались собакам или использовались в клинической практике.
В практике отдела медицинской биотехнологии НЦ ССХ им.А.Н.Бакулева РАМН с 2000 года используется следующая пропись (так называемая «мягкая» схема): 1. Ципрофлоксацин - 200 мг, 2. Гентамицин - 80 мг, 3. Ампициллин -500 мг, 4. Метрогил 0,5% - 4 мл , 5. Флуконазол - 1 мл раствора на 200,0 питательной среды RPMI 1640.
До 2000 года состав стерилизующей смеси был следующим (так называемая «жесткая» схема): 1. Цефазолин - 5г/л, 2. Гентамицин - 400мг/л. 3. Ампициллин - 2,5 г/л. 4. Метронидазол - 25 мг/л
В конце 2005 г. в нашем Центре при производстве аллографтов произошло 2 случая сбоя эффективности стерилизации. При этом материал, отправленный на контроль в бактериологическую лабораторию, дал отрицательные результаты посева, а после имплантации кондуитов через 3-4 дня у пациентов развились явления активного инфекционного эндокардита пересаженного клапана. При повторной операции клапаны были эксплантированы и переданы в микробиологическую лабораторию для идентификации микрофлоры. Полученные результаты заставили изменить точку зрения на спектр микрофлоры, наиболее часто обсеменяющей аллогенную ткань. Если раньше все исследования показывали, что среди микрофлоры встречаются только чувствительные к наиболее тривиальным антибиотикам штаммы (Бритиков Д.В., 2004), то эти случаи выявили рост бактерий Enterobacter sp., чувствительных лишь к сульперазону и меропенему. Этот тревожный результат свидетельствует об эволюции микрофлоры аллогенной ткани и побудил изменить схему стерилизации сосудов, введя в нее сульперазон. В настоящее время разработана новая схема стерилизации, обеспечивающая практически 100% стерильность, которая и была выбрана нами в качестве основной. Схема стерилизации в растворе антибиотиков приведена в таблице 5.
Физиологический раствор в качестве основы стерилизующей смеси выбран нами потому, что использование питательной среды, входящей во все протоколы стерилизации, дорого и не требуется в нашем случае, так как мы изначально ориентировались на девитализированные сосуды с целью снижения иммунного ответа.
Материал помещается в полученную смесь и экспонируется в ней при температуре +4С. Продолжает обсуждаться вопрос об использовании противогрибковых препаратов. Было показано, что раствор антибиотиков является токсичным, однако он включается в стерилизующую смесь многими авторами (Kirklin et al., 1987, Gonzales-Lavin et al., 1987, Mestres et al., 2000). Кроме того, оказалось, что грибковое загрязнение происходит в основном при относительно длительной антибактериальной терапии доноров, перенесших реанимацию (в нашем исследовании мы сразу исключили любые возможные заболевания матери во время беременности при разработке критериев отбора). Добавка флуконазола по данным Бритикова Д.В. (2004) практически не изменяет свойства аллографтов. Поэтому мы считаем необходимым добавлять низкие дозы противогрибковых антибиотиков с целью обеспечения микробиологической чистоты.
Поскольку протоколы стерилизации различных тканевых банков и в нашей лаборатории не могут гарантировать стерильность в 100% случаев, одновременно с сосудом в контейнер помещаются небольшие фрагменты сосуда, взятые из той же пуповины. Часть этих образцов отбираются для посева на бактерии и грибки после стерилизации. В нашем материале не было получено ни одного положительного посева после стерилизации в антибиотиках, что позволяет рекомендовать используемый нами протокол для дальнейшего применения.
После стерилизации и 40-дневного хранения в растворе антибиотиков сосуды пуповины внешне не отличались от нативных. При попытке накладывания атравматического шва в отдельных случаях отмечалась склонность к расслоению стенки, связанная с особенностями гистологического строения.
Обработка этиловым спиртом
Обработка сосудов пуповины этиловым спиртом - новый этап исследований, призванный адаптировать артерии пуповины для коронарной хирургии. Уникальные работы отдельных зарубежных авторов и данные Кемеровского кардиологического центра позволяют нам использовать этот опыт при создании биопротеза сосуда малого диаметра.
Преимущества этилового спирта заключаются в том, что он вызывает обезвоживание ткани, при этом мало вступает в химические реакции с матриксом клапана. Кроме того, облегчается отмывка сосуда от остатков консерванта по сравнению с глутаровым альдегидом, так как остаточная токсичность спирта невелика. С учетом того, что сосуды пуповины представляют собой аллогенную ткань, полная химическая стабилизация не требуется, так как клетки ткани будут разрушены в спирте, а коллагеновый матрикс очень слабо иммуногенен. Появившиеся в зарубежной литературе сообщения о внедрении новой методики стабилизации ткани с коммерческим названием T-Hydro позволяет нам утверждать, что методика обработки этиловым спиртом вызывает интерес у представителей тканевых банков.
Стабилизация сосудов производилась на стеклянных палочках и внутривенных катетерах, аналогично глутаровому альдегиду. Принимая во внимание тот факт, что спиртовой раствор химически взаимодействует с тканью сосуда, мы столкнулись с выбором наиболее эффективной концентрации раствора. Мы остановились на испытаниях фиксирующей способности 50%, 70% и 96% растворов спирта. После помещения в растворы спирта образцов сосудов (артерии и вены пуповины) экспозиция составляла 14 суток при комнатной температуре, после чего образцы извлекали и оценивали упруго-прочностные свойства.
Использование 50% раствора оказалось неэффективным, так как после истечения необходимого срока обработки мы не отмечали изменения упруго-прочностных свойств по сравнению с нативными сосудами. Внешне фиксированные сосуды мало отличались от нативных, после их отмывания стерильным физраствором они практически восстанавливали свои нативные свойства. Это свидетельствует о том, что 50% концентрация спирта недостаточна для фиксации сосудов и требует увеличения сроков обработки, что нежелательно. Кроме того, 50% спиртовой раствор не обеспечивал стерильности готовых изделий, что было подтверждено микробиологическими тестами. Это вынуждало использовать дополнительные стерилизующие компоненты. Длительное нахождение сосуда в нестерильной среде увеличивало риск аутолиза и ухудшения механических свойств за счет повреждения коллагеновых волокон. Учитывая все указанные недостатки, мы отказались от использования этой концентрации.
Использование 96% раствора (фактически чистого, неразбавленного спирта) приводило к резкому уменьшению длины фиксируемого сосуда за счет грубой. фиксации. Гистологическое исследование выявило массивное обезвоживание фиксированной ткани. Стенка сосуда визуально представляла собой хрупкую полупрозрачную структуру, легко прорезающуюся при попытке наложения шва атравматическим шовным материалом. Повреждения тканей в области шва имели тенденцию к расширению при максимально бережном воздействии на стенку. Это приводило к возникновению угрозы массивного кровотечения при клиническом или экспериментальном использовании. Мы решили отказаться от 96% спирта и остановили свой выбор на 70%.
С учетом рекомендаций бактериологов, эта концентрация является бактерицидной, что не требует дополнительной стерилизации. К тому же с учетом химических свойств спирта, 70% концентрация обеспечивает глубокое проникновение в ткани, не вызывая дубящий эффект на поверхности. Наши надежды оправдались. Фиксация 70% спиртом привела к значительному улучшению упруго-прочностных свойств стабилизированных артерий пуповины. Стенка сосуда отличалась достаточной прочностью и устойчивостью к проколам атравматической иглой, что позволяло надеяться на успех экспериментальных операций на собаках.
Для дальнейшей оценки эффективности выбранных методов обработки сосудов пуповины мы использовали гистологические методы, упруго-прочностные исследования на разрывной машине, провели несколько серий имплантаций обработанных сосудов пуповины лабораторным животным.
Упруго-прочностные испытания сосудов пуповины
. Учитывая трудность подготовки образцов и возможность их механического повреждения при выделении, мы выбраковывали результаты испытаний, более чем на 100% выходящие за рамки средних значений. Особую роль при этом играет зона иссечения образцов, так как в области выхода из плода и в области прикрепления к плаценте на расстоянии около 3-4 см сосуды даже визуально казались толще, чем на протяжении средней части пуповины. Поэтому мы заранее перед испытаниями отбраковывали эти образцы.
Достаточно проблематичным оказалось измерение ширины образца, так как вблизи зажимов они явно были передавлены и за счет этого казались шире. Для измерений ширины образцов мы пользовались линейкой с делениями по 0,5 мм, что в свою очередь делало погрешность измерений достаточно высокой. Использовать штангенциркуль невозможно, так как образцы изменяли свою форму при попытке зажима между измерительными плоскостями. Поэтому полученные нами данные о прочностных и упругих свойствах сосудов пуповины с разной обработкой имеют большой числовой разброс, и их можно лишь с определенной долей приближения считать постоянной величиной, характеризующей материал после обработки. В нашем случае испытания на прочность проводились в сравнительном аспекте, поэтому мы вправе считать их достаточно доказательными.
Е- модуль вычисляли на начальных участках деформационной кривой, которую принимали линейной, как тангенс угла наклона этого участка кривой к оси абсцисс. При этом значения нагрузки находились в пределах нижней границы условий линейной упругой деформации. Значение скорости испытаний соответствовало 4 мм/мин. На этапе определения максимального разрывного напряжения скорость испытаний увеличивали до 25 мм/мин.
А. Нами проведены испытания 20 нативных артерий пуповины. Результаты исследования 9 из них представлены в таблице 7 и на рис.9.
При статистической обработке результатов испытаний по 20 образцам получены следующие результаты: А0=0,5875±0,1246, В0=5,25±0,4629, Fmax=3,45±l,61, св=1,17±0,68, ЕМОД=1,28±0,55.
Из 9 образцов, представленных на рис 6, можно выделить 2 группы сосудов со сходными упруго-прочностными характеристиками: образцы 7,9 и 8 показывают высокую прочность, а образцы 4,5, 6 и 10 - более эластичны, склонны к расслоению. Это свидетельствует о неоднородных упруго-прочностных характеристиках необработанных артерий пуповины (по-видимому, большое значение имееют микроповреждения стенки сосудов при их выделении из нативной пуповины).
Б. В таблице 8 и на рис.10 представлены результаты испытаний артерий пуповины, обработанных глутаровым альдегидом. Всего было исследовано 20 образцов, 8 из которых приведены в данной таблице (остальные были отбракованы по результатам испытаний в связи с тем, что они имели видимые повреждения после стабилизации изломы).
При статистической обработке результатов испытаний по 20 образцам получены следующие результаты: А0=1,271±0,499, В0=5,571±0,5345, Fmax=12,03±5,97, o-R=0,040±0,027, ЕМОД=2,34±1,00.
После обработки глутаровым альдегидом отмечается увеличение прочности артерий пуповины по сравнению с нативными образцами и стабильность упруго-прочностных показателей, что свидетельствует о сшивании глутаровым альдегидом участков возможных повреждений стенки сосудов.
В. В таблице 9 и на рис.11 представлены результаты упруго-прочностных испытаний артерий пуповины, стабилизированных в 70% спирте с последующей обработкой гепарином. Методика была предложена проф. СП. Новиковой (НЦССХ им. А.Н. Бакулева) для модификации биологических изделий. Всего было испытано 15 образцов, 10 из которых представлены в таблице. Остальные были отбракованы по причинам, аналогичным предыдущим исследованиям.
При статистической обработке результатов испытаний по 15 образцам получены следующие результаты: А0:=0,87±0,12, В0=4,84±0,384, Fmax=18,24±9,26 GR =0,087±0,077, ЕМОД=1,51±0,70.
После обработки в 70% спирте отмечается гораздо большее увеличение прочности материала по сравнению с обработкой глутаровым альдегидом. Упруго-прочностные свойства сосудов также более стабильны.
Г. Данные по исследованию упруго-прочностных характеристик нативных внутригрудных артерий человека (п=6) (для сравнения) приводим ниже (таблица 10, рис.12).
На графике видно, что упруго-прочностные свойства внутригрудных артерий нестабильны. Часть сосудов обладает высокой прочностью и растяжимостью (образцы 2 и 1), другие артерии (образцы 3,4,5) менее прочны при почти одинаковой эластичности. Это свидетельствует о микроповреждениях стенки сосудов при их выделении.
При статистической обработке результатов испытаний по 10 образцам получены следующие результаты: А0=0,6±0,001, В0=4,00±0,001, Fmax=9,47±7,33 OR =0,044±0,027, ЕМОД=1,30±0,34.
Д. Данные по исследованию упруго-прочностных характеристик нативных вен пуповины (п=8) приводим ниже (таблица 11).
При статистической обработке результатов испытаний по 12 образцам получены следующие результаты: А0=0,771±0,15, В0=4,429±0,53, Fmax=18,06±5,12 , OR =2,306±0,03, ЕМОД=0,70±0,45.
