Введение к работе
Актуальность работы. Синдром раздраженного кишечника (СРК) - одна из актуальных проблем современной гастроэнтерологии. Согласно Римскому-III Консенсусу по функциональным пищеварительным расстройствам, СРК является функциональным заболеванием кишечника, при котором боль в животе или абдоминальный дискомфорт связаны с дефекацией, изменениями частоты и характера стула (Drossman D.A., 2006). На сегодняшний день СРК страдает около 10-20% населения земного шара, причем преимущественно лица трудоспособного возраста, что определяет клиническую и социальную значимость данного заболевания (Longstreth G.F. et al., 2002). В настоящее время отсутствует единое представление об этиологии и патогенезе СРК, что и определяет трудности в лечении. Среди причин СРК в литературе обсуждают изменения моторики желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), висцеральную гиперчувствительность, генетические факторы, а также стрессы, психические расстройства, вялотекущие воспалительные процессы (Lewis S.J. et al., 1997, Drossman D.A., 2006, Ishihara S. et al., 2009).
Исследования последних лет характеризуют СРК как заболевание, сопровождаемое качественными и количественными изменениями микрофлоры кишечника (Kassinen А. et al., 2007, Spiller R.С., 2008, O’Hara А.М. et al., 2008, Parkes G.C. et al., 2008, Парфенов А.И. и соавт., 2009, Carroll I.M. et al., 2010, Денисов Н.Л. и соавт., 2011). В большинстве зарубежных и отечественных работ при СРК исследования резидентной микрофлоры фокусировались на изучении разнообразия полостного микробиотопа, что существенно снижает ценность этих исследований. Для оценки состояния микробиоценоза кишечника более важной является информация о микробной колонизации в стенке кишки, которая обеспечивается адгезивными свойствами бактерий. В отличие от микрофлоры фекалий, именно микроорганизмы пристеночного биотопа наиболее точно отражают состояние микробной экологии человека (Шендеров Б.А., 1998). Микрофлора, обладающая адгезивными свойствами, сосредоточена на апикальной мембране энтеро – и колоноцитов, т.е. в зоне ассимиляции нутриентов. Можно предполагать, что изменения ее качественного и количественного состава оказывают влияние на пищеварительно-транспортные процессы в кишечнике. Способность кишечной микрофлоры вырабатывать нейротрансмиттеры, влияющие на секрецию и моторику кишечника, а также порог висцеральной чувствительности, свидетельствует о важности дисбиотических изменений в патогенезе CPK (Spiller R.С., 2003, Camilleri M., 2009).
Методы исследования состояния микробиоценоза ЖКТ постоянно совершенствуются. Наиболее часто применяемые методы диагностики в настоящее время это - бактериологическое исследование кала, хромато-масс-спектрометрия, исследование микробных метаболитов, полимеразная цепная реакция.
В последние годы широкое распространение получил способ определения видов и генетически родственных групп микроорганизмов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основу метода ПЦР положено многократное копирование (амплификация) искомого фрагмента ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы и искусственно синтезированных одноцепочечных фрагментов ДНК, комплементарных участкам генома микроорганизма. По сравнению с традиционными методами диагностики, ПЦР отличается высокой чувствительностью и специфичностью. ПЦР с регистрацией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) позволяет проводить количественную оценку микроорганизмов в биопробе.
Несмотря на многочисленные исследования, роль и характер нарушений кишечной микрофлоры в механизме развития СРК до конца не выяснены. До настоящего времени не проводилось достаточно обширных исследований пристеночной микрофлоры ЖКТ при различных клинических формах СРК методом количественной полимеразной цепной реакции. Большинство научных работ базируется на изучении микрофлоры какого-либо одного биотопа - тонкой или толстой кишки, и, как правило, участниками исследования являются пациенты СРК одной клинической формы (Malinen E. et al., 2005, Kerckhoffs A.P. et al., 2009, Carroll I.M. et al., 2010, Rajilic-Stojanovic M. et al., 2011). Кроме того, в литературе отсутствуют работы по изучению пристеночной микрофлоры разных отделов ЖКТ здоровых людей, без которых невозможно проводить анализ изменений состава микроорганизмов при различных патологических состояниях. Получение новой информации об одном из звеньев патогенеза СРК, являясь важной основой разработки оптимальных схем обследования и лечения пациентов, делает целесообразным проведение настоящего исследования.
Цель исследования: изучить состав пристеночной микрофлоры разных отделов желудочно-кишечного тракта у здоровых добровольцев и больных синдромом раздраженного кишечника с преобладанием запоров и диареи методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Задачи исследования
1. Изучить состав пристеночной микрофлоры различных отделов ЖКТ (ротовой полости, проксимальных отделов тонкой кишки, левых отделов ободочной и прямой кишки) методом ПЦР в режиме реального времени у здоровых добровольцев.
2. Определить особенности изменений пристеночной микрофлоры ротовой полости, проксимальных отделов тонкой кишки, левых отделов ободочной и прямой кишки методом ПЦР в режиме реального времени при СРК с преобладанием диареи (СРК-Д).
3. Выявить особенности изменений пристеночной микрофлоры тех же отделов ЖКТ методом ПЦР в режиме реального времени при СРК с преобладанием запоров (СРК-З).
4. Провести сравнительный анализ состава полостного и пристеночного микробиотопа прямой кишки при СРК с преобладанием диареи и запоров.
Научная новизна
Изучен состав пристеночной микрофлоры разных отделов желудочно-кишечного тракт здоровых добровольцев в возрасте от 19 до 50 лет методом ПЦР в режиме реального времени. Определены референсные значения концентраций 29 групп микроорганизмов, позволяющих их использование в дальнейших исследованиях.
Проведено исследование состава пристеночной микрофлоры разных биотопов ЖКТ больных СРК двух клинических форм - с преобладанием запоров и диареи, обнаружены достоверные количественные различия в отдельных группах бактерий филотипов Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria по сравнению с группой контроля.
Определены особенности микрофлоры кишечника при СРК с диареей и СРК с запором, позволяющие использовать их в качестве биомаркеров клинических форм заболевания. Показано, что у больных СРК с диареей по сравнению с группой контроля (ГК) в слизистой прямой кишки достоверно ниже содержание Eubacterium spp.; у больных СРК с запором по сравнению с ГК в слизистой проксимальных отделов тонкой кишки достоверно ниже содержание Bifidobacterium spp, в слизистой ободочной кишки достоверно ниже содержание Streptococcus spp.
Проведено сравнение состава полостного и пристеночного микробиотопа прямой кишки при различных клинических формах СРК. Показано, что при СРК-З и СРК-Д имеются статистически значимые различия в композициях фекальной и мукозной микрофлоры в разных группах микроорганизмов: при СРК-Д они обнаружены как среди облигатных анаэробов, так и аэробов; тогда как при СРК-З различия обнаружены только в группе аэробов.
Практическая значимость
Полученные при исследовании референсные значения концентраций 29 групп микроорганизмов пристеночной микрофлоры разных отделов ЖКТ, выраженные в относительных количественных единицах, позволяют использовать их как показатели нормальных значений для оценки результатов дальнейших исследований.
Выявленные достоверные различия в составе пристеночной микрофлоры у больных СРК и здоровых добровольцев доказывают важную роль нарушений кишечного микробиоценоза в патогенезе синдрома раздраженного кишечника.
Установлено, что метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, целесообразно использовать в диагностике нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у больных СРК.
Результаты изучения состава полостного и пристеночного микробиотопа прямой кишки позволяют оптимизировать диагностику нарушений микробиоценоза при СРК с запорами путем проведения исследования микрофлоры фекалий методом ПЦР-РВ.
С учетом выявленных отклонений в составе микрофлоры при СРК предложено включение в схемы лечения пробиотиков, содержащих Bifidobacterium spp, Streptococcus spp, а также препаратов пребиотического действия.
Результаты проведенной работы позволяют оптимизировать алгоритм диагностических и лечебных мероприятий при СРК с преобладанием запоров и диареи, что будет способствовать улучшению качества жизни пациентов и снизит риск развития рецидивов заболевания.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Состав пристеночной микрофлоры тонкой и толстой кишки больных синдромом раздраженного кишечника и здоровых добровольцев имеет статистически значимые различия.
2. У больных СРК вне зависимости от клинической формы в слизистой прямой кишки существуют достоверные количественные отличия от группы контроля в группах бактерий филотипов Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria: повышено содержание Faecalibacterium praustnizi; понижена концентрация Streptococcus spp, Atopobium claster, Ralstonia spр.+Burkholderia spр.
3. При СРК с запором и СРК с диареей существуют достоверные отличия от группы контроля в разных группах микроорганизмов пристеночной микрофлоры ЖКТ: у больных СРК с запором в слизистой проксимальных отделов тонкой кишки достоверно ниже содержание Bifidobacterium spp., в слизистой ободочной кишки достоверно ниже содержание Streptococcus spp.; у больных СРК с диареей в слизистой прямой кишки достоверно ниже содержание Eubacterium spp.
4. Обнаруженные различия в составе микрофлоры при СРК с запором и диареей предполагают взаимосвязь особенностей микрофлоры с клинической формой СРК и определяют возможность их применения как биомаркеров данной патологии.
5. Патогенетически обосновано включение в программу лечения больных СРК пробиотиков, содержащих Bifidobacterium spp и Streptococcus spp. , а также препаратов пребиотического действия.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в научно-практическую работу кафедры гастроэнтерологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России. Основные положения диссертации используются при чтении лекций, проведении научно-практических конференций, практических занятий и семинаров, включены в программу обучения клинических ординаторов, врачей гастроэнтерологов. Издано учебное пособие, которое используется как методический материал на циклах повышения квалификации и профессиональной переподготовки врачей гастроэнтерологов. Результаты исследования внедрены в практику работы гастроэнтерологического отделения Федерального государственного казенного учреждения главного клинического военного госпиталя федеральной службы безопасности России.
Личный вклад автора
Автором проведено обследование всех субъектов, вошедших в работу (123 пациента СРК и 14 здоровых добровольцев): изучены анамнестические данные и особенности клинических проявлений заболевания, проведено физикальное обследование, назначены необходимые лабораторные и инструментальные исследования. Автором разработаны первичные учетные документы – анкеты пациентов и здоровых добровольцев. Отобранным 40 пациентам СРК лично автором проведена ректоскопия, произведен забор образцов слизистой полости рта, фекалий. Автор ассистировала при проведении эндоскопических исследований, участвовала в получении образцов слизистой проксимальных отделов тонкой кишки, левых отделов ободочной кишки, прямой кишки и подготовке биоптатов к проведению исследования методом полимеразной цепной реакции. Анализ, обобщение материалов, статистическая обработка результатов по всем направлениям исследования проведены лично автором.
Апробация результатов исследования
Материалы диссертации доложены на X съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2010г), на XVII, XIX Российской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, 2011, 2013гг), на Научно-практической конференции «Актуальные проблемы гастроэнтерологии», посвященной памяти академика В.Х.Василенко (Москва 2011, 2012гг).
Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции сотрудников кафедры гастроэнтерологии ГБОУ ДПО РМАПО, кафедры терапии и подростковой медицины ГБОУ ДПО РМАПО, кафедры неотложных состояний в клинике внутренних болезней ФППОВ Первого МГМУ им.И.М.Сеченова, отделения гастроэнтерологии ГБУЗ «ГКБ №14 им.Короленко» Департамента Здравоохранения г. Москвы, ведущих научных сотрудников ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России 4.07.2013г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 – в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объекту и методам исследования, двух глав с результатами собственных данных, клинического примера, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, включая список литературы, иллюстрирована 12 рисунками, содержит 30 таблиц. В работе использовано 162 литературных источника, из них 48 отечественных и 114 зарубежных авторов.
