Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Ожирение как триггер метаболических, гормональных и иммуно-воспалительных нарушений 12
1.2. Механизмы и основные медиаторы поражения почек при ожирении 14
1.3. Роль инсулинорезистентности в поражении почек при ожирении 19
1.4. Обструктивное апноэ во время сна - дополнительный фактор риска поражения почек при ожирении 21
1.5. Эндотелиальная дисфункция - центральное звено патогенеза поражения почек при ожирении 25
1.6. Асимметричный диметиларгинин - маркер и патогенетический фактор эндотелиальной дисфункции: механизмы регуляции и клиническое значение 28
1.7. Роль полиморфизма гена МТГФР в формировании эндотелиальной дисфункции и поражения почек 33
1.8. Особенности патогенеза повреждения почек, вызванного ишемией-реперфузией 36
1.9. Сукцинат как патогенетический фактор и маркер повреждения почек 38
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 40
2.1. Клиническое исследование 41
2.1.1. Критерии отбора больных 42
2.1.2. Методы обследования больных 45
2.1.3. Критерии и методы диагностики ассоциированных с ожирением клинических состояний 46
2.1.4. Критерии и методы диагностики ремоделирования сосудов и хронической болезни почек 48
2.1.5. Определение маркеров эндотелиальной дисфункции 50
2.2. Экспериментальное исследование 51
2.2.1. Характеристика эксперимента и методы исследования 55
2.2.2. Показатели, изученные в эксперименте 56
2.3. Методы статистического анализа 57
ГЛАВА 3. Результаты исследования 58
3.1. Результаты клинического исследования 58
3.1.1. Определение факторов риска развития хронической болезни почек 1-Ша стадий у больных ожирением 58
3.1.2. Влияние ожирения на факторы риска развития хронической болезни почек 1-Ша стадий 63
3.1.3. Влияние ассоциированных с ожирением заболеваний на формирование хронической болезни почек 1-Ша стадий 66
3.1.4. Особенности влияния метаболического синдрома и СО АС на факторы риска ХБП 1-Ша стадий 72
3.1.5. Асимметричный диметиларгинин - один из предикторов развития ХБП у больных ожирением 81
3.1.6. Влияние полиморфизма гена МТГФР на раннее ремоделирование сосудов и формирование хронической болезни почек 1-Ша стадий у больных ожирением 83
3.2. Результаты экспериментального исследования 88
3.2.1. Изучение скорости мочеобразования 89
3.2.2. Изучение плазменной концентрации сукцината 91
3.2.3. Изучение мочевой экскреции сукцината 93 ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 97
Выводы 121
Практические рекомендации 123
Список использованных источников литературы
- Эндотелиальная дисфункция - центральное звено патогенеза поражения почек при ожирении
- Методы обследования больных
- Определение факторов риска развития хронической болезни почек 1-Ша стадий у больных ожирением
- Влияние полиморфизма гена МТГФР на раннее ремоделирование сосудов и формирование хронической болезни почек 1-Ша стадий у больных ожирением
Введение к работе
Актуальность проблемы
Распространение эпидемии ожирения наблюдается во всех возрастных группах населения и характеризуется большим разнообразием поражения органов, в том числе и почек. Установлено, что развитие хронической болезни почек (ХБП) при ожирении запускается гормональными и гемодинамическими факторами, которые вызывают эндотелиальную дисфункцию и сосудистое ремоделирование (Мухин Н.А., 2006; Tanner RM и соавт., 2012). Однако не все механизмы эндотелиальной дисфункции при этом детально изучены.
Центральное место в формировании эндотелиальной дисфункции (ЭД) занимает нарушение NO-опосредованных функций. Одним из значимых факторов ЭД является асимметричный диметиларгининин (АДМА), который ингибирует все типы NO-синтаз. В серии работ показано, что АДМА является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и важным медиатором кардиоренальных связей, так как многие механизмы, регулирующие эффекты и метаболизм АДМА, задействованы в ткани почек. Согласно экспериментальным работам, в регуляцию метаболизма АДМА может быть вовлечена метилентетрагидрофолатредуктаза (МТГФР). Известно, что носительство мутаций гена МТГФР ассоциировано с ЭД и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Эти эффекты могут объясняться гипергомоцистеинемией, поскольку гомоцистеин способен стимулировать накопление АДМА в эндотелии (Жлоба А.А., 2007; Dayal S и соавт., 2005; Kielstein JT и соавт., 2008).
Роль гипоксии в формировании ХБП при ожирении малоизученна. Однако известно, что гипоксия приводит к развитию таких молекулярно-клеточных изменений, как оксидативный стресс, дисфункция митохондрий, накопление различных метаболитов. Последние, как показывают исследования, могут являться не просто продуктами обмена, но и важными паракринными факторами, опосредующими адаптационные изменения, которые впоследствии могут вызвать повреждение тканей. В последнее время привлечено внимание к подобному медиатору – сукцинату – в связи с открытием его специфического рецептора. При гипоксии и оксидативном стрессе происходит повышение концентрации сукцината, что приводит к синтезу гипоксией индуцированного фактора-1 (HIF-1) и сосудистого эндотелиального фактора роста, а также секреции ренина (Peti-Peterdi J, 2010).
В клинических условиях примером ассоциированного с ожирением состояния, в котором вовлечены механизмы метаболических, гемодинамических нарушений, эндотелиальная дисфункция и гипоксия, является синдром обсруктивного апноэ во время сна (СОАС). Известно, что присоединение СОАС усиливает влияние метаболического синдрома на сердечно-сосудистый риск (Чазова И.Е. и соавт., 2009). Вместе с тем его влияние на формирование и прогрессирование ранних стадий поражения почек при ожирении недостаточно изучено так же, как и взаимосвязь факторов эндотелиальной дисфункции с изменениями, индуцированными гипоксией.
Цель исследования
Определить значение факторов гипоксии и эндотелиальной дисфункции для усовершенствования методов стратификации риска и диагностики ранних стадий поражения почек, ассоциированного с ожирением, в клинических условиях и в эксперименте.
Задачи исследования
-
Определить факторы риска развития хронической болезни почек (ХБП I-IIIа) у больных ожирением.
-
Оценить влияние синдрома обструктивного апноэ во время сна на формирование ХБП I-IIIа.
-
Определить значение асимметричного диметиларгинина и полиморфизма гена МТГФР, как маркеров эндотелиальной дисфункции, в формировании ХБП I-IIIа.
-
В экспериментальной модели ишемии-реперфузии оценить влияние избыточной массы тела на острое поражение почек у крыс по изменению плазменного и мочевого уровней сукцината – показателя гипоксического повреждения ткани.
Научная новизна
В работе установлено, что выраженность инсулинорезистентности вносит основной вклад в формирование ХБП при ожирении. Определены наиболее значимые предикторы развития и прогрессирования ХБП при ожирении: НОМА-индекс, сывороточные уровни инсулина, С-пептида, мочевой кислоты и асимметричного диметиларгинина.
Оценено влияние синдрома обструктивного апноэ во время сна, как состояния с повторяющимися эпизодами гипоксии-реоксигенации, в котором вовлечены различные механизмы тканевого повреждения, на формирование ранних стадий ХБП. Показано, что СОАС сопряжен с увеличением количества факторов риска, среди которых наибольшее значение для развития ХБП имеют выраженность абдоминального ожирения, эндотелиальная дисфункция и степень ремоделированиия сосудов. При этом АДМА является значимым маркером и фактором эндотелиальной дисфункции, опосредующим эффекты синдрома обструктивного апноэ во время сна на развитие поражения почек при ожирении.
Впервые определена взаимосвязь полиморфизма гена МТФГР с повышенным уровнем АДМА. Кроме того, обнаружено, что гомозиготное носительство патологического 677Т-аллеля гена МТГФР ассоциировано с более выраженным ожирением, характеризуется повышенной концентрацией инсулина в сыворотке крови и повышает риск формирования ХБП I-IIIа более чем в 2 раза.
В экспериментальном исследовании на основе анализа динамики изменений плазменной концентрации и мочевой экскреции сукцината впервые было определено влияние избыточной массы тела на острое повреждение почки и оценено значение сукцината как раннего маркера поражения почек.
Практическая значимость
Результаты диссертационной работы могут послужить основой для усовершенствования программ обследования больных ожирением с целью выявления факторов риска развития ранних, потенциально обратимых стадий ХБП, особенно при наличии СОАС и гомозиготного носительства мутаций гена МТГФР.
Дополнительное исследование АДМА в сыворотке крови у больных ожирением может увеличить вероятность ранней диагностики ХБП и контролировать эффективность лечебных мероприятий.
Положения, выносимые на защиту
-
У больных ожирением обструктивное апноэ во время сна является существенным фактором, повышающим риск формирования ранних стадий ХБП (I-IIIа).
-
Асимметричный диметиларгинин является значимым фактором эндотелиальной дисфункции, опосредующим эффекты СОАС на развитие поражения почек при ожирении.
-
У больных ожирением гомозиготное носительство патологического 677Т-аллеля гена МТГФР является фактором риска формирования ХБП.
-
Избыточное количество жировой ткани влияет на течение поражения почек, вызванного ишемией-реперфузией. Уровень сукцината в крови и моче является маркером гипоксического повреждения ткани почек.
Апробация работы
Апробация диссертационной работы проведена на совместном заседании сотрудников кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова, кафедры терапии и профессиональных болезней медико-профилактического факультета, кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования врачей, отдела нефрологии НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М.Сеченова» Минздравсоцразвития России. Материалы работы доложены и обсуждены на Европейском конгрессе нефрологов (ERA-EDTA, Мюнхен, июнь, 2010), VII Съезде Научного общества нефрологов России (Москва, октябрь, 2010), Международном конгрессе нефрологов (ISN, Ванкувер, апрель, 2011), Американском конгрессе нефрологов (ASN, Филадельфия, ноябрь, 2011).
Личный вклад автора
Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их теоретической и практической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику. Автором были лично выполнена экспериментальная часть, а также - аналитическая и статистическая обработка полученных данных.
Внедрение в практику
Результаты исследования используются на амбулаторном и стационарном этапах ведения больных ожирением сотрудниками кафедры внутренних болезней ФФМ МГУ имени М.В.Ломоносова (зав. – академик РАН и РАМН, д.м.н., профессор Н.А.Мухин), кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования врачей (зав. – д.м.н., профессор Е.М.Шилов) и отдела нефрологии НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека (зав. – д.м.н. И.Н.Бобкова) ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России; внедрены в практику преподавания курса внутренних болезней студентам ФФМ МГУ имени М.В.Ломоносова. Результаты экспериментальной работы являются базой для планирования клинических исследований.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 6 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 4 англоязычные публикации.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 141 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав, в которых представлены материалы и методы исследования, результаты собственного исследования, их обсуждение, выводы и практические рекомендации, иллюстрирована 30 рисунками и 13 таблицами. Список литературы содержит 182 источника, из них 38 отечественных.
База проведения
Клиническое исследование проводилось на базе кафедры внутренних болезней ФФМ МГУ имени М.В.Ломоносова в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева УКБ №3 Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (заведующий кафедрой и директор клиники – академик РАН и РАМН, д.м.н., профессор Н.А.Мухин). Экспериментальное исследование проводилось в Университете Южной Калифорнии (г. Лос-Анджелес, США; руководитель лаборатории – профессор Peti-Peterdi, Janos) в рамках программы научной стажировки для стипендиатов Президента РФ.
Эндотелиальная дисфункция - центральное звено патогенеза поражения почек при ожирении
Хотя механизмы возникновения и прогрессирования хронической болезни почек (ХБП) при ожирении остаются до конца не изученными, в последние годы ученые все чаще приходят к заключению, что, помимо общеизвестных гемодинамических нарушений, в ремоделировании сосудов и почек при ожирении вовлечены воспалительные и метаболические факторы (Bagby SP, 2004; Hall JE и соавт., 2004; Карпов Р.С. и соавт., 2010; Кутырина И.М. и соавт., 2010).
В настоящее время рассматриваются несколько возможных механизмов. Во-первых, отводится роль неблагоприятному воздействию повышенной экскреторной нагрузки из-за наличия избыточного количества жировой ткани. Во-вторых, поражение почек связывают с задержкой натрия в организме (Hall JE и соавт., 2004). И, наконец, прямые и непрямые эффекты инсулинорезистентно-сти и продуктов жирового обмена могут вносить свой существенный вклад в патогенез обменных нефропатий (Adelman RD, 2002; Praga М, 2002). Избыточная масса тела обусловливает повышение общего и межклеточного объема жидкости в организме и необходимость увеличенных энергетических затрат на поддержание гомеостаза. При ожирении наблюдается не только избыток подкожной жировой ткани, но и гипертрофия сердца почечных клубочков вследствие функциональных перегрузок (Verani RR, 1992).
Chagnac и соавт. (2000) на группе больных с морбидным ожирением подтвердил развитие гиперперфузии и гиперфильтрации в почках. Причиной внут-риклубочковой гипертензии и последующего увеличения фильтрационной фракции является дилатация приносящей артериолы. В связи с этим первым клиническим проявлением поражения почек при ожирении является протеину-рия. По данным Morales Е и соавт. (2003) и Adelman RD и соавт. (2001), снижение массы тела уменьшает протеинурию. Ожирение вызывает адаптационные изменения в нормальных нефронах, характерные для снижения числа нефронов при ХБП. Перегрузка нефронов и формирование внутриклубочковой гипертензии при ожирении становится чрезвычайно неблагоприятным фактором, если число полноценных нефронов уже снижено, например, как нарушение развития нефронов в результате внутриутробной задержки роста плода (Lackland DT и соавт., 2000) или у людей с единственной почкой (Praga М и соавт., 2000).
Hall JE и соавт. (2004) считают, что в ответ на повышенную реабсорбцию ионов натрия в результате воздействия симпатической инервации и ангиотен-зина II происходит расширение приносящей артериолы и секреция ренина (ту-булогломерулярная обратная связь). Эти события способствуют, как и повышенная экскреторная нагружка, компенсаторной внутриклубочковой гиперфильтрации. В результате восстанавливается нормальное поступление натрия в дистальные отделы нефрона. Похожий механизм предполагает Thomson и соавт. (2004) при рассмотрении вопроса увеличения реабсорбции ионов натрия при сахарном диабете. Так как внутриклубочковая гиперфильтрация уже формируется при повышении экскреторной нагрузки на почки, то следом возникающие внутриклубочковая гипертензия и протеинурия приводят к дальнейшему повреждению клубочков и канальцев.
Токсическое воздействие метаболитов липидного обмена (липидоток-сичность) является хорошо доказанным феноменом, приводящем к развитию полиорганного повреждения при ожирении и метаболическом синдроме (Unger RH, 2003; Schaffer JE, 2003). На поздних стадиях внутриклеточного накопления липидов избыток жирных кислот вызывает появление продуктов обмена, способных оказывать цитопатическое действие, таких, как диацилглицерол, триг-лицериды и церамид. Диацилглицерол повышает активность протеинкиназы С, церамид - кандидат на роль медиатора апоптоза. Данные, приводимые в работе Unger RH (2002), говорят о том, что липидотоксичность, приводящая к повреждению печеночной ткани (стеатогепатит), скелетных мышц, кардиомиоцитов, Р-клеток поджелудочной железы и, возможно, эндотелия, проявляется не только функциональным расстройством клеток, но и уменьшением клеточной массы различных органов через механизм апоптоза.
Токсическое воздействие метаболитов липидного обмена на эпителий проксимальных канальцев нефрона вместе с развитием тубулоинтерстици ального воспаления приводит к выраженной протеинурии вследствие накопления избытка жирных кислот, связанных с альбумином (Thomas ME и соавт., 1993; Kamijo А и соавт., 2002). Считается, что при наличии протеинурии повышенное количество свободных жирных кислот в большей степени связывается с альбумином сыворотки и, таким образом, увеличивается захват липидов эпителием проксимальных канальцев. Медикаментозное снижение уровня свободных жирных кислот может снизить влияние липидотоксичности и формирование тубулоинтерстициального воспаления, ассоциированных с протеинурией.
Оксидативный стресс - другой возможный механизм липидотоксичности, так как свободные радикалы кислорода при избытке свободных жирных кислот способны запускать апоптоз in vitro (Unger RH, 2003). Свободных жирных кислот повышают активность индуцибельной NO-синтазы и запускают продукцию свободных радикалов кислорода через окислительное фосфорили-рование. Сам по себе высокий уровень свободных жирных кислот на ранних стадиях МС, в независимости от внутриклеточного накопления триглицеридов, может быть важным фактором в изучении эпидемиологической взаимосвязи абдоминального ожирения и МАУ (Mulyadi L и соавт., 2001).
Известно, что у больны ожирением происходит активация ренин-ангиотензиновой системы (РАС), несмотря на задержку натрия и жидкости в организме (Engeli и соавт., 2005). Предполагают несколько механизмов активации РАС. Во-первых, гипрелептинемия и, возможно, гиперинсулинемия приводят к повышению симпатической иннервации почки (Montani и соавт., 2002). Во-вторых, рассматривает механистический фактор сдавления почечной ножки и самой почки висцеральными отложениями жира или в результате повышения внутрибрюшного давления (Hall и соавт., 2004). В-третьих, согласно экспериментальным данным, жировая ткань способна синтезировать отдельные компоненты РАС (Goossens и соавт., 2003). Так, Giacchetti и соавт. (2002) обнаружили, что висцеральный жир в большей степени, чем подкожный, экспрессирует ангиотензиноген и АТИ-рецепторы 1 типа как у людей с повышенным ИМТ, так и с нормальным весом тела. Engeli и соавт. (2005) не выявили значимое различие в продукции компонентов РАС между теми же группами пациентов. Однако при 5%-ом снижении массы тела у больных ожирением наблюдалось значительное уменьшение концентрации компонен-тов РАС в системной циркуляции и в жировой ткани.
Доказано, что ангиотензин II способствует прогрессированию ХБП, вызывая формирование АГ, внутриклубочковой гипертензии, усиливая протеину-рию и тубулоинтерстициальное воспаление с развитием фиброза (Ruster С и со-авт., 2006). К тому же, ангиотензин II участвует в регуляции продукции адипо-кинов жировой тканью и, возможно, в патогенезе инсулинорезистентности (Goossens и соавт., 2003). Таким образом, АТИ может прямо и опосредованно вызывать морфофункциональные изменения почек у больных ожирением и МС. Тем не менее, механизмы гемодинамических нарушений, воспаления и нарушенного липидного метаболизма в почках нуждаются в уточнение в экспериментах на человеческих тканях.
Воспаление - один из главных факторов рисков атеросклероза в популяции, тесно связанный с ожирением и МС (Ridker РМ и соавт., 2000, 2003). Ramkumar N и соавт. (2004) обнаружили сильную положительную корреляцию между воспалением (по данным СРБ 3 мг/дл) и ИМТ у пациентов с ХБП. Используя когорту из исследования NHANES III, тот же коллектив ученых показал, что ожирение ассоциировано с высоким риском воспаления при различных уровнях клиренса креатинина (Beddhu S и соавт., 2005). Wu Y и соавт. (2006) отметили увеличение экспрессии генов, связанных с липидным обменом (ЛНП-рецепторы), воспалительными цитокинами (ФНО-а и его рецепторы, рецептор ИЛ-6) и инсулинорезистентностью (GLUT-1, VEGF) в почечных клубочках больных ожирением, по сравнению с контрольной группой донорских почек. Полученные данные подтверждают положение о том, что провоспалительные цитокины и другие метаболиты жировой ткани оказывают повреждающее действие на сосуды и почечную ткань.
ИЛ-6 продуцируется висцеральной и периферической жировой тканью и клетками иммунной системы, вызывая множество эффектов (Weisberg SP eta 1., 2003). Уровень ИЛ-6 в плазме положительно коррелирует с ИМТ и инсулинре-зистентностью. Высокая концентрация ИЛ-6 является предвестником развития СД 2 типа и сосудистых событий (Wisse BE, 2004). Обнаружено, что ИЛ-6 индуцирует печеночную инсулинрезистентность (Senn JJ и соавт., 2002), увеличивает атерогенность тромбоцитов и экспрессию молекул адгезии эндотелием и гладкомышечными клетками (Wisse BE, 2004), а также активирует тканевую РАС (Wassmann S и соавт., 2004). ИЛ-6 обладает модулирующим эффектом по отношению к ТРФ131, способствуя фиброзированию почечной ткани. ИЛ-6 регулирует продукцию С-реактивного белка печенью, который относится к значимым факторам риска атеросклероза (Danesh J и соавт., 2004) и уровень которого повышается при ожирении и МС (Rexrode КМ и соавт., 2003).
Специфическая роль фактора некроза опухолей альфа (ФНО-а) при ожирении и МС плохо изучена. Известно, что ФНО-а продуцируется макро-фагами, в том числе находящимися в интерстиции жировой ткани. ФНО-а является одним из медиаторов инсулинрезистентности адипоцитов. Механизмы резистентности связаны с инактивацией инсулиновых рецепторов, индукцией липолиза и печеночного липогенеза, приводящим к увеличению в крови свободных жирных кислот и снижению уровня адипонектина (Hotamisligil GS, 1999). К прямым эффектам ФНО-а относят макрофагальную инфильтрацию, стимуляция апоптоза и выработки провоспалительных цито-кинов и ТРФ131 (Cunningham PN и соавт., 2002; Klahr S и соавт., 2003). Эти эффекты могут быть токсичными по отношению к эндотелиальным, мезангиальным и эпителиальным клеткам почечной ткани.
Методы обследования больных
В исследовании изучались следующие маркеры эндотелиальной дисфункции: 1. Сывороточная концентрация асимметричного диметиларгинина (АДМА). 2. С677Т-полиморфизм гена метилентетрагидрофолатредуктазы (МТГФР). Определение концентрации асимметричного диметиларгинина (АДМА) в сыворотке проводилось с помощью конкурентного ИФА (Immunodi-agnostik, Германия).
Подготовка образцов включает добавление ацилирующего реагента для связывания АДМА. Затем обработанные образцы и поликлональную анти-АДМА-антисыворотку инкубируют в лунках микропланшета, покрытых производным АДМА (трейсер). Во время инкубации АДМА конкурирует с трейсером, иммобилизованным в лунках, за связывание с поликлональными антителами. АДМА, присутствующий в образцах, не позволяет антителам связываться с трейсером. Таким образом, концентрация антител, связанных с трейсером, обратно пропорциональна концентрации АДМА в образце. Во время второй инкубации, в лунки вносят антитела, конъюгированные с пероксидазой, для выявления анти- АДМА антител. При промывке удаляется несвязавшийся конъюгат, а затем добавляется субстрат тетраметилбензидин. Затем энзимати-ческая реакция останавливается добавлением кислого стоп-раствора. Окрашивание изменяется с голубого на желтое, и оптическая плотность в лунках счи-тывается при длине волны 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания обратно пропорциональна концентрации АДМА в образце; это означает, что высокая концентрация АДМА в образце снижает количество антител, связавшихся с трейсером и, соответственно, оптическую плотность. Калибровочную кривую строят, используя полученные значения оптической плотности (при 450 нм) стандартов и соответствующие значения их концентраций. Концентрация АДМА, присутствовавшего в образцах, определяется непосредственно их калибровочной кривой. Определение С677Т-полиморфизма гена МТГФР проводилось методом ПЦР-ПДРФ в лаборатории кафедры биохимии ФФМ МГУ имени М.В.Ломоносова.
Сначала геномная ДНК из проб венозной крови, стабилизированной ЭДТА, была выделена стандартным методом с обработкой протеиназой К и последующей экстракцией ДНК смесью фенола и хлороформа или на сорбенте. При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовалось около 50 нг геномной ДНК в каждой реакции.
Полиморфность генов определялась с помощью метода ПДРФ (полиморфизм длины рестриктных фрагментов) и аллель-специфичной ПЦР.
После горячего старта и первой денатурации (94С, 5 мин) проводили амплификацию из 35 циклов, каждый из которых включал: денатурацию (95С, 10 сек), отжиг праймеров (60С, 12 сек), элонгацию (72С, 12 сек). ПЦР проводили в смеси объемом 25 мкл, включавшей по 4 пмоль каждого праймера (5 GA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3 и 5 -AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3 ), 200 мкМ каждого вида дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ), 1 мкл (около 50 нг) геномной ДНК и ПЦР смесь фирмы «Интерлабсервис». 8,5 мкл ПЦР-продукта длиной 198 п.н. инкубировали при 37С с 0,5 мкл (10 Ед.) рестриктазы Hinfl и 1 мкл 10-кратного буфера для рестрикции. Продукты рестрикции визуализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. Присутствие аллеля Т выявляли по наличию двух фрагментов 23 и 175 п.н., в то время как аллель С не содержит сайта рестрикции Hinfl. ПЦР проводилась на термоциклере Master Cycler Gradient фирмы Eppendorf. Размер фрагментов определялся с помощью стандарта массы 500 п.о. - Ladder (Life Technologies). 2.2. Экспериментальное исследование.
Экспериментальное исследование было проведено на базе Университета Южной Калифорнии, г. Лос-Анджелес, США (лаборатория под руководством профессора Janos Peti-Peterdi, MD, PhD). Научная стажировка была финансирована Правительством РФ в рамках программы для стипендиатов Президента РФ и проходила в период с января по ноябрь 2011 г.
Изучалось влияние избыточной массы тела на изменения плазменного и мочевого уровней сукцината при остром повреждении почек, вызванном ише-мией-реперфузией. Моделирование повреждения проводилось с помощью одностороннего полного клипирования левой почечной ножки продолжительностью 45 мин. Данная модель ишемии-реперфузии почек является стандартной и общепринятой. Эксперимент проводился только на самцах, так как известно, что женский организм, ввиду физиологических особенностей, более устойчив к острому повреждению почек. Кроме того, проводилось моделирование так называемой «теплой» ишемии-реперфузии, как наиболее близкого к нормальным физиологическим условиям варианта повреждения. При «холодной» ишемии-реперфузии отмечается менее выраженное повреждение: такая модель традиционно используется для моделирования острой нефропатии трансплантата.
Согласно литературным данным, реперфузионное повреждение развивается в течение 6 часов. В связи с тем, что одной из задач исследования являлась оценка динамики изменений плазменного и мочевого уровня сукцината в первые часы формирования острого повреждения почки, сбор образцов проводился в первые 6-8 часов после снятия зажима.
Сукцинат является одним из промежуточных метаболитов цикла Кребса. Его концентрация повышается при различных состояниях, прежде всего, связанных с гипоксией и оксидативным стрессом. В последние годы сукцинат рассматривается как патогенетический фактор и маркер повреждения почек (Peti-Peterdi J, 2010).
Определение факторов риска развития хронической болезни почек 1-Ша стадий у больных ожирением
Таким образом, у больных ожирением гомозиготное носительство патологического 677Т-аллеля гена МТГФР ассоциировано с более выраженным ожирением, характеризуется повышенной концентрацией асимметричного ди-метиларгинина и инсулина в сыворотке крови, а также увеличивает риск гипертрофии интимы-медии в 3,33 (1,13-5,53; 95% ДИ) и риск формирования ХБП I-Ша стадий в 2,60 (1,32-3,88; 95% ДИ) раза. Таким образом, среди показателей липидного, пуринового обменов, ин-сулинорезистентности, АГ, эндотелиальной дисфункции и ремоделирования сосудов предикторами развития ХБП 1-Ша стадий, повышения мочевой экскреции альбумина и снижения функции почек являются НОМА-индекс, сывороточные уровни инсулина, С-пептида, мочевой кислоты и асимметричного диме-тиларгинина.
Среди ассоциированных с ожирением состояний наибольшее значение в формировании ХБП ранних стадий имеют метаболический синдром, как отражение совокупности состояний, в основе патогенеза которых лежит инсулино-резистентность, и синдром обструктивного апноэ во время сна, характеризующийся эпизодами гипоксии-реоксигенации, приводящими к усугублению эндотелиальной дисфункции и усилению сосудистого ремоделирования. 3.2. Результаты экспериментального исследования.
С целью изучения влияния избыточной массы тела на процесс острого повреждения почек, вызванного ишемией-реперфузией, одного из механизмов развития хронического заболевания почек, изучались плазменный и мочевой уровни сукцината. Кроме того, модель ишемии-реперфузии по механизмам повреждения сходна с гипоксией-реоксигенцией при синдроме обструктивного апноэ во время сна, который, как было показано в клиническом исследовании, приводит к эндотелиальной дисфункции и ремоделированию сосудов, способствуя формированию ХБП ранних стадий. Сукцинат является одним из хорошо изученных маркеров состояния ишемии (гипоксии) и рассматривается как па-ракринный фактор развития повреждения почек.
Следующие показатели исследовались как в сравнении между группами животных, так и динамике в каждой из групп: скорость мочеобразования (как маркер функции почек), плазменная концентрация сукцината, мочевая экскреция сукцината (МЭС), а также относительное изменение МЭС по отношению к базальному уровню и общий мочевой клиренс сукцината.
В обеих экспериментальных группах скорость мочеобразования прогрессирующе увеличивалась со стороны интактнои почки с пиковыми значениями через 3 часа после ишемии и позже (рис. 3.18). В контрольной группе наблюдалась сходная динамика изменений со стороны обеих почек: максимум в 3-часовой точке и снижение мочеобразования к 6-часовой (рис. 3.18, 3.19). Скорость мочеобразования со стороны постишемической почки в обеих группах крыс с нормальным (ИР-1) и избыточным весом (ИР-2) достигала максимальных значений через 3 часа периода реперфузии и далее снижалась, причем к 8 часам мочеотделение было минимальным или отсутствовало (в группе ИР-2), что свидетельствовало о развитии анурии/олигурии и было отражением формирования острого повреждения почки (рис. 3.20).
При сравнении плазменной концентрации сукцината выявлено, что его базальный уровень у исследованных крыс, в т.ч. в контрольной группе, был значимо выше, чем у крыс, не подвергшихся парентеральному наркозу и хирургическим манипуляциям (рис. 3.21), что могло быть обусловлено гиповентиля-ционной гипоксией в результате наркоза или оперативными процедурами. Таким образом, плазменный уровень сукцината может быть чувствительным к системной гипоксемии.
При изучении динамики изменений плазменного уровня сукцината в группе с нормальным весом (ИР-1) обнаружено пиковое повышение его концентрации в 3 часа периода реперфузии без статистически значимых изменений позднее (рис. 3.22). H.y) 500 400 300
В группе с избыточным весом наблюдалось прогрессирующее повышение уровня сукцината с максимальными значениями через 6 часов после ишемии без статистически значимых изменений позднее (рис. 3.23).
При изучении динамики изменений мочевой экскреции сукцината в группе с нормальным весом не выявлено статистически значимых колебаний в по-стишемической почке (рис. 3.24). При этом наблюдались значимое повышение экскреции со стороны интактной почки: пиковые значения приходились на период 1-3 часа после ишемии (рис. 3.25).
Динамика изменений мочевой экскреции сукцината (МЭС) после ишемии со стороны интактной почки (группа ИР-1). В группе с избыточным весом также наблюдались статистически значимые колебания МЭС только со стороны интактнои почки с максимальными значениями в 5-часовой точке периода реперфузии (рис. 3.26).
Влияние полиморфизма гена МТГФР на раннее ремоделирование сосудов и формирование хронической болезни почек 1-Ша стадий у больных ожирением
Исследования последних лет указывают на то, что ишемия-реперфузия приводит не только к острому повреждению, но и является одним из механизмов возникновения и прогрессирования хронического поражения почек вплоть до терминальной почечной недостаточности (Kelly KJ и соавт., 2010; Yang L и соавт., 2011; Смирнов А.В. и соавт., 2009). Кроме того, ввиду пандемии ожирения, актуален вопрос о влиянии избыточного количества жировой ткани на такие типовые механизмы повреждения тканей, как ишемия и гипоксия. Это влияние может быть обусловлено, прежде всего, продукцией жировой тканью большого числа биологически активных веществ.
С целью изучения влияния избыточной массы тела на процесс острого повреждения почек, вызванного ишемией-реперфузией, в данной работе изучались плазменный и мочевой уровни сукцината. Кроме того, модель ишемии-реперфузии по механизмам повреждения сходна с гипоксией-реоксигенцией при синдроме обструктивного апноэ во время сна, который, как было показано в клиническом исследовании, приводит к эндотелиальной дисфункции и ремо-делированию сосудов, способствуя формированию ХБП ранних стадий.
Сукцинат является одним из маркеров состояния ишемии (гипоксии) и рассматривается как паракринный фактор развития повреждения почек. В последние годы все большое внимание привлечено к сукцинату благодаря открытию его специфического рецептора GPR91. Данный рецептор широко распространен в различных органах и тканях млекопитающих, в том числе человека. В наибольшей степени он локализован в почках, печени и жировой ткани (Regard JB и соавт., 2008; Robben JH и соавт., 2009).
Внутриклеточные эффекты этого рецептора опосредованы G-белком и проявляются активацией транскрипции различных факторов. Известно, что сукцинат является одним из промежуточных метаболитов цикла Кребса. Его концентрация повышается при различных состояниях, прежде всего, связанных с гипоксией и оксидативным стрессом. Рост внутриклеточной концентрации сукцината объясняют ингибированием сукцинатдегидрогеназы при состояниях нарушения аэробного дыхания в митохондриях. Одним из недавно открытых триггеров тканевой аккумуляции сукцината является гипергликемия. С помощью мультифотонной микроскопии было показано, что гипергликемия через активацию рецептора сукцината вызывает секрецию ренина в юкстагломеру-лярном аппарате, что, например, может играть роль в формировании артериальной гипертензии при сахарном диабете и метаболическом синдроме (Peti-Peterdi J, 2010).
Следует подчеркнуть, что проведенное экспериментальное исследование, посвященное изучению сукцината, как маркера острого повреждения почек при ишемии-реперфузии, являлось оригинальным и не имело аналогов в литературе.
Патогенез острого повреждения почек, вызванного ишемией-реперфузией, главным образом, связан генерацией свободных радикалов (супероксид-аниона, перроксинитрита, оксида азота) и депрессией антиоксидант-ной системы в период реперфузии в связи с притоком крови, богатой кислородом, в ишемизированные ткани (Bonventre JV и соавт., 2011; Versteilen и соавт., 2004). Кроме того, наблюдаются такие последствия гипоксии, как дестабилизация клеточных мембран, инактивацию белков, дисфункцию митохондрий, тканевой ацидоз и накопление различных метаболитов. Последние, как показывают исследования, могут являться не просто продуктами обмена, но и важными паракринными факторами, опосредующими адаптационные изменения, которые впоследствии могут вызвать повреждение тканей. Возникает нарушение NO-опосредованной регуляции тонуса сосудов, проницаемости капилляров, внутрисосудистой свертываемости, обусловленное развитием эндотелиальной дисфункции. Накопление большего числа хемоаттрактантов приводит к миграции иммунных клеток с развитием воспалительной инфильтрации и оксидатив-ного повреждения. В зависимости от преобладания тех или иных цитокинов такое воспаление может персистировать и нарушать регенерационные процессы в почке, приводя к фиброзированию тканей с прогрессирующим падением фильтрационной функции (Sharfiiddin АА и соавт., 2011). При этом большее значение может иметь эндотелиальная дисфункция, так как показано сохранение обедненного почечного коркового кровотока в первые 4 недели после эпизода ишемии (Horbelt М и соавт., 2007).
В данной работе изучались скорость мочеобразования, как показатель основной функции почек, и плазменная и мочевой уровни сукцината для построения кривой изменений во времени в период реперфузии.
Показано, что через 6-8 часов после ишемии образование мочи прекращается. Это свидетельствовало о развитии анурии/олигурии и было отражением формирования острого повреждения почки, что соответствовало экспериментальным данным других исследований.
При сравнении плазменной концентрации сукцината выявлено, что его базальный уровень у исследованных крыс, в т.ч. в контрольной группе, был значимо выше, чем у крыс, не подвергшихся парентеральному наркозу и хирургическим манипуляциям, что могло быть обусловлено гиповентиляционной гипоксией в результате наркоза или оперативными процедурами. Таким образом, плазменный уровень сукцината может быть чувствительным к системной ги-поксемии.
При изучении динамики изменений плазменного уровня сукцината в группе с нормальным весом обнаружено пиковое повышение его концентрации в 3 часа периода реперфузии без статистически значимых изменений позднее. В группе с избыточным весом наблюдалось прогрессирующее повышение уровня сукцината с максимальными значениями через 6 часов после ишемии также без статистически значимых изменений позднее.
При изучении динамики изменений мочевой экскреции сукцината в группе с нормальным весом не выявлено статистически значимых колебаний в по-стишемической почке. При этом наблюдались значимое повышение экскреции со стороны интактной почки: пиковые значения приходились на период 1-3 часа после ишемии. В группе с избыточным весом также наблюдались статистически значимые колебания МЭС только со стороны интактной почки с максимальными значениями в 5-часовой точке периода реперфузии.
В контрольной группе наблюдалась динамика экскреции сукцината, близкая к статистически значимой, со сходными показателями со стороны обеих почек, но вариабельность этих значений была значимо ниже, чем в экспериментальных группах. Учитывая, что не выявлено значимых колебаний плазменной концентрации, можно говорить о влиянии системной гипоксемии, вызванной гиповентиляцией в результате длительного наркоза.
Таким образом, было показано, что в изученной модели ишемии-реперфузии мочевая экскреция сукцината не являлась маркером повреждения со стороны постишемической почки, что, вероятно, обусловлено нарушением экскреции сукцината. Нарушение экскреции сукцината может быть связано как непосредственно с острой канальцевой дисфункцией, так и с тканевым ацидозом, который, как известно, снижает активную секрецию сукцината тубулоци-тами (Packer RK и соавт., 1995). В свою очередь, накопление сукцината в ткани поврежденной почки могло приводить к повышению плазменной концентрации и экскреции сукцината интактной почкой, что и наблюдалось в данном исследовании.
Кроме того, можно говорить о влиянии избытка жировой ткани на течение почечного повреждения, вызванного ишемией-реперфузией, так как у крыс с избыточной массой тела отмечались более поздние пиковые значения плазменной концентрации и мочевой экскреции сукцината.
