Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
Антибиотико-ассоциированная диарея 17
Патогенез 18
Идиопатическая антибиотико-ассоциированная диарея 18
Клиническая картина. 19
Лечение 19
Диарея, вызвынная Clostridium difficile. 19
Лечение антибиотико-ассоциированной диареи, обусловленной инфекцией Clostridium difficile 23
Эффективность пробиотических препаратов 24
Антибиотико-ассоциированная диарея в педиатрической практике 27
Пробиотики 28
Требования, предъявляемые к микроорганизмам, входящим в состав пробиотических препаратов 29
Свойства пробиотиков 29
Механизм действия пробиотиков 30
Безопасность применения пробиотиков 31
Микрофлора желудочно-кишечного тракта. 34
Применение пробиотиков при заболеваниях, сопровождающихся инфекцией Helicobacter pylori 37
Диарея путешественников 37
Синдром избыточного бактериального роста 40
Синдром раздраженного кишечника 41
Воспалительные заболевания кишечника 45
Паучит 46
Педиатрическая практика 47
Атопические заболевания 49
Профилактика аллергических заболеваний. 50
Роль пробиотиков в лечение аллергических заболеваний 51
Использование пробиотиков в гинекологии 53
Гипохолестеринемический эффект. 54
Классификация пробиотических лекарственных препаратов 55
Пребиотики 60
Свойства бактерий рода Lactobacillus 63
Морфологические свойства. 63
Культуральные свойства. 64
Биохимические свойства. 66
Систематика. 76
Глава 2. Материалы и методы. 81
Клинические методы наблюдения 81
Ретроспективный анализ историй болезни 83
Проспективное открытое сравнительное клиническое исследование 84
Профилактическое назначение пробиотического препарата. 84
Статистичская обработка данных 85
Определение распространености носительства Сlostridium difficile. 86
Микробиологические и молекулярно-биологические методики 87
Штаммы бактерий. 87
Выделение чистых культур и культивирование. 88
Полимеразная цепная реакция 89
Электрофорез 90
Выделение и очистку амплифицированной ДНК 91
Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК 91
Для анализа нуклеотидных последовательностей 92
Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом РАПД-ПЦР. 93
Глава 3. Результаты. 97
Частота возникновения антибиотико-ассоциированной диареи 97
Качество диагностики антибиотико-ассоциированной диареи в реальной практике 97
Частота возникновения антибиотико-ассоциированной диареи в ходе проспективного открытого сравнительного клинического исследования 99
Распрострененность носительства Clostridium difficile у стационарных больных, получающих антибиотики 104
Частота возникновения антибиотико-ассоциированной диареи у детей 104
Качество диагностики антибиотико-ассоциированной диареи в реальной практике 104
Влияние Lactobacillus acidophilus на частоту возникновения и тяжесть течения антибиотико-ассоциированной диареи. 106
Паспортизация пробиотических штаммов и их молекулярно-биологическая характеристика 109
Анализ последовательностей гена 16S рРНК с целью видовой идентификации штаммов 109
Lactobacillus acidophilus NK-1 110
Lactobacillus acidophilus NK-2 113
Lactobacillus acidophilus NK-5 116
Lactobacillus acidophilus NK-12 119
Идентификация культур молочнокислых бактерий. 122
Паспортизация штаммов лактобацилл. 124
Синтез экзополисахаридов. 127
Способность бактерий переносить низкие значения pH 128
Способность бактерий сохранять жизнеспособность в присутствии желчных кислот 135
Способность к синтезу витаминов 137
Продукция биогенных аминов 137
Ферментация полисахиридов 138
Способность бактерий к поглощению холестерола 140
Вариант оптимизации применения пробиотиков в клинической практике на примере отечественного препарата Аципол 142
Глава 4. Заключение 148
Выводы 159
Практические рекомендации 161
Список литературы 163
- Лечение антибиотико-ассоциированной диареи, обусловленной инфекцией Clostridium difficile
- Применение пробиотиков при заболеваниях, сопровождающихся инфекцией Helicobacter pylori
- Проспективное открытое сравнительное клиническое исследование
- Паспортизация пробиотических штаммов и их молекулярно-биологическая характеристика
Введение к работе
Актуальность темы
За последние десятилетия диарейный синдром - наиболее часто
встречающийся побочный эффект антибиотикотерапии - стал одной из самых распространенных гастроэнтерологических патологий. По различным данным до 30% всех пациентов, получающих антибиотики, страдают от развития этого побочного явления [Маев И.В. 2007; 2002]. Еще более высокая частота наблюдается у детей и пожилых пациентов [Учайкин В.Ф. 2002; Бельмер С.В. 2004; Allen S.J. 2012; Jonston B.C. 2007]. Патогенез лекарственно-индуцированной диареи остается не до конца понятным, ряд авторов склоняются к теории о качественном и количественном изменении микрофлоры кишки под воздействием антибиотиков. Также называется ряд других факторов, способствующих развитию диареи. Антибиотики, содержащие клавулановую кислоту, стимулируют двигательную функцию кишечника. Диарея, возникающая после приёма цефоперазона и цефиксима, является следствием неполного всасывания этих антибиотиков в кишечнике. Изменение состава бактериальной флоры кишечника, возникающее на фоне терапии антибиотиками, может привести к нарушению расщепления углеводов на короткоцепочечные жирные кислоты, в норме осуществляемого бактериями в толстой кишке, и развитию осмотической диареи [Ивашкин В.Т. 2002; Халиф И.Л. 2009; Bartlett J.G. 1992].
Одним из часто встречающихся и тяжело протекающих осложнений применения антибиотиков считается диарея, вызванная анаэробной флорой, например Clostridium difficile [Калинин А.В 2006; Badger V.O. 2012]. Распространенность носительства Clostridium difficile у взрослых составляет до 3% [Noren T. 2004, Wilcox MH. 2008], резко возрастая у больных, находящихся в стационарах и получающих антибиотики (до 15–40%) [Allen S.J. 2012]. Сложности своевременного распознавания лекарственно-индуцированной диареи, вызванной Clostridium difficile, объясняются трудностями культивирования микроорганизма [Cohen S.H. 2010; Wilcox M.H. 2008;].
Несмотря на достижения последних лет, проблема лечения лекарственно-индуцированной диареи на фоне основного заболевания остается сложной задачей. Многочисленные зарубежные исследования показывают эффективность превентивного применения пробиотиков для предотвращения развития лекарственно-индуцированной диареи 2005, 2002, 2006]. В нашей стране отсутствие статистических данных по распространенности этого осложнения, его плохая диагностика и отсутствие стандартов профилактики не привели к повсеместному назначению пробиотиков при применении антибиотиков в широкой практике. Также этому способствует отсутствие достоверных критериев по выявлению тех пациентов, у которых разовьется антибиотико-ассоциированная диарея. Для профилактики развития лекарственно-индуцированной диареи применяются представители нормофлоры человека Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, а также дрожжевых грибков Saccharomyces [Эрдес С.И. 2009; 2006; Jonston B.C. 2012, 2006, Szajewski H. 2005].
Современные тенденции применения пробиотиков заключаются в применении определенных штаммов при конкретной патологии 2003]. Поэтому важным оказывается определение систематического таксономического положения микроорганизмов, составляющих основу пробиотических препаратов, с применением современных методов исследования, а также молекулярно-генетических характеристик пробиотических свойств их штаммов, применяемых для профилактики и лечения лекарственно-индуцированной диареи. Кроме того, особенно важным оказывается способность пробиотика выдерживать низкие значения pH и присутствие солей желчи с сохранением пробиотического потенциала и антагонистической активности микроорганизмов, составляющих основу пробиотических препаратов. В связи с этим актуальной является задача определения данных свойств у штаммов микроорганизмов, применяемых при лечении антибиотико-ассоциированной диареи (ААД).
Цель исследования: изучение клинических свойств пробиотических препаратов и их эффективности в профилактике и лечении лекарственно-индуцированной диареи.
Задачи исследования:
-
Выяснить встречаемость лекарственно-индуцированной диареи в популяции пациентов, принимающих антибиотики длительностью не менее 3х дней;
-
Показать возможность профилактики развития антибиотико-ассоциированной диареи при назначении пробиотиков;
-
Получить данные о пробиотических культурах, которые могут быть рекомендованы как средство выбора для профилактики развития антибиотико-ассоциированной диареи;
-
Показать необходимость применения молекулярно-биологических методик при определении видовой принадлежности лактобацилл. Использовать для идентификации и внутривидовой дифференциации бактериальных штаммов, принадлежащих к роду Lactobacillus методику анализа последовательности гена 16S рРНК;
-
Выявить разрешающую способность метода RAPD-PCR для штаммовой идентификации лактобацилл и провести генетическую паспортизацию природных и промышленных культур бактерий родов Lactobacillus с применением этой методики;
-
Протестировать штаммы Lactobacillus на наличие пробиотических свойств (способность переносить низкие значения pH и присутствие солей желчи, синтезировать экзополисахариды, витамины, биогенные амины).
Научная новизна
1. В работе изучена встречаемость лекарственно-индуцированной диареи при
приеме антибиотиков у пациентов общетерапевтического профиля, находящихся на стационарном лечении;
-
Проведен сравнительный анализ частоты выявления антибиотико-ассоциированной диареи при использовании ретроспективного и проспективного методов исследования;
-
Изучена частота носительства C. difficile у пациентов при длительном назначении антибиотиков и нахождении в стационаре;
-
Проведен анализ снижения риска развития антибиотико-ассоциированной диареи при назначении пробиотического препарата;
-
Идентифицировны пробиотические штаммы бактерий рода Lactobacillus с использованием филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S РНК и генетическая паспортизация этих штаммов с применением методики молекулярного типирования (РАПД-ПЦР);
-
Установлены молекулярно-генетические характеристики и пробиотический потенциал данных штаммов;
-
Проведена сравнительная характеристика метаболических свойств различных штаммов лактобацилл;
-
Проведено определение устойчивости штаммов к низким значениям pH и присутствию солей желчи;
-
Изучена способность производственных штаммов пробиотического препарата для профилактики антибиотико-ассоциированной диареи вырабатывать полисахариды, осуществлять синтез витаминов, продукцию биогенных аминов, их гипохолистеринемическая активность, устойчивость к антибактериальным веществам и антагонистическая активность;
Практическая значимость
Показано, что пациенты с ААД составляют более десяти процентов среди общего числа взрослых пациентов и более трети случаев - среди детей, получающих лечение антибиотиками.
Было выявлено, что имеет место недооценка симптоматики ААД, значительно уменьшающая уровень диагностики данного заболевания. Так, в реальной практике в популяции взрослых пациентов не диагностированные случаи антибиотико-ассоциированной диареи могут составить от 4,5% до 15,5%, а у детей в возрасте до 3 лет – от 36% до 66%.
С использованием бактериологического метода диагностики было показано, что у больных, получающих антибиотики из группы пенициллинов и цефалоспоринов и находившихся в стационаре более 3х недель, частота носительства C. difficile составляет 7,1 %.
Было показано, что среди взрослых пациентов, получающих пробиотические штаммы бактерий рода Lactobacillus, антибиотико-ассоциированная диарея встречается менее чем в одном проценте случаев.
Продемонстрирована лечебно-профилактическая эффективность пробиотического
препарата, содержащего L. acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12, при антибиотико-
ассоциированной диарее у пациентов, получающих антибактериальную терапию.
Применение пробиотического препарата одновременно с назначением
антибиотиков позволяет снизить вероятность ее развития на 5,6 - 17%, уменьшить степень выраженности и продолжительность диареи на 40%.
C использованием метода секвенирования гена 16S РНК идентифицирована таксономическая принадлежность пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12, ВС401, ВС416, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus BC421, BC423, Lactobacillus casei BC431, BC433.
Продемонстрировано отсутствие у пробиотических штаммов L.acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12 экстрахромосомной ДНК, то есть мобильной генетической информации и собственной вирулентности.
Была показана способность пробиотических штаммов L.acidophilus синтезировать экзополисахариды и выживать в средах с низким значением рН (2) и с 20% содержанием желчи, что позволяет им преодолеть верхние отделы желудочно-кишечного тракта и проявить свою биологическую активность.
Были выявлены минимальные уровни продукции биогенных аминов
лактобактериями L.acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12, что позволяет их применять при аллергических состояниях, не увеличивая биологически активную нагрузку на организм.
Обнаружена способность штаммов лактобактерий L.acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12 к синтезу витаминов группы В, в том числе витамина В12. Данное свойство позволяет использовать штаммы для профилактики гиповитаминозов витаминов группы В.
Обоснованы рекомендации по использованию при выборе культур для лекарственного пробиотического препарата с целью профилактики ААД штаммов с точно определенной видовой принадлежностью и с наиболее выраженными пробиотическими свойствами.
Реализация результатов исследования
Результаты исследований и материалы диссертации могут быть использованы терапевтами, гастроэнтерологами, пульмонологами, нефрологами как в условиях стационара, так и поликлиники.
Предложенные в работе методики используются в стационарах клинических баз кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ (Центральная клиническая больницы № 1 ОАО «Российские железные дороги», Центральная клиническая больницы № 2 ОАО «Российские железные дороги», ГБУЗ «Медико-санитарная часть № 33 Департамента здравоохранения города Москвы»). Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного факультета с 2010 г. и используются
преподавателями кафедры на теоретических занятиях со студентами II-IV курсов лечебного факультета, клиническими интернами, ординаторами и аспирантами кафедры, курсантами цикла ФПДО и ФПКП, в лекционном материале и методических рекомендациях.
Личный вклад автора. Автору принадлежит существенная роль в выборе направления и программы диссертационного исследования, анализе и обобщения полученных результатов. В разделах исследования, выполненных в соавторстве, автором лично проведены набор материала и научной информации по теме диссертации, статистческие и аналитические расчеты, обобщение полученных результатов. Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования, в том числе при формулировке цели и определении задач, их реализации, обсуждении результатов, подготовке выводов и практических рекомендаций, освещении материалов в печати и на различных форумах, внедрении результатов исследования в практику.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Анализ клинической картины стационарных больных, получающих антибактериальную терапию по поводу различной соматической патологии, свидетельствует о высокой встречаемости лекарственно индуцированной диареи. Ретроспективный анализ историй болезни пациентов, принимавших антибиотики, показал низкое выявление данной патологии. Сравнение частоты выявления антибиотико-ассоциированной диареи при ретроспективном и проспективном методах исследования впервые выявило гиподиагностику этого осложнения.
-
Клиническая картина лекарственно индуцированной диареи характеризуется появлением неоформленного жидкого стула более трех раз в день с развитием водно-электролитных нарушений, что существенно осложняет течение основного заболевания.
-
Основным методом эффективной профилактики развития лекарственно-индуцированной диареи в стационарных и амбулаторных условиях является
назначение пробиотических препаратов не позднее 48 часов от начала антибиотикотерапии.
-
Продолжительность применения пробиотиков должна составлять не менее 10 дней. Профилактический прием пробиотических препаратов существенно снижает риск возникновения лекарственно индуцированной диареи, а также обладает терапевтическим эффектом и приводит к статистически значимому снижению длительности ААД и более легкому течению этого осложнения.
-
При использовании для профилактики лекарственно индуцированной диареи пробиотических штаммов необходимо руководствоваться данными об определении видовой принадлежности молекулярно-биологическими методами, а также доказать отсутствие мобильной генетической информации.
-
Пробиотические штаммы, применяемые в целях профилактики лекарственно индуцированной диареи, должны демонстрировать возможность выживания в кислой среде и присутствии солей желчи (устойчивость в кислой среде, к солям желчи).
-
Пробиотические штаммы, применяемые в целях профилактики лекарственно-индуцированной диареи, должны обладать способностью к ферментации дисахаридов, а также к синтезу витаминов. В то же время необходимо, чтобы у них отсутствовало свойство синтеза биогенных аминов. Результаты исследований штаммов Lactobacillus acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12 демонстрируют их видовую принадлежность к виду Lactobacillus аcidophilus и полное отсутствие мобильной генетической информации, способность переносить низкие значения pH и присутствие солей желчи, способность к синтезу витаминов В5, В12, РР, минимальную концентрацию биогенных аминов в среде культивирования, что делает эти штаммы средством выбора для профилактики ААД.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены на: XIV Российской
гастроэнтерологической неделе (Москва, октябрь 2008 г.); VII Конгрессе детских
инфекционистов России (Москва, декабрь 2008); XVIII Европейской
гастроэнтерологической неделе (Лондон, ноябрь 2009 г.); XVI конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); XV Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2009 г.).
Диссертация апробирована на межкафедральной научно-методической
конференции кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии и кафедры госпитальной терапии Московского Государственного Медико-Стоматологического Университета им. А.И. Евдокимова «18 » октября 2013 г. (протокол № 14).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 26 научных работ, в т.ч. 15 в журналах, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ, 2 главы в руководствах и монографиях.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 194 страницах машинописного текста и включает введение, 3 главы (обзор литературы, описание материала и методов исследования, результаты), заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы из 294 источников (30 отечественных и 264 иностранных авторов). Работа иллюстрирована 33 таблицами и 14 рисунками.
Лечение антибиотико-ассоциированной диареи, обусловленной инфекцией Clostridium difficile
Результаты исследований и материалы диссертации могут быть использованы терапевтами, гастроэнтерологами, пульмонологами, нефрологами как в условиях стационара, так и поликлиники. Предложенные в работе методики используются в стационарах клинических баз кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ (Центральная клиническая больницы № 1 ОАО «Российские железные дороги», Центральная клиническая больницы № 2 ОАО «Российские железные дороги», ГБУЗ «Медико-санитарная часть № 33 Департамента здравоохранения города Москвы»). Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного факультета с 2010 г. и используются преподавателями кафедры на теоретических занятиях со студентами II-IV курсов лечебного факультета, клиническими интернами, ординаторами и аспирантами кафедры, курсантами цикла ФПДО и ФПКП, в лекционном материале и методических рекомендациях.
Личный вклад автора. Автору принадлежит сущестенная роль в выборе направления и программы диссертационного исследования, анализе и обобщения полученных результатов. В разделах исследования, выполненных в соавторстве, автором лично проведены набор материала и научной информации по теме диссертации, статистческие и аналитические расчеты, обобщение полученных результатов. Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования, в том числе при формулировке цели и определении задач, их реализации, обсуждении результатов, подготовке выводов и практических рекомендаций, освещении материалов в печати и на различных форумах, внедрении результатов исследования в практику.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Анализ клинической картины стационарных больных, получающих антибактериальную терапию по поводу различной соматической патологии, свидетельствует о высокой встречаемости лекарственно индуцированной диареи. Ретроспективный анализ историй болезни пациентов, принимавших антибиотики, показал низкое выявление данной патологии. Сравнение частоты выявления антибиотико-ассоциированной диареи при ретроспективном и проспективном методах исследования впервые выявило гиподиагностику этого осложнения.
2. Клиническая картина лекарственно индуцированной диареи характеризуется появлением неоформленного жидкого стула более трех раз в день с развитием водно-электролитных нарушений, что существенно осложняет течение основного заболевания.
3. Основным методом эффективной профилактики развития лекарственно-индуцированной диареи в стационарных и амбулаторных условиях является назначение пробиотических препаратов не позднее 48 часов от начала антибиотикотерапии.
4. Продолжительность применения пробиотиков должна составлять не менее 10 дней. Профилактический прием пробиотических препаратов существенно снижает риск возникновения лекарственно индуцированной диареи, а также обладает терапевтическим эффектом и приводит к статистически значимому снижению длительности ААД и более легкому течению этого осложнения.
5. При использовании для профилактики лекарственно индуцированной диареи пробиотических штаммов необходимо определить их видовую принадлежность молекулярно-биологическими методами, а также доказать отсутствие мобильной генетической информации.
6. Пробиотические штаммы, применяемые в целях профилактики лекарственно индуцированной диареи, должны демонстрировать возможность выживания в кислой среде и присутствии солей желчи (устойчивость в кислой среде, к солям желчи).
7. Пробиотические штаммы, применяемые в целях профилактики лекарственно-индуцированной диареи, должны обладать способностью к ферментации дисахаридов, а также к синтезу витаминов. В то же время необходимо, чтобы у них отсутствовало свойство синтеза биогенных аминов. Результаты исследований штаммов Lactobacillus acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12 демонстрируют их видовую принадлежность к виду Lactobacillus аcidophilus и полное отсутствие мобильной генетической информации, способность переносить низкие значения pH и присутствие солей желчи, способность к синтезу витаминов В5, В12, РР, минимальную концентрацию биогенных аминов в среде культивирования, что делает эти штаммы средством выбора для профилактики ААД.
Применение пробиотиков при заболеваниях, сопровождающихся инфекцией Helicobacter pylori
Японские авторы применяли молочнокислые бактерии у новорожденных с атопической экземой и аллергией на коровье молоко [67]. В ходе двойного слепого плацебо контролируемого исследования у детей, получавших искусственное вскармливание с добавлением пробиотических штаммов, было выявлено значительное улучшение симптомов атопического дерматита и снижение уровня маркеров интестинального воспаления по сравнению с плацебо группой (табл. 6). Похожие результаты были получены этой же группой авторов в ходе другого двойного слепого плацебо контролируемого исследования. Новорожденные, раннее находившиеся на грудном вскармливании и затем переведенные на искусственное кормление с добавлением молочнокислых бактерий, показали значительное улучшение симптомов атопической экземы и снижение воспалительных маркеров по сравнению с контрольной группой [129, 173]. Экспрессия рецепторов на клеточных поверхностях и выработка хемотактических факторов не изменялись. В поперечном плацебо контролируемом исследовании у 56 % детей, страдающих атопическими заболеваниями и получавших пробиотические препараты в течение 6 недель, было отмечено клиническое улучшение по сравнению с 15 % в контрольной группе [228]. Также было показана эффективность лечения атопической экземы и аллергии на коровье молоко при применении живых, а не пастеризованных штаммов [148]. На основании результатов по этим исследованиям можно сделать вывод об эффективности применения определенных пробиотических штаммов в лечение аллергических заболеваний.
В то же время проведено мало исследований и нет чётких данных об эффективности применения пробиотиков в лечении аллергии у взрослых. Финские исследователи изучали эффект пробиотиков у подростков и молодых людей с аллергией на пыльцу березы. Молочнокислые бактерии назначались в течение 5,5 месяцев (перед, во время и после цветения березы). В результате не удалось смягчить симптомы аллергии или уменьшить использование медикаментов [117]. Авторы двойного слепого исследования пытались оценить влияние молочнокислых бактерий на течение бронхиальной астмы средней степени тяжести [113]. Больные получали йогурт в течение месяца, по истечении срока исследования по данным спирометрии не было выявлено положительного эффекта.
Пробиотик Заболевание Дизайн исследования Количество пациентов Оцениваемые симптомы Результаты
ЙогуртсодержащийLactobacillusacidophilus Бронхиальная астма Двойное слепое 15 взрослых Функциональныепоказатели,качествожизни Без существенныхотличий всравниваемыхгруппах
Искусственное питаниеLactobacillusGG Атопическая экзема Двойное слепоеплацебо контролируемое НоворжденныеА13+Б14(плацебо)+С10матери которыхполучалипробиотик Клинические показатели Значительноеулучшение вгруппах А и С Искусственное питаниеBifidobacterium lactis (А)илиLactobacillusGG (Б) Атопическая экзема Двойное слепое НоворжденныеА9+Б9 +С9(плацебо) Тяжесть экземы Значительноеулучшение упациентовгруппы А и Б, и у4-х в группе С
Lactobacillus GG Аллергическ ий ринит Двойное слепоеплацебо контролируемое 38 подростков/ взрослых Тяжестьсимптомов/применениемедикаментов Без существенныхотличий всравниваемыхгруппах
Lactobacillus GG Атопическая экзема Двойное слепоеплацебо контролируемое НоворжденныеА36+Б28(матери которыхполучалипробиотик)+С68 плацебо Наличие и тяжесть экземы Экземапоявилась у9/36 в группе А,6/28 в группе Б,31/68 в группе С
Авторы обзорной статьи о роли пробиотиков в поддержании здоровья человека в заключении делают вывод о том, что пробиотические препараты могут снижать избыточный иммунный ответ у субъектов с атопическими заболеваниями и усиливать иммунитет у здоровых лиц [105].
Использование пробиотиков в гинекологии В норме во влагалищной флоре преобладают лактобациллы, снижение их количества наблюдается при различных патологических состояниях [35, 111]. В литературе приводятся данные о положительных результатах применения пероральных и местных пробиотиков в комплексной терапии бактериального вагиноза [55, 156, 285]. Схожие результаты получены об эффективном использовании пробиотических препаратов для лечения и профилактики развития канидиозного вульвоваганита [97, 256]. Механизм действия пробиотиков в этом случае основывается на способности лактобактерий продуцировать пероксид водорода, что способствует снижению pH в кислую сторону и развитию собственных лактобактерий. Та же гипотеза о восстановлении количества лактобактерий во влагалище и их протективном действии в отношении условно-патогенной флоры был положен в основу применения пробиотиков для предотвращения возникновения урологических заболеваний [59, 216, 217]. При вагинальном применении суппозиториев, содержащих Lactobacillus rhamnosus и GR-1 Lactobacillus fermentum B-54 (1 раз в неделю в течение года, n=25), было отмечено снижение случаев возникновения инфекций мочевыводящих путей по сравнению с предшествующем годом [216].
Гипохолестеринемический эффект.
Риск развития атеросклеротического поражения сосудов напрямую связан с уровнем содержания холестерина в крови. В 70-х годах прошлого века появились работы, отмечающее пониженное содержание холестерина в крови африканских племен в Танзании, и возможную связь с употреблением ими большого количества кисломолочных продуктов Lactobacillus spp.[176, 206, 230, 240] Многочисленные исследования показывают значительное уменьшение (на 50%) уровня холестерина в бескислородной среде, содержащей желчь, что имитирует условия кишки. Например, штамм L. fermentum KC5b способен удалять из среды до 14,8 мкг холестерина на 1 г сухой массы клеток [205]. Для штаммов L. acidophilus ATCC 33200 и L. casei ASCC 1521 это значение варьирует от 12.03 до 32.25 мкг/мл [165]. Точный механизм снижения уровня холестерола неизвестен. C помощью изучения жирнокислотного профиля клетки, было показано, что холестерол включается в состав клеточной мембраны бактерий [165]. Другой предполагаемый механизм в продуцировании гидролазы желчных кислот, данный фермент расщепляет конъюгированные желчные кислоты до свободных желчных кислот, что уменьшает их способность абсорбироваться на слизистой кишечника. Эти данные говорят о том, что лактобациллы могут быть использованы для профилактики возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с высоким содержанием холестерина в крови.
Проспективное открытое сравнительное клиническое исследование
Для сравнительного анализа результатов секвенирования использовалось програмное обеспечение Vector NTI: ContigExpress. Програмное обеспечение ClustalX применяли для множественного выравнивания последовательностей. Расчёт генетических расстояний, построение дендрограмм, филогенетический анализ выполняли в с ипользованием програмного обеспечения Mega4.
Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом РАПД-ПЦР. Построение филогенетических дендрограмм и сравнительный анализ рестриктограмм проводились с применением програмного обеспечения BioNumerics (версия 4.0; Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Матрицу подобия, полученную согласно алгоритму последовательной кластеризации применяли для построения дендрограммы. Метод корреляции Пирсона использовался для вычисления подобия ПЦР-фингерпринтов.
Способность штаммов подавлять рост условно-патогенной микрофлоры изучалась при внесении капли инокулята исследуемых штаммов, с дальнейшим расположением фильтров, смоченных в суспензии клеток и внесении в лунки клеточной суспензии. Штаммы условно-патогенных микроорганизмов: Enterococcus faecalis В4610, Micrococcus luteus В5389, Staphilococcus aureus В6646, Bacillus subtilis В4537, Pseudomonas aeruginosa PAOI использовались в качестве тесторных культур.
Устойчивость к антибиотикам измерялась способом определения максимальной ингибирующей концентрации. Штаммы выращивались в среде, содержащей ванкомицин и метронидазол.
Устойчивость к желчи. Микрорганизмы кульитвитровались в средах с 20 и 40 %% содержанием желчи.
Способность бактерий продуцировать витамины. С этой целью применялся метод ВЭЖХ и использовалась колонка «Эликсис-1» С18-150х4,6 mm, 5.0 um. Температура колонки - 500 С, - 210 нм, градиент: А - ацетонитрил, В - 0,1%, трифторуксусная кислота, С- метанол, инжекция -10 мкл. Прием и обработку данных производили с использованием програмного обеспечения “Empower Pro”.
Способность штаммов ферментировать углеводы изучалась на твердой среде МRS с тетстируемым углеводом (лактоза, галактоза) в концентрации 10 г/л и красителем бромкрезоловым пурпурным (БКП) в концентрации 32 мг/л. Приобретение колониями и питательной средой желтой окраски свидетельствовало о ферментации углеводов.
Синтез биогенных аминов. Хроматограф “Alliance” исользовался для количественного определения биогенных аминов методом ВЭЖХ (Separations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996). Для дериватизации исследуемых образцов, содержащих биогенные амины, применялся дансилхлорид. Полученный раствор объемом 5 мкл наносили на колонку С18 2504,0 мм, 5,0 м и тетсировали при длине волны =254 нм, t=40 С. Анализировали способность бактерий продуцировать путресцин, кадаверин, гистамин, тирамин. Для приема и обработки данных применялась прграмноге обеспечение “Empower Pro”.
Способность штаммов синтезировать экзополисахариды изучалась при культивировании лактобацилл на среде следующего состава: сухое молоко с пониженным содержанием жира - 10%, , агар – 1,5%, сахароза - 1%, дрожжевой экстракт - 0,5%, рутениевый красный – 80 мг/л [190].
При проведении RAPD-ПЦР использовались праймеры: M13: 5 -gagggtggcggttct-3 [267], MSP: 5 -gtaaaacgacggccagt-3 [63], ERIC-1: 5 -atgtaagccttcggggattcac-3 [125, 280]. Рекомендованный температурно-временной профиль реакции: 94 120 [94 60 ; 45 20”; 72 190 ] 40 циклов; 72 10 (длительность программы составляет 4 ч 20 мин) [267], был модифицирован до следующего: 94 120 [94 30 ; 45 30”; 72 80 ] 40 циклов; 72 4 , длительность новой программы – 2 ч 26 мин. Полимеразную цепную реакцию проводили с применением праймеров, синтезированных с помощью синтезатора ДНК ASM-800 фирмы “Biosset”и реактивов фирмы “АмплиСенс”.
Способность бактерий переносить низкие значения рН. Свежие ночные культуры лактобацилл, выращенные в жидкой среде MRS при рН 6,2 переносили в среду MRS с рН 2,0. Титры культур измерялись через 30, 60, 90, 120 мин после внесения бактерий. Контролем в эксперементе являлись клетки лактобацил, внесённые в среду MRS с рН 6,2, титр которых подсчитывался через 120 мин после засева.
Изучение гипохолестеринемической активности штаммов. Исследовались 20- часовые культуры штаммов бактерий, засеянные в среду MRS, с добавлением 0,3 % смеси желчных кислот и водорастворимого холестерола в концентрации 70 мкг\мл. После инкубационного периода обработка образцов осуществлялась, как описано [230]. Измерение поглощающей способности образцов проводилась на спектрофотометре при длине волны 550 nm.
Паспортизация пробиотических штаммов и их молекулярно-биологическая характеристика
Выявление достоверной информации об эффективности пробиотических лекарственных препаратах, преимуществах одних над другими – сложная задача, решение которой даже в условиях клинических исследований не всегда представляется возможным. Основными свидетельствами терапевтического действия пробиотических препаратов являются клинические наблюдения, исследования микрофлоры кишки и (или) метаболитов. Беспристрастность выявления «симптоматических эффектов», верность и доступность лабораторных методов представляется явно недостаточными для всестороннего заключения о той или иной степени их эффективности даже при хорошо спланированных и проведенных исследованиях. Как правило, систематические погрешности связаны с клиническим действием, его обнаружением и подтверждением. Основной причиной недостаточно обоснованных заключений является неопределенность в принятии решений о клинической важности наблюдаемого различия, особенно тогда, когда доказательства эффективности рассматриваются без учета или при отсутствии сведений, характеризующих препарат.
В настоящее время ведутся попытки выработки объективной оценки при выборе решения при использовании определенного класса програмного обеспечения – гибридных систем, объединяющих разветвленный пользовательский сервис с обширными базами данных и функциями поддержки решения - «системы поддержки принятия решений» (Decision Support Systems) [20]. Согласно исследованиям
Кохрановской рабочей группы по эффективности методов воздействия на клиническую практику EPOC (Effective Practice and Organization of Care group) «компьютерные подсказки» относятся к стабильно эффективным методам при принятии решений, связанных с необходимостью учета неопределенных факторов. С целью решения многокритериальной задачи для создания конструктивной информации о пробиотике целесообразно предусмотреть возможность применения «систем поддержки принятия решений», учитывающей свойства препарата, так и доказательств эффективности в условиях неопределенности. При этом максимизация вероятности ожидаемого результата должна лежать в основе оценки «верности» принимаемых решений, представленного в виде интегрального показателя «терапевтических потенциалов» назначения того или иного препарата.
На примере анализа «терапевтических потенциалов» отечественного пробиотического препарата Аципол показывается возможность расчета интегрального показателя.
Аципол - комбинированный пробиотический препарат из смеси живых облигатных ацидофильных лактобацилл (Lactobacillus acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12) и полисахарида кефирных грибков. В ходе селекционной работы были выделены четыре штамма ацидофильных лактобацилл от здоровых лиц разных возрастов во Всесоюзном научно-исследовательском институте молочной промышленности, эти штамы вошли в состав препарата, Lactobacillus acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12 относятся в виду Lactobacillus acidophilus, роду Lactobakteriaceae, семейству Lactobacillus.
Учитывая значимость влияния представленных свойств и характеристик Аципола на его качество, возможно наиболее беспристрастно оценить соответствие препарата запросам, предъявляемым к пробиотикам. Данные о лечебно-профилактической эффективности Аципола при различных нозологиях определялись по итогам клинических исследований и наблюдениям в реальной практике [16, 19, 21, 25]. Побочные реакции не были зарегистрированы за весь период многолетнего применения Аципола. Анализ клинических исследований в соответствии с принципами «доказательной медицины» проведен с применением различных уровей доказательности, как того требует современная концепция оценки и использования информации [26]. Применены уровни и градации доказательств Оксфордского центра доказательной медицины. Клинические исследования, проведенные до 2006 г, соответствовали 2b, 144 2c, 3a, 3b, 4 уровням (градации доказательств «С», «D»), а результаты исследований препарата расценены как относительно убедительные. В дальнейшем клинические исследования были проведены с уровнем доказательств 1b (градация доказательств «В»).
Последовательный анализ качества препарата, его безопасности, эффективности проводился для более полного и объективного представления о препарате, в итоге был проведен расчёт интегрального показателя «терапевтических возможностей» Аципола с примененим программного обеспечения «ПРИНН» [20] - многокритериальной оценки и выбора решений в условиях неопределенности (табл. 32).
