Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1. Изучение наследования СПЯ 14
1.1 .Теория фенокопии 15
1.2. Кариотип. Хромосомные (цитогенетические) исследования СПЯ 16
1.3.Поиск генной патологии. Клинико-генетические исследования, определяющие тип наследования СПЯ 17
1.3.1. Фенотип женщин. Фенотип мужчин 17
1.3.2. Аутосомно-доминантный тип наследования 18
1.3.3. Х-сцепленное наследование СПЯ Накопление комплекса эндокринопатий в семье. Опровержение моногенного типа наследования СПЯ 19
1.3.4. Близнецовые исследования 20
2. Поиск генов-кандидатов, формирующих патогенетические нарушения при СПЯ 21
2.1. Изучение полиморфных маркеров генов, ответственных за синтез и действие стероидных гормонов при СПЯ 22
2.1.1. Ген CYP 17 ' 24
2.1.2. Ген CYP11A 25
2.1.3. Ген CYP21 26
2.1.4. Ген HSD17ВЗ 27
2.1.5. Ген Р450агот (ароматазы) 28
2.1.6. Гены HSdl IB 1 и гексозо-6-фосфатдегидрогеназы 28
2.1.7. Ген GR (рецептора глюкокортикоидов) 28
2.2. Изучение полиморфных маркеров генов, ответственных за синтез и регуляцию действия половых гормонов, гонадотропинов, их рецепторов при СПЯ 28
2.2.1. Гены гонадотропинов и их рецепторов 28
2.2.2. Ген рецептора допамина \. 29
2.2.3. Ген сексстероидсвязывающего глобулина (SHBG) 30
2.2.4. Ген а-редуктазы (SRD5A) 32
2.2.5. Рецептор андрогенов (AR) 32
2.2.6. Ген альдостеронсинтетазы 34
2.3. Изучение полиморфных маркеров генов, ответственных за синтез и действие инсулина, регуляцию массы тела 35
2.3.1. Ген рецептора инсулина (INSR) 39
2.3.2. Гены субстратов инсулинового рецептора (IRS-1, IRS-2) 41
2.3.3. Ген инсулина (INS) 45
2.3.4. Гены инсулиноподобных факторов роста и их рецепторов 48
2.3.5. Ген гликогенсинтетазы 52
2.3.6. Ген рецептора, активируемого пролифератором пероксисому..52
2.3.7. Ген параоксоназы (PON1) 54
2.3.8. Ген лептина и его рецептора (LEP и LEPR) 55
2.3.9. Ген гомолога сорбина и домена, содержащего ген SORB 56
2.3.10. Гены р2 - и Рз-адренорецепторов 56
2.3.11. Ген калпаина-10 58
2.4.Изучение полиморфных маркеров генов, ответственных за синтез и действие медиаторов воспаления, факторов свертывания крови, генов главного комплекса гистосовместимости 59
2.4.1 Ген фактора некроза опухоли-а (TNF-a) 60
2.4.2 Ген интерлейкина -1 {IL-1A, IL-1B) 61
2.4.3 Гены интерлейкина -6 и его рецептора (IL-6, IL6R-a, IL6R-p)..62
2.4.4 Ген интерлейкина -18 (IL-18) 64
ГЛАВА 2. Материалы и методы
1. Объект исследования и клинические методы исследований 65
2. Функциональные методы исследований 66
2.1. Ультразвуковое исследование 66
2.2. Биохимические исследования 66
2.3. Гормональные исследования 67
3. Молекулярно-генетический анализ 67
4. Клинико-генеалогическое исследование 68
5. Статистическая обработка и анализ полученных материалов 70
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 71
1. Клиническая характеристика участниц исследования 71
2. Тип наследования СПЯ. Влияние наследственных факторов на течение СПЯ 75
3. Влияние носительства полиморфных маркеров в основных генах-кандидатах на течение и особенности СПЯ 83
3.1. Исследование полиморфизма (ttttajn в гене CYP11A у больных СПЯ...84
3.2. Исследование полиморфизма (CAG)n в гене AR у больных СПЯ 88
3.3. Исследование VNTR полиморфизма в гене INS у больных СПЯ: 94
3.4. Исследование полиморфных маркеров в гене IRS-1 у больных СПЯ... 103
3.4.1. Полиморфизм А 1а513Рго в гене IRS-1 у больных СПЯ 104
3.4.2. Полиморфизм Gly972Arg в гене IRS-1 у больных СПЯ 107
3.5. Исследование полиморфизма Glyl057Asp IRS-2 у больных СПЯ 111
3.6. Исследование полиморфизма Pro 12Ala в гене PPARy у больных СПЯ 116
Заключение .124
Выводы 130
Практические рекомендации 132
Список литературы
- Кариотип. Хромосомные (цитогенетические) исследования СПЯ
- Изучение полиморфных маркеров генов, ответственных за синтез и действие стероидных гормонов при СПЯ
- Функциональные методы исследований
- Влияние носительства полиморфных маркеров в основных генах-кандидатах на течение и особенности СПЯ
Введение к работе
СПЯ - распространенная эндокрино-гинекологическая патология, полиморфная по клиническим характеристикам, поражающая до 10% женщин репродуктивного возраста, до 75% пациенток с эндокринным бесплодием. Поскольку СПЯ приводит к нарушению фертильности, сопровождается психологическими проблемами и снижением качества жизни пациенток, связан с увеличением риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, ожирения и сахарного диабета, изучение причинных факторов и поиск эффективных путей профилактики является актуальной медико-социальной задачей.
Согласно Всемирному консенсусу в Нидерландах (2003) под руководством Европейского Общества Репродукции Человека и Эмбриологии и Американского Общества Репродуктивной Медицины, основными признаками заболевания считаются хроническая олиго- ановуляция и гиперандрогения, т.е. характеристики, отражающие патологические изменения в репродуктивной сфере, в то время как СПЯ - это и комплексное нарушение метаболизма: у 40% больных старше 40 лет обнаруживается нарушение толерантности к глюкозе или сахарный диабет (СД), у 50% - инсулинорезистентность (ИР), у 44-60%) имеются различные формы ожирения и дислипидемии (Ehrmann D.A., Azziz R., 2006; Reaven G.M. 2001; Сметник В. П., 2001; Kovacs G.,2000; Franks SJ995). При длительном течении СПЯ значительно увеличивается риск развития ССЗ (атеросклероз и острый ишемический инфаркт миокарда, OR-8, артериальная гипертония OR~6), а также онкологических заболеваний репродуктивных органов (карцинома эндометрия, OR=5,3) (KoustaE., 2005, TalbottE. 2004; Legro R, 2003; Wild К. 2002).
СПЯ изучается более ста лет, за это время исследователями разных стран
было отмечено, что заболевание значительно, чаще поражает родственников и
передается в ряду поколений, зачастую в комплексе с другими эндокринопатиями
(ожирение, ИР, СД 2 типа), что определило понятие СПЯ как наследственной
патологии. Было уделено большое внимание изучению генетической этиологии
синдрома, поиску общих генетических детерминант с другими
дисметаболическими состояниями, но до настоящего момента генетическая этиология СПЯ не определена. Было показано, что СПЯ не имеет моногенного или сцепленного с полом типа наследования, а наиболее вероятно, носит характер многофакторного заболевания со значимым влиянием факторов внешней среды, основными из которых считаются малоподвижный образ жизни и избыток легкоусвояемых углеводов и насыщенных жиров в питании, ожирение во время беременности у матери (Sam S., 2006; Escobar-Morreale К,2005; Kovacs G.,2000).
Основная масса работ по изучению генетической этиологии основывается на исследовании возможных генов-кандидатов, реализующих основные патогенетические' механизмы заболевания, что стало возможным благодаря завершению в 2000г. секвенированию генома человека. Наиболее перспективным направлением стало изучение полиморфных маркеров генов (полиморфизмов) -т.е. личностных особенностей, вариаций генов, которые встречаются- в здоровой популяции, однако при определенных условиях могут формировать предрасположенность, организма к действию внешних факторов, опосредуя развитие заболевания. Перспективными направлениями считаютсяизучение генов ферментов, вовлеченных в стероидогенез и определяющих чувствительность к андрогенам; генов, участвующих в продукции и метаболизме инсулина, а также генов медиаторов воспаления и факторов, регулирующих массу тела. (Dimaif А. 2006; Escobar-Morreale H.F.,2005; Franks S..200J; Witchel S., 2001; Legro R., 1999).
В настоящее время уделяется большое внимание изучению генетической связи гиперандрогении, инсулинорезистентности, ожирения у больных СПЯ. ИР характерна для большого процента больных СПЯ, значительно увеличиваясь у пациенток с нарушениями жирового обмена, роль ее в развитии гиперандрогении и СПЯ находится на стадии изучения. Предполагается как и первичное влияние ИР и гиперинсулинемии на гиперплазию клеток theca interna и увеличение уровня -секреции андрогенных фракций в яичниках (учитывая данные об- общности рецепторов к инсулину и ИФР-1), так и существование единого патологического дефекта (серинового фосфорилирования) цитохрома Р450с17а и инсулинового рецептора, одномоментно приводящего к развитию и ИР, и гиперандрогении.
(Dunaif A.2006; San Millan J.L.,2004; Azziz R, 2002; Ehrmann D, 2001; Franks S..2001; Witchel S., 2001; Nestler J.E., 1997)
Зарубежом генетическая этиология СПЯ исследуется пристально. В работах многих независимых исследователей резюмируется, что полиморфные маркеры в CYP17, AR, IGF-1, VNTR INS, PPARy, TNF, IL-6 ассоциированы с развитием СПЯ (Kousta Е., 2005; Escobar-Morreale H.F.,2005; San Millan J.L.,2004; XitaN,2003; Azziz R, 2002; Ehrmann D, 2001; Franb S.2001; Witchel S, 2001), a гены ароматазы (CYP19), В-субъединицы ЛГ (LHfi), В-ФСГ (FSHfi), фоллистатина, гликогенсинтетазы, рецептора дофамина (DRD2), лептина (LEP), калпаина (CAPN10) не являются маркерами СПЯ (Escobar-Morreale H.F.,2005; Kousta К, 2005; Petry C.J. 2005; Rajkhowa M, 2005; Ehrmann D, 2002). Роль полиморфизмов генов Пагидроксилазы^СГР^, фактора некроза опухолей (TNF), субъединиц рецептора инсулина (IRS) и других в настоящий момент до сих пор остается предметом дискуссии. (Petry С.J., 2007; Escobar-Morreale H.F.,2005; Ehrmann D, 2002; Witchel S., 2001; Gharani N, 1996). Существующий подход изучения одного полиморфизма уступает место изучению геномных вариантов, сочетаний полиморфных маркеров.
Исследования по проблеме генетической этиологии и наследованию СПЯ, в основном, выполнены в зарубежных странах. Выполненных работ в России единицы, причем объектом изучения является проблема гиперандрогении в целом, а не конкретно СПЯ (Панфилова Е.В., 2006).
Таким образом, представляет большой интерес изучение генетических аспектов наследования СПЯ и его метаболических компонентов, что позволит прогнозировать возможное развитие заболевания у лиц, имеющих отягощенный семейный анамнез по СПЯ, а учитывая предполагаемые патологические изменения, согласно выявляемым особенностям в определенных генах, оптимизировать тактику ведения пациенток.
Цель работы: Изучение наследования СПЯ и роли полиморфных маркеров генов-кандидатов, кодирующих продукцию и чувствительность тканей к инсулину и глюкозе (IRS-1, IRS-2, INS VNTR, PPARy), и влияющих на активность стероидогенеза и метаболизм андрогенов (CYP11A, AR) в развитии СПЯ и формировании клинико-гормональных характеристик заболевания.
В задачи исследования входило:
Оценить тип наследования СПЯ;
Оценить частоту наследования СГЩ СД 2 типа и ожирения в семьях с СПЯ и их влияние на особенности течения- СПЯ у пробандов.
Оценить роль (tttta)n STR полиморфизма в: гене GYPT1A в характере стероидной секреции и формировании клинических признаков гиперандрогении у больных СПЯ:
Оценить роль (CAG)n VNTR полиморфизма в гене AR в«формировании клинических признаков гиперандрогении у больных СПЯі
Оценить, роль, полиморфных маркеров генов; IRS-1, IRS-2, INS в:> развитии нарушений углеводного обмена - и чувствительности к инсулину, в формировании клинических признаков СПЯ:
Оценить, роль полиморфизма Pro 12Ala, в гене PPARy в; развитии нарушений углеводного и жирового обменов и: формировании клинических признаков СПЯ.
Научная новизна исследования. В' представленной работе впервые проведено комплексное гормональное, метаболическое и молекулярно-генетическое исследование и проанализирована роль полиморфных маркеров генов JRS-I (snp -513 и -972), IRS-2 (snp -1057), INS- VNTR, PPARy (snp -12), STR CYP11A, VNTR AR в развитии заболевания и его признаков у больных СПЯ условно русской популяции. Путем' генеалогического анализа установлено, что наследование СПЯ в большинстве случаев не соответствует менделевским. типам наследования. Показана высокая частота встречаемости СПЯ и других дисметаболических эндокринопатий (ожирения, СД 2 типа) в семьях.больных СПЯ;
'.'''' 9 '
Проведено сопоставление клинических, гормональных и молекулярно-генетических признаков данного заболевания. Определена частота носительства полиморфизма генов IRS-1 (snp -513 и -972), IRS-2 (snp -1057), INS VNTR, PPARy (snp -12), STR CYP11A, VNTR AR при СПЯ. Показано отличие в частоте встречаемости полиморфных маркеров генов INS VNTR (III/III), STR CYP11A, VNTR AR при СПЯ от распределения у здоровых женщин. Доказана взаимосвязь полиморфизма INS VNTR с развитием гиперинсулинемии и инсулинорезистентности у больных СПЯ, ассоциация полиморфизма PPARy с ожирением и перераспределением жировой ткани у больных СПЯ, изменением чувствительности к инсулину.
Положения, выносимые на защиту
Частота новых случаев СПЯ в семьях больных (семейных случаев) превышает популяционную, у родственников 1 степени родства составляет 61,2%. Родственницы больных СПЯ (потомки) являются группой риска по развитию СПЯ. Биохимические признаки гиперандрогении имеют большую выраженность у больных СПЯ с отягощенной наследственностью по данному заболеванию.
Частота развития инсулинорезистентности у больных СПЯ, родители которых имеют СД 2 типа, в 3 раза превышает возникновение нарушений чувствительности к инсулину у больных без отягощенной наследственности по СД 2 типа (ОШ 5,4 [ДИ 95% 1,9-15,5]).
Частота ИР у больных СПЯ, по данным показателей HOMA-IR и Саго и орального глюкозотолерантного теста, составляет 52,2%. Полиморфный маркер INS VNTR (генотип III/III) ассоциирован с развитием инсулинорезистентности и гиперинсулинемии при СПЯ.
По данным биометрии в 24% случаев СПЯ сочетается с абдоминальной формой ожирения. Полиморфизм РгоПАІа PPARy (генотип Pro/Ala) ассоциирован с развитием ожирения и перераспределением жировой ткани по абдоминальному типу у больных СПЯ.
Практическая значимость. Полученные данные показали высокую частоту наследственной передачи СПЯ. Это позволяет рекомендовать девочкам-подросткам и девушкам с отягощенным семейным анамнезом проведение медицинского контроля и профилактики факторов, способствующих развитию заболевания, таких как гиподинамия, избыточный вес, гиперкалорийная диета в пре- и пубертатный период.
Для лиц с повышенным риском СПЯ представляется целесообразным проведение ранних профилактических мероприятий, индивидуализированных с учетом факторов риска, а в дальнейшем, возможно, и с учётом данных генотипирования по полиморфизму генов, предрасполагающих к нарушениям углеводного (INS VNTR) и жирового (PPARy) обменов.
Реализация работы и ее апробация. Основные результаты исследования, изложенные в диссертации, были доложены на ежегодной конференции молодых ученых (Москва, ЭНЦ РАМН, 2005г, 2007г). Результаты работы были представлены на V-м съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), V Всероссийском конгрессе эндокринологов и межотделенческой научной конференции ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий (16 ноября 2007года, Москва, РФ).
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, 1 принята в печать.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста, иллюстрирована 32 таблицами и 14 рисунками. Работа состоит из следующих разделов: оглавление, введение, обзор литературных данных, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Библиография содержит 21 отечественный источник и 177 зарубежных источника.
Кариотип. Хромосомные (цитогенетические) исследования СПЯ
Для изучения наследования заболевания в первую очередь используется клинико-генеалогический метод, при помощи которого оценивается распределение болезни в роду или в семье при условии известного родства между ее членами. Этот метод считается наиболее универсальным в медицинской генетике, так как позволяет установить существование наследственности признака, оценить пенетрантность, сцепление генов и позволяет расшифровать механизм их взаимодействия. Для составления родословных необходима четкая формулировки женского и мужского фенотипа заболевания.
Женский и мужской фенотип. Женский фенотип заболевания в настоящее время включает клинические признаки гиперандрогении (гирсутизм, андрогензависимая алопеция и дермопатия, в более тяжелых случаях барифония, изменение формы клитора), в сочетании с олигоановуляцией, которая клинически выражается патологией менструального цикла (возможны значительные вариации, что объясняется длительностью существования олигоановуляции и ее степенью, а также массой жировой ткани) - от опсоолигоменореи (наиболее типичное нарушение) и, как правило, вторичной аменореи, до менометроррагии и возможными жалобами на бесплодие. Дополнительным клиническим фактором служит выявление поликистозно-измененных яичников по данным сонографии малого таза {Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS consensus, 2004).
Сложности генеалогических исследований в наибольшей степени обусловлены отсутствием четких доказательств существования мужского эквивалента заболевания. Все выдвинутые характеристики мужского фенотипа СПЯ до сих пор носят характер предположения и значительно варьируют по комплексу описанных расстройств, что затрудняет трактовку родословных и обобщение разных исследований. Первоначально мужским эквивалентом заболевания считалось повышенное оволосение тела у мужчин, в дальнейшем различными исследовательскими группами практически одновременно было отмечено, что родственники-мужчины 1 ст. р. больных СПЯ в большей частоте случаев характеризуются наличием абдоминального ожирения вкупе с развившейся в молодости (ранее 35 лет) андрогензависимой алопецией (надлобно-теменная поверхность головы). Также, немного позднее при детальном изучении гормонально-биохимических изменений у родственников-мужчин было отмечено более частое наличие ИР (чем у сопоставимой по ИМТ и возрасту когорте мужчин) и больший уровень ДГЭА-С. В настоящее время согласно Роттердамскому консенсусу фенотипические характеристики СПЯ у мужчин включают в себя облысение, развившееся у соматически здоровых мужчин до 35 лет, абдоминальное перераспределение жировой клетчатки (абдоминальное ожирение), повышенное оволосение туловища, к вероятным признакам относятся олигоспермия и увеличенный уровень секреции ЛГ. {Rotterdam PCOS consensus, 2004; Yildiz В.0.2003; Legro R.S 2002, 2000; Franks S. 1995; Ferriman D. 1979)
Исследования, определявшие тип наследования синдрома как аутосомно-доминантный. Первое исследование, посвященное изучению семейного накопления и типу наследования синдрома было проведено в 1968г: обследовав и сравнив 18 семей пробандов европеоидной расы с СПЯ и 18 здоровых женщин, исследователи пришли к выводу, что СПЯ носит аутосомно-доминантный способ наследования, так как частота олигоменореи и поликистозных изменений яичников были значительно выше у родственников 1 ой ст. р. пациенток с СПЯ. Авторы отметили, что мужчины в этих семьях имели повышенное оволосение, предположив данное состояние как эквивалент мужского фенотипа {Balen А.2001; Cooper Н.Е., 1968). Возможность СПЯ как аутосомно-доминантной патологии подтверждалась потом не один раз и позднее в достаточно больших исследованиях, как например, в Норвегии среди 132 пациенток-норвежек с семьями, относительный риск ОР наследования синдрома у родственников первой степени родства больных составил 10,3, у мужчин выявлено раннее облысение и повышенное оволосение туловища. {Limde О. 1989). Однако в проведенных близнецовых исследованиях (см. ниже) аутосомно-доминантный способ наследования был достаточно четко опровергнут, что подтверждалось отсутствием в обоих случаях 100% сходства (конкордантности) монозиготных близнецов и меньшей, чем 50% (необходимой для такого типа наследования у дизиготных пар) конкордантностью у близнецов.
В исследованиях других авторов было показано, что высокую фамильную агрегацию имеют не только симптомы гиперандрогении, но и целый комплекс, видимо, взаимосвязанных метаболических расстройств (СД, дислипидемии, артериальной гипертензии и атеросклероза), было подчеркнуто, что у пациенток с СПЯ и у их родственников относительный риск ИБС и атерогенных сосудистых «катастроф», то есть инфаркта миокарда и инфаркта мозга выше в 7,4 раз, чем в общей популяции, ожирения и СД 2 типа в 3-7 раз, онкологических заболеваний яичников в 2,5 раза. (Konsta Е. 2005; Wild R.. 2002; Ovalle F., 2002; Rajkhowa M., 1997; Schildkraiit J.M. 1996) Было предположено, что наследование происходит по обеим линиям - отцовской и материнской, с последующей высокой степенью пенетрантности и экспрессии. Т.о., возможность Х-сцепленного типа наследования СПЯ стала более вероятной, чем аутосомно-доминантного способа.
В ряде работ этого периода времени, посвященных исследованию типа наследования СПЯ, {Yildiz В.О.2003; Azizz R, 2000; Hague W.M 1988; Ferriman D.1979) несмотря на подтверждение значительной частоты семейной передачи олигоменореи и гирсутизма, для СПЯ были отвергнуты все возможные типы наследования из существующих для моногенных заболеваний, таким образом, сложены предпосылки для трактовки синдрома как полигенной патологии. Что позднее будет выдвинуто как теория в работах Legro S. и соавторов, которые также обнаружили, что вместе с гиперандрогенией в большом проценте случаев наследуется инсулинорезистентность, вероятно, имея одинаковые механизмы патогенеза, сцепленные генетические дефекты, что приводит к их совместной передаче потомкам. Также было предположено, что тип нарушений менструальной функции у больных СПЯ не носит наследственного характера, а является проявлением тяжести заболевания. (Gambineri А. 2002; WitchelS., 2001)
Близнецовые исследования. В проведенном в Австралии близнецовом исследовании из 34 пар близнецов, больных СПЯ (19 моно- и 15 дизиготных) 11 пар были дискордантны, 23 пары конкордантны по синдрому, при этом монозиготные близнецы были конкордантны в большей степени, что свидетельствует о том, что СПЯ не на 100% определяется только наследственными факторами, а является мультифакториальным по своей природе заболеванием. Было показано, что уровень инсулина натощак, сывороточного андростерона, индекс массы тела, неблагоприятный липидный профиль были наиболее высокими у конкордантных по синдрому поликистозных яичников пар близнецов, что указывает на генетическую природу метаболических компонентов СПЯ, характеризуя тип наследования синдрома как полигенный с значительным влиянием факторов окружающей среды. {Jahanfar S. 1997; 1996)
Изучение полиморфных маркеров генов, ответственных за синтез и действие стероидных гормонов при СПЯ
Изучение полиморфных маркеров генов, кодирующих биосинтез и метаболизм стероидных гормонов, представляет одну из наиболее активных позиций изучения генетической природы СПЯ. Значительный интерес к данной группе генов обусловлен, во-первых, существующими теориями патогенеза СПЯ, а во-вторых обнаруживаемой у большинства пациенток с СПЯ активацией адреналового и яичникового стероидогенеза, что также продемонстрировано в экспериментальных работах с тканями яичников, полученных от больных {Rosenfield R.L., 1999; DunaifA.,1996).
Согласно одной из существующих на настоящей момент гипотез развития СПЯ, первичным в развитии синдрома является аномальная пульсовая секреция ГтРГ, которая в свою очередь, приводит к патологическому увеличению уровня продукции лютеинизирующего гормона по отношению к имеющемуся уровню фолликулостимулирующего гомона, что подтверждается клинически успешным использованием аналогов ГтРГ для лечения функциональной гиперандрогении. {Rosenfield R.L., 2004; Dimaif А., 2001 Пищулин А.А. 1999) Избыточный уровень ЛГ приводит к увеличению секреции андрогенов в яичниках, нарушению нормального роста и созревания фолликулов, что в результате приводит к гиперплазии клеток theca interna и клеток стромы и значительному уменьшению или атрофии гранулезной ткани. Клинически данное состояние будет выражаться олиго/ановуляцией и гиперандрогенией. {Witchel S.,1998) Согласно другой гипотезе, первичным дефектом является генетически обусловленные нарушения синтеза и метаболизма стероидных гормонов. Данная гипотеза косвенно подтверждается данными литературы о значительном увеличении секреции стероидов, опосредованных активностью цитохром Р450с17 энзимов в яичниках женщин с СПЯ в ответ на стимуляцию агонистами ГтРГ, и экспериментальными работами с изолятами клеток theca interna больных, которые при кратковременном и при длительном культивировании демонстрируют гораздо большую стероидогенную активность, чем клети theca interna, полученные от здоровых женщин. Увеличенная стероидогенная активность обусловлена усиленной транскрипцией генов, кодирующих стероидогенные энзимы, но до настоящего момента не известен фактор, приводящий к увеличению промоторной активности генов стероидных энзимов. {Siegel S.F.1990) Наиболее перспективным считается изучение генов CYP17 (17гидроксилаза/17,20-лиаза), в связи с тем, что данный фермент является ключевым в биосинтезе андрогенов в яичниках, и CYP11A (цитохром P450scc), учитывая, что фермент лимитирует весь каскад стероидогенеза, катализируя отщепление боковой цепи холестерина. Включение эти генов в число генов кандидатов обусловлено выявлением повышения 17а-гидроксилазной, и, в меньшей степени, 17,20-лиазной активности, что приводит к избыточной продукции андрогенов и их предшественников в яичниках (Манухин И.Б., 2004; Kovacs G.,2000; Пищулин A.A. 1999; Rosenfield R.L., 1994). Также в настоящее время предполагается существование дефекта работы фермента Р450с17а, обуславливающего его гиперактивацию, первичного (возможно генетически обусловленного) или вторичного, связанного с действием на фермент какого-либо фактора, приводящего к избыточному фосфорилированию сериновых окончаний энзима. {Dunaif А., 2006; Wickenheisser J.K., 2000). В своей работе мы остановились на изучении гена CYP11A.
Ген CYP 17: Лимитирующим моментом в биосинтезе андрогенов в яичниках и надпочечниках является энзим, называющийся Р450с17а, который обладает как 17а-гидроксилазной, так и 17,20лиазной активностью. Р450с17а катализирует превращение прегненолона и прогестерона в 17 гидроксипрегненолон и 17-гидроксипрогестерон соответственно, а данные стероиды - в дигидроэпиандростерон и андростендион. (Дедов И.И., 2000)
Большинство больных СПЯ имеют увеличенную овариальную и адреналовую активность Р450с17а, что демонстрируется комплексной стимуляцией надпочечников АКТГ и овариальной - гонадотропинами, а также последующим подавлением длительно действующими агонистами ГтРГ -трипторелином, при этом адреналовая активность не зависит от влияния функции яичников. {Пищулин А.А. 2004; Franks S., 1997; Escobar-Morreale H.F.,2005) В Учитывая это, ген, кодирующий энзим Р450с17а, CYP17, был расценен как ген кандидат СПЯ одним из первых. (Kovacs G.,2000) CYP 17 локализован на 10q24.3 (Franks S., 1997) его промоторный участок содержит SNP Т/С в -34 паре оснований, который может регулировать активность энзима, а именно замена на цитозин может приводить к увеличению промоторной функции. В части исследований была обнаружена связь SNP с развитием СПЯ, при этом было показано, что носители гомозиготного генотипа С/С имеют значительное увеличенный уровень тестостерона. В исследованиях Franks S., (1997); Liovic М., (1997); Witchel S., (1998), замена оснований не была связана с изменениями клинической картины и уровнем стероидогенной активности в яичниках, таким образом, по мнению указанных независимых исследователей; данный полиморфизм не несет функциональной роли в развитии ГА. В большом семейном исследовании {Urbanek М, 1999) не было найдено свидетельств связи между СПЯ и локусом CYP 17.
Функциональные методы исследований
Ультразвуковое исследование органов малого таза всем пациенткам проводилось в отделе лучевой диагностики ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий (Зав.-д.м.н. Воронцов А.В.) с помощью ультразвуковых приборов Hewlett Packard Image Point (США), Agilent Sonos 4500 (США) с использованием линейного трансабдоминального датчика с частотой 3,5 МГц и трансвагинального датчика с частотой 5,0-7,0 МГц. Эхография по общепринятой методике. Производилось измерение размеров и объема органов по формуле: V=7i/6xlx2x3 (смЗ).
Биохимические исследования проводились в лаборатории клинической биохимии ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий (Зав.- Ильин А.В.). Липиды и глюкоза в сыворотке крови определялись при помощи анализатора Hitachi 912 по стандартной методике. Для исследования углеводного обмена и чувствительности к инсулину всем обследуемым выполнялся стандартный пероральный тест толерантности к глюкозе с определением базальных уровней глюкозы (Глк) и ИРИ в плазме венозной крови натощак и через 120 мин, после нагрузки 75 г сухой глюкозы, предварительно разведенной в 250 мл воды. Кроме этого, оценка состояния углеводного обмена проводилась с помощью расчетных показателей: Индекс Саго = Глюкоза плазмы натощак (ммоль/л)/ ИРИ плазмы натощак (мкЕд/мл). Показатели 0,33 указывают на наличие инсулинорезистентности.
Модель гомеостаза (Homeostasis Model Assessment) HOMA-IR= Уровень РІРИ плазмы натощак (мкЕд/мл) х уровень глюкозы плазмы натощак (ммоль/л) / 22,5; в баллах. Показатель 2,18 указывает на наличие инсулинорезистентности.
Гормональные исследования проводились в лаборатории гормонального анализа ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологии (Зав.- д.м.н., проф. Гончаров Н.П.). Гормональные исследования проводились при первичном обследовании больных натощак в утренние часы (8-9ч.) в раннюю фолликулярную фазу или на фоне опсоменореи/аменореи. Содержание ЛГ, ФСГ, ПРЛ, Т, Э2 в крови определялось методом усиленной люминесценции автоматизированной системой «Витрас», (Джонсон_Джонсон), референсные значения для ЛГ: 3,0 - 12,0 Ед/л, ФСГ: 1,6 -6,0 Ед/л, ПРЛ: 90 - 540 мЕд/л, Т: 0,1 - 2,8 нмоль/л, Э2 : 50 - 620 пмоль/л). Уровень 17-гидроксипрогестерона (17 — ОНП) определялся радиоиммунным методом с использованием коммерческих наборов фирмы «Immunotech», референсные значения: 1,1-3,5 нмоль/л. Секс-стероид связывающий глобулин (СССГ, 16-120 нмоль/л), дегидроэпиандростерон-сульфат (ДГЭА-С, 1000 - 5500 нмоль/л) и иммунореактивный инсулин (ИРИ, N 3,0 - 25,0 мкЕд/мл) определялись методом электрохемилюминесценции автоматизированной системой «Элексис», (Рош). Расчет содержания свободного тестостерона проводился по формуле: Тестостерон/СССГ х 100%, (N 4,0%).
3. Молекулярно-генетический анализ. Всем участникам исследования было проведено молекулярно-генетическое тестирование полиморфизмов в генах инсулина INS (VNTR), субстратов инсулинового рецептора 1- IRS-1 (Рго513А1а, Gly972Arg) и 2- IRS-2 (Glyl057Asp), рецептора фактора пролиферации пероксисом PPARy (РгоПАІа), фермента отщепления боковой цепи- P450scc {CYP11A STR (tttta)n), гена рецептора андрогенов AR (VNTR (CAG)n) .
Выявление полиморфизмов генов IRS-1 (Pro513Ala, Gly972Arg) и 2- IRS-2 (Glyl057Asp) проводили в лаборатории иммуногенетики ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологии (Зав.- к.м.н. Прокофьев С.А.) Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови пациенток по модифицированной методике N.J. Gemmell и S. Akiyama (высаливание хлористым литием).
Исследование полиморфизма генов субстратов инсулинового рецептора 1 -IRS-1 (Pro513Ala, Gly972Arg) и 2- IRS-2 (Glyl057Asp) проводилось путем амплификации соответствующего участка ДНК при помощи ПЦР и эндонуклеазной ферментативной рестрикции с соответствующей эндонуклеазой/рестриктазой. Полиморфизм длины фрагментов рестрикции выявлялся при анализе продуктов в агарозном геле. Праймеры к полиморфизму IRS-1 Pro513Ala: 5 GCGGTGAGGAGGAGCTAAGC 3 1972, У GGGCAG GGTCAGGAGTCACCG 5 2220, IRS-1 Gly972Arg: 5 CTTCTGTCAGGT GTCCATCC 3 3358, 3 CGATGCACCTGTGGAGCGGT 5 3601. Праймеры IRS-2 Glyl057Asp: 5 GGAGCTGTACCGCCTGCC 3 и 3 ACCAAAAGCCATCTCGGTGT5 Молекулярно-генетические исследования полиморфизма INS (VNTR), PPARy (Pro 12Ala), P450scc (CYPllA STR (tttta)n), AR (VNTR (CAG)n) проводились в ЗАО ЛАГИС (зав. - О.В.Черный). Для получения ДНК использовали фенол-хлороформный метод выделения ДНК из крови (Grimberg, 1989). Для выявления полиморфизмов использовался метод ПЦР с последующей рестрикцией (для генов PPARy и INS) или выявлением полиморфизмов длин повторов электрофорезом в агарозном геле (для генов AR и CYP11A). В связи со значительной трудоемкостью стандартной методики определения полиморфизма INS VNTR пользовалась модифицированная методика выявления точечной замены в промоторной области гена инсулина, находящейся в неравновесном сцеплении с вариантом VNTR. Использованы следующие праймеры: Ins F 5 -ТСС AGG АСА GGC TGC АТС AG-3 , R 5 -AGC ААТ GGG CGG TTG GCT СА-3\ PPARy (Pro 12 Ala) - F 5 -CTG ATG TCT TGA CTC ATGGG-3 и R5 -GGAAGACAAACTACAAGAGC-3 . AR (CAG)n)) F 5 -CTG AGC AAG AGAAGGGGAGGC-3 GGG GTA AGG GAA GTA GGT GGA-3 и R 5 -CGA CTG CGG CTG TGA AGG TTG-3 CTG TTC CTC АТС CAG-3 . CYP1 la (tttta)n F 5 -GGT GAA ACT GTG CCA TTG C-3 и R 5 -GTT TGG GGG AAA TGA GGG GC-3
Влияние носительства полиморфных маркеров в основных генах-кандидатах на течение и особенности СПЯ
Theca-клетки яичников женщин с СПЯ характеризуются избыточной продукцией всех стероидогенных энзимов, вовлеченных в биосинтез андрогенов, что приводит к гиперсекреции как надпочечниковых, так и овариальных фракций андрогенов, а именно: прогестерона, 17-гидроксипрогестерона, тестостерона и андростендиона в сравнении с theca-клетками женщин без гиперандрогении.
Инициальным моментом адренального и яичникового стероидогенеза является превращение холестерина в прогестерон, которое катализируется ферментом отщепления боковой цепи холестерина или P450scc. Ген CYP11A, локализованный на 15q24, кодирующий фермент P450scc, рассматривается как ген кандидат при функциональной гиперандрогении и СПЯ. Показано, что в 5 -регионе гена CYP11А в 528 п.о. от ATG инициирующего кодона, локализована тандемная последовательность из пентануклеотидов (tttta)n, обладающая вариабельностью по числу повторов п. Считается, что увеличение числа повторов последовательности может приводить к усилению транскрипции и активности фермента P450scc, косвенно стимулировать стероидогенез как в яичниках, так и в надпочечниках. Также было предположено, что полиморфный маркер (tttta)n в гене фермента P450scc может участвовать в патогенезе ГА и СПЯ. По литературным данным, аллели с числом повторов более 16 (п 1б), могут рассматриваться как фактор, повышающий активность фермента и стимулирующий стероидогенез. (Nelson V., 2001; GharaniN., 1997)
Распределение генотипов и аллелей CYP11А в обследованных выборках.
Для выявления влияния полиморфного маркера в гене CYP11A на стероидогенез и изучения особенностей стероидогенеза и клинических проявлений СПЯ у носителей разных генотипов было проведено сравнение частот аллелей и генотипов в группах больных СПЯ, их родственников и среди здоровых женщин.
Как видно из таблицы 11, больные СПЯ достоверно отличались по распределению генотипов CYP11A от группы контроля за счет уменьшения процента больных, гомозиготных по аллелям с малым числом повторов (п 16/п 16) и увеличения доли гетерозиготного носительства, однако доля предрасполагающего генотипа (предположительно п 16/ п 16) в группах не отличалась. (Таблица 11)
Среди здоровых девушек преобладающее большинство 76% - имели гомозиготный генотип п 1б/п 16, т.е. по аллелям с малым числом повторов. (Таблица 11.) Для оценки валидности контрольной группы нами было рассчитано предполагаемое носительство полиморфизма в гене CYP11А в контрольной группе по равновесию Харди-Вайнберга, согласно которому лиц с гомозиготным генотипом п 16/п 16 - 64%, гетерозиготных носителей - 32%, носителей гомозиготного генотипа с п 16/п 16 - 4%, таким образом, в проводимой работе распределение генотипов в группе контроля статистически не отличается от известной в популяции и может сравниваться с группой больных СПЯ. (х2=5,6 с 2 степенями свободы, р=0,06)
Для оценки возможного влияния полиморфизма на особенности клинических проявлений заболевания, данные генотипирования были сопоставлены с результатами анамнестических и клинико-гормональных исследований больных СПЯ. (Таблица 13). При изучении анамнестических данных у пациенток-носителей п 16 / п 16 генотипа и пациенток с диким вариантом (встречающимся с наибольшей частотой в контроле) отмечено, что возраст наступления заболевания и интервал от момента менархе до дебюта СПЯ был достоверно большим у носителей генотипа п 16/п 16, им было свойственно более позднее начало заболевания и более длительное время до развития первых симптомов. Отмечено, что у пациенток, носителей разных гомозиготных генотипов, не было достоверных отличий в выраженности кожных проявлений ГА, и не было выявлено корреляций с фенотипическими, метаболическими признаками СПЯ. Однако у носителей генотипа п 16/п 16 отмечалось достоверное увеличение уровня ДГЭА-С по сравнению с носителями генотипа п 1б/п 16, не превышающего, тем не менее, референсных значений, тогда как уровни других стероидных гормонов в подгруппах существенно не различались.
Таким образом, при исследовании полиморфизма в гене CYP11A были получены значимые отличия в распределении частот генотипов полиморфизма CYP11A у больных с СПЯ и пациенток группы контроля.
Было показано, что у носителей гомозиготного генотипа п 1б/п 16 отмечается определенное увеличение уровня ДГЭА-С, которое согласуется с полученной экспериментально ролью п 16 аллелей, косвенно стимулирующих стероидогенез. Полученные нами данные согласуются с результатами Kristensen V. и соавт. (2006), показавших выраженное увеличение уровня ДГЭА-С у носителей данных аллелей. Однако, нами не было обнаружено корреляций между показателями стероидогенной активности яичников у больных с СПЯ в зависимости от носительства генотипов CYP11A, а также отличий в степени выраженности гирсутизма и андрогензависимой дермопатии, что, возможно, свидетельствует о большем активирующем влиянии данного полиморфизма на стероидогенез в надпочечниках, чем в яичниках женщин, больных СПЯ.
![Нозологический профиль и клинико-морфологические сопоставления при внезапной сердечной смерти [Электронный ресурс]](/i/i/4357/189685.png "Нозологический профиль и клинико-морфологические сопоставления при внезапной сердечной смерти [Электронный ресурс] Старикова Ирина Леонидовна")
