Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Микроциркуляция и функциональная активность эндотелия в норме и при патологии печени
1.1 Микроциркуляция в норме и при патологии печени 14
1.2 Роль эндотелия в гомеостазе. Понятие об эндотелиальной дисфункции 17
1.3. Эндотелиальные медиаторы и хроническая патология печени 24
Глава2 Клиническая характеристика больных 39
Глава 3 Методы исследования 55
3.1. Получение биологических образцов для специального исследования 56
3.2. Конъюнктивальная биомикроскопия сосудов глазного яблока 57
3.3. Определение уровня эндотелиальных маркеров в плазме крови 58
3.3.1. Определение содержания эндотелина-1 в плазме 58
3.3.2. Определение уровня оксида азота 59
3.3.3. Определение содержания тромбомодулина в плазме 60
3.3.4. Определение уровня фактора Виллебранда 61
3.4. Статистический анализ данных 62
Глава 4. Нарушения микроциркуляции и эндотелиальные маркеры при хронических заболеваниях печени, их клиническое и патогенетическое значение 63
4.1. Состояние микроциркуляторного русла при хронических заболеваниях печени 63
4.1.1. Состояние микроциркуляторного русла у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени 63
4.1.2. Влияние противовирусного лечения на состояние микроциркуляторного русла при хроническом вирусном гепатите и вирусном циррозе печени 75
4.2. Эндотелиальные маркеры при хронических заболеваниях печени 84
4.2.1. Эндотелиальные маркеры у больных хроническим гепатитом и циррозом печени 84
4.2.2. Влияние противовирусного лечения на эндотелиальные маркеры у больных хроническим вирусным гепатитом и вирусным циррозом печени 98
4.3. Взаимосвязь нарушений микроциркуляции, эндотелиальных 108 маркеров и гистологических изменений в печени
4.3.1. Взаимосвязь состояния микроциркуляторного русла и 108 гистологических изменений в печени
4.3.2. Взаимосвязь эндотелиальных маркеров и гистологических изменений в печени 112
4.3.3. Место эндотелиальных маркеров в математическом прогнозировании индексов гистологической активности и фиброза печени 118
Глава5 Обсуждение 122
Выводы 142
Практические рекомендации 144
Библиография 145
- Роль эндотелия в гомеостазе. Понятие об эндотелиальной дисфункции
- Эндотелиальные медиаторы и хроническая патология печени
- Конъюнктивальная биомикроскопия сосудов глазного яблока
- Состояние микроциркуляторного русла у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени
Введение к работе
Актуальность проблемы. Хронические вирусные заболевания печени относятся к числу часто встречающихся видов патологии, которые отличает тяжелое течение, ограниченная эффективность существующих в настоящее время способов лечения и зачастую неблагоприятный прогноз.
Достижения гепатологии последних десятилетий обогатили клиницистов новыми представлениями об эволюции хронического гепатита и цирроза печени. Печеночный ответ на персистенцию вируса включает воспалительную реакцию, фиброгенез и регенерацию, и вследствие аккумуляции внеклеточного матрикса формируется цирроз печени с развитием печеночной недостаточности и портальной гипертензии (Никитин И.Г., 2008). Известно, что микроциркуляторное русло вместе с соединительной тканью первым реагирует на воздействие различных патологических факторов, а эндотелий как основной компонент системы микроциркуляции обеспечивает регуляцию проницаемости сосудов, контроль гемостаза, выполнение транспортных и барьерных функций, модуляцию процессов воспаления, регенерации и метаболизма внеклеточного матрикса. Эндотелиальные клетки синусоидов печени выполняют роль не только барьера между синусоидальной пластиной и паренхимой, но и активно участвуют в воспалительной реакции, редуцируя адгезию, элиминируя провоспалительные субстанции или, наоборот, продуцируя про-воспалительные медиаторы и хемоаттрактанты (Ивашкин В.Т. и соавт., 2005; Никитин И.Г. и Сторожаков Г.И., 2007).
В этом контексте микроциркуляторные нарушения и измененный эндотелиальный статус относятся к числу патогенетически значимых в условиях вирусного поражения, так как способствуют более тяжелому
течению болезни, формированию хронических и затяжных форм заболеваний печени.
Не вызывает сомнения факт персистирующей активации и/или повреждения эндотелиальных клеток в ответ на воздействие иммунных комплексов, медиаторов воспаления, вирусов, приводящих вследствие истощения компенсаторных возможностей к патологическому ответу на стимулы с развитием различных клинических манифестаций. При этом нарушения микроциркуляции, а также состояние эндотелиальных медиаторов, обеспечивающих процессы тканевого гомеостаза, во взаимосвязи с клиническими и морфологическими проявлениями хронической патологии печени изучены недостаточно.
Определение роли микроциркуляторных нарушений и состояния эндотелиальных маркеров в механизмах прогрессирования при заболеваниях печени представляет несомненный теоретический и практический интерес так как позволит уточнить особенности клеточного метаболизма при хронической печеночной патологии и откроет новые возможности оценки активности патологического процесса, эффективности проводимой терапии. Изучение этих показателей может быть использовано для целей дифференциального диагноза и прогнозирования течения хронического вирусного гепатита и цирроза печени.
Цель исследования. Изучение клинического и патогенетического значения нарушений микроциркуляции и состояния эндотелиальных медиаторов при хронических вирусных заболеваниях печени.
Задачи исследования:
1. Изучить состояние микроциркуляции методом конъюнктиваль-ной биомикроскопии сосудов темпоральной части глазного яблока у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени.
-
Определить показатели эндотелиальных медиаторов в плазме крови при хронических вирусных заболеваниях печени.
-
Установить взаимосвязь эндотелиальных маркеров и микроцир-куляторных нарушений с этиологией (типом вируса), основными клини-ко-биохимическими синдромами патологии печени, гистологической активностью и степенью печеночного фиброза.
-
Изучить динамику показателей эндотелиальных медиаторов и состояния микроциркуляторного русла в процессе противовирусной терапии хронического вирусного гепатита и вирусного цирроза печени.
-
Оценить возможности использования показателей микроциркуляции и маркеров эндотелия для целей дифференциального диагноза, определения выраженности воспаления, фиброза, а также эффективности противовирусной терапии хронических заболеваний печени.
Научная новизна работы. Впервые проведено изучение и установлены изменения содержания эндотелиальных медиаторов в крови, в частности эндотелина-1, оксида азота, тромбомодулина и фактора Вил-лебранда, в сочетании с изменениями состояния микроциркуляторного русла больных хроническими вирусными заболеваниями печени. Получены новые данные о динамике эндотелиальных маркеров и показателей микроциркуляции в процессе эволюции хронического гепатита в цирроз. Выявлена зависимость данных показателей от выраженности основных клинико-биохимических синдромов - цитолиза, холестаза, мезенхималь-ного воспаления, портальной гипертензии, а также от этиологии заболевания и прогностической характеристики цирроза печени. Получены новые данные о закономерностях динамики эндотелиальных медиаторов и состояния микроциркуляторного русла в процессе противовирусного лечения. Доказано положительное влияние противовирусной терапии на
уровень маркеров эндотелия в крови и микроциркуляторные нарушения, что характеризует антифибротический эффект противовирусных препаратов и обосновывает их применение в качестве средств, тормозящих развитие печеночного фиброза. Предложен оригинальный метод оценки выраженности гистологической активности и фиброза печени.
Практическая значимость. Установлен факт взаимосвязи эндо-телиальных медиаторов, состояния микроциркуляции, этиологической структуры и основных клинико-биохимических особенностей хронического вирусного гепатита и цирроза печени, что может быть использовано для целей диагностики и дифференциального диагноза. Доказано существование зависимости между изучаемыми показателями и тяжестью цирроза печени, позволяющее использовать определение эндотелиаль-ных медиаторов и конъюнктивальных индексов в качестве дополнительных критериев тяжести патологического процесса. Обнаружена взаимосвязь маркеров эндотелия и микроциркуляторных нарушений с морфологическими признаками печеночного воспаления и фиброза, что дает возможность использовать эти показатели в качестве неинвазивных маркеров активности гепатита и выраженности фиброза печени. Определена динамика эндотелиальных медиаторов и конъюнктивальных индексов под влиянием противовирусной терапии, характеризующая один из механизмов антифибротического действия противовирусных агентов, расширяющая возможности прогнозирования раннего и устойчивого вирусологического ответов у больных хроническим вирусным гепатитом.
Основные положения, выносимые на защиту:
- повышение показателей большинства конъюнктивальных индексов, содержания эндотелина-1, оксида азота и активности фактора Вил-лебранда в крови при хронической вирусной патологии печени с макси-
мальными значениями в случаях цирроза;
нормальные значения плазменного тромбомодулина и показателей внутрисосудистого конъюнктивального индекса при хроническом гепатите, увеличение их в случаях цирроза печени;
существование взаимосвязи между содержанием оксида азота и генофенотипическими особенностями HBV, а также уровнем виремии HBVhHCV;
максимальные нарушения уровня эндотелиальных медиаторов и параметров микроциркуляции при тяжелых проявлениях основных кли-нико-биохимических синдромов патологии печени;
наличие зависимости между морфологическими признаками активности воспаления, выраженностью фиброза печени и значениями маркеров эндотелия, состоянием микроциркуляторного русла;
снижение показателей микроциркуляции и большинства эндотелиальных маркеров в крови в динамике противовирусной терапии хронического вирусного гепатита и цирроза печени;
наличие более выраженного корригирующего влияния на микро-циркуляторные нарушения и более выраженного эндотелий-протектив-ного эффекта комбинированной противовирусной терапии ХВГ С в случаях достижения устойчивого вирусологического ответа;
возможность использования содержания эндотелиальных маркеров для ориентировочной оценки гистологической активности и фиброза печени.
Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практику работы гастроэнтерологического отделения ГУЗ «СККЦ СВМП», а также гастроэнтерологического отделения МУЗ «Городская клиническая больница» №2 г. Ставрополя. Отдельные фрагменты дис-
сертации используются в лекциях и на практических занятиях по гастроэнтерологии со студентами кафедр внутренних болезней №1 с курсом физиотерапии, пропедевтики внутренних болезней Ставропольской государственной медицинской академии. Итоговые материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре терапии института последипломного и дополнительного образования СтГМА.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертационного исследования изложены в 9 научных работах, в том числе 6 работах в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Результаты доложены XV итоговой научной конференции студентов и молодых ученых (Ставрополь, 2007); XII, XIV российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 2007, 2009); XV российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2009); на 7-м съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2007); ежегодной конференции гастроэнтерологов ЮФО (Ростов-на-Дону, 2008); 8-й научно-практической конференции врачей Карачаево-Черкесской республики (Черкесск, 2010).
Апробация работы проведена на совместном заседании кафедр внутренних болезней № 1 с курсом физиотерапии, внутренних болезней педиатрического и стоматологического факультетов, общественного здоровья и здравоохранения и кафедры поликлинической терапии Ставропольской государственной медицинской академии.
Личный вклад автора в исследование. Диссертантом определены основные идеи и дизайн исследования. Автор самостоятельно проанализировал современную литературу по проблеме, курировал больных в течение всего времени наблюдения, участвовал в проведении лабораторных и инструментальных исследований, оценивал результаты лечения больных. Результаты исследований зафиксированы в индивидуальных
картах больных и компьютерной базе данных. Статистическая обработка и анализ полученных данных выполнены автором самостоятельно.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста, содержит 49 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, глав клинической характеристики больных и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 271 источник литературы, из которых 65 наименований на русском языке и 206 - на иностранных.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Ставропольской государственной медицинской академии в рамках федеральной целевой программы №21 «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007-2011 годы)». Подпрограмма «Вирусные гепатиты». Номер государственной регистрации 01200850594.
Роль эндотелия в гомеостазе. Понятие об эндотелиальной дисфункции
Сосудистый эндотелий как основной компонент микроциркуляторного русла является метаболически активным слоем клеток, выстилающим внутреннюю поверхность сосудов организма [34], не просто образующим барьер между кровью и сосудами, но и действующим в качестве модулятора функций последних [3]. Посредством выделения различных биологически, активных соединений1 он участвует в поддержании нормальной микроциркуляции и проницаемости: сосудистой стенки для активного транспорта, и обмена веществ; между кровью и тканями [2,49,50,56]. Нарушение микроциркуляторных процессов опосредовано участием эндотелия в виде измененного синтеза его вазоактивных гормонов [33,192].
В настоящее время эндотелию отводят роль органа внутренней секреции, реагирующего на различные молекулярные сигналы, [34]: фактически- он рассматривается в качестве многофункционального эндокринного органа; в котором, локализуются- рецепторы к разным гормонам, контролирующие их выработку по механизму обратной связи [25]. Общепризнанно участие эндотелия в регуляции тонуса5 и проницаемости, сосудов, роста и пролиферации .,. гладкомышечных клеток, системы гемостаза, процессов воспаления, регенерации, метаболизма внеклеточного матрикса, выполнении транспортных, барьерных функций [14,23;33,34,49;50,56,233,255;)261,262], что обеспечивает баланс между процессами вазодилатации и вазоконстрикции, анти- и протромбоза, про- и противовоспалительными факторами; ингибиторами и промоутерами роста, анти-и прооксидантами [25]1 Участие в регуляции сосудистого тонуса Для выполнения; этой функции; эндотелиоциты вырабатывают вазодилататоры (оксид азота, простациклин, эндотелиальный гиперполяризующий фактор, адреномедуллин, брадикинин, натрийуретический пептид С-типа) и вазоконстрикторы (ангиотензин II, простагландин Н2, тромбоксан А2, эндотелин-1) [3,5,16,22,33,35,49,261,262].
Оксид азота — основной вазодилататор, расслабляющий сосуды [8,19,28,35,43,52,105,203] через активацию гуанилатциклазы и накопление цГМФ в гладкомышечных клетках [2,33,42,43,54,183], а также путем торможения образования эндотелина-I и высвобождения, норадреналина [43]. Развитие релаксации мелких артерий и капилляров под влиянием NO обеспечивает сохранение микроциркуляции на,оптимальном уровне [2] и улучшение перфузии тканей [19].
Вазодилатирующими свойствами обладает простациклин, активирующий аденилатциклазу с увеличением содержания цАМФ, однако, в норме участие его в расширении сосудов минимально, и основной эффект связан с ингибированием агрегации тромбоцитов [24,33,35,54,259,260]. Вазодилатйрующие свойства адреномедуллина также связаны с гиперпродукцией? цАМФ [24,35,54,67], а натрийуретический пептид С типа обеспечивает этот эффект через повышение содержания цГМФ [24,35,54,100]. Эндотелиальный фактор гиперполяризации вызывает открытие калиевых (наиболее вероятно кальцийзависимых) каналов в миоцитах сосудов с последующей их вазодилатацией [24,33,35,54,66,259].
Вазоконстрикция обеспечивается воздействием эндотелина-1 на ЭТА-рецепторы гладкомышечных клеток с активацией фосфолипазы С и повышением содержания, кальция внутри клетки или торможением синтеза оксида азота в сосудах [3,5,15,48,179]. Ангиотензин II активирует 1 тип рецепторов, увеличивая уровень внутриклеточного кальция, и снижая содержание цАМФ за счет блокады аденилатциклазы [24]. Участие в процессах свертывания крови Помимо участия в продукции вазоактивных гормонов эндотелий обеспечивает баланс в системе гемостатического гомеостаза. Прокоагулянтные и проагрегантные эффекты эндотелия связаны с фактором Виллебранда, ингибитором активатора плазминогена-1, тканевым тромбопластином, фибронектином, а свойство тромборезистентности обусловлено синтезом тканевого активатора плазминогена, тромбомодулина, антитромбина III, простациклина, оксида азота [54]. Эндотелии-1 функционирует как прокоагулянт и проагрегант через ингибирование экспрессии тромбомодулина и рецептора протеина С, а также инициирование адгезии и агрегации тромбоцитов [37,38,48,263]. Формирование проагрегантных свойств эндотелия происходит, кроме того, за счет высвобождения фактора Виллебранда, тромбоцитактивирующего фактора, а также экспрессии на эндотелиоцитах тромбоцит-эндотелиальных адгезионных молекул [53,118]. Снижение фибринолитической активности обусловлено повышенным синтезом ингибитора активатора плазминогена 1 типа (в результате стимуляции ангиотензином II) и торможением образования тканевого активатора плазминогена [33,54,73,270].
Антиагрегационный эффект эндотелия обеспечивается благодаря наличию тромборезистентной поверхности, обладающей одинаковым зарядом с тромбоцитами, что препятствует адгезии тромбоцитов [16]. Оксид азота является антикоагулянтом [19,54,210], снижает адгезию и агрегацию тромбоцитов (посредством изменения экспрессии Р-селектина, рецепторов IIb-ПІа и увеличения образования цГМФ) [5,19,26,33,35,42,43,52,66,211], угнетает экспрессию фактора активации тромбоцитов [43], влияет на систему фибринолиза [2]. Антиагрегационной активностью обладает простациклин, активирующий аденилатциклазу с увеличением содержания цАМФ в тромбоцитах [33,54,259,260]. Наконец, продуцируемый эндотелиальными клетками тканевой активатор плазминогена участвует в образовании плазмина и деградации фибрина [2,33]. Тромбомодулин связывает тромбин, который активирует протеин С, расщепляющий Va и Villa факторы, с остановкой дальнейшей генерации тромбина [37]. Свертыванию крови также препятствуют антитромбин III, гепарин сульфат, осг-макроглобулин, протеин С, протеин S [33].
Эндотелиальные медиаторы и хроническая патология печени
Эндотелины — семейство четырех 21-аминокислотных пептидов (эндотелин-1, 2, 3, 4 или вазоактивный кишечный констриктор), из которых преобладающей изоформой является эндотелин-1. Эндотелин-1 синтезируется эндотелиоцитами, лейкоцитами, гладкомышечными клетками, нейронами, гепатоцитами [3,5,56,184]. Ангиотензин II, трансформирующий и инсулиноподобный факторы роста, тромбин, адреналин, цитокины и молекулы адгезии индуцируют, а простациклин, оксид азота, предсердный натрийуретический пептид ингибируют продукцию эндотелина-1 [3,48,54,56,184].
У человека имеются три типа рецепторов к эндотелину: ЭТА-, ЭТв- (в виде двух подтипов) и ЭТс-рецепторы [3,33,48]. ЭТл-рецепторы опосредуют вазоконстрикторный [3,33,44,179], пролиферативный эффект эндотелина-1, стимуляцию адгезии нейтрофилов, продукции цитокинов и факторов роста, агрегации тромбоцитов [48], в некоторых тканях - высвобождение эпидермального фактора роста, фактора роста фибробластов основного [3]. Активация ЭТв-рецепторов 1-го подтипа сопряжена с высвобождением из эндотелия вазорелаксантов, развитием апоптозосупрессивного действия [44,179].
При хроническом гепатите отмечено повышение уровня эндотелина-1 в плазме [92,250,256]. Содержание эндотелина-1 при хроническом вирусном гепатите В характеризовалось увеличенными значениями [129,250,256], тогда как у носителей HBsAg его концентрация была ниже, чем в случаях активной HBV-инфекции [250]. Возрастание показателей медиатора при хроническом вирусном гепатите С положительно коррелировало с количеством десквамированных эндотелиоцитов [250,6]. Напротив, в других исследованиях изменений количества эндотелина-1 при хроническом гепатите выявлено не было [93,94,168,188]. Цирроз печени также характеризуется увеличенными значениями эндотелина-1 в крови вне зависимости от этиологии [91,94,98,114,121,147,150,168,188,216,222,244,247,256] с наиболее высокими показателями-у носителей СС и ТС генотипов гена эндотелина-1 [98]. Имеются данные, что при алкогольном циррозе повышение было более значительно выраженным, чем у неалкогольных пациентов, уменьшаясь у трети больных после абстиненции [154]. Вместе с тем ряд исследований свидетельствует об отсутствии различий в концентрации эндотелина-1 между здоровыми и больными циррозом печени [215,257]. Так, при первичном билиарном циррозе уровень эндотелина-1 не отличался-от нормы [257].
При патологии печени источниками гиперпродукции медиатора могут выступать селезенка [222] и печень, что подчеркивается положительным градиентом его значений на портовенозных, гепатовенозных и периферических венозных уровнях [91,121,228,244,257]. Доказательством этого служит факт повышенной экспрессии эндотелина-1 на эндотелиальных клетках портальной системы [180], обусловленной влиянием эндотоксина [158,165,212] или цитокинов, которые являются мощными стимулами для продукции эндотелина-1 [165]. Местами накопления печеночного эндотелина-1 [91,134,150] являются фиброзные области и печеночная сосудистая сеть [134], а сам медиатор локализован в перипортальных гепатоцитах и синусоидальных клетках [147]. На модели цирроза печени мыши экспрессия гена эндотелина-1 была увеличена в 30 раз в воротной вене и печеночной микроциркуляции, коррелируя с активацией звездчатых клеток и увеличенным портальным давлением [180].
Не вызывает сомнений факт ассоциации повышенной концентрации эндотелина-1 с тяжестью болезни [72,158,177] с максимальными показателями, при классе С по Child-Pugh [154,158,214,215,216,228,244,247]. Вместе с тем имеются данные об отсутствии различий в содержании эндотелина-1 в крови между здоровыми и больными циррозом печени классов А и В [215].
Развитие васкулопатии при портальной гипертензии включает артериальное ремоделирование, повреждение интимы висцеральных вен и разрушение контрактильной структуры в висцеральной артериальной стенке, что связано с гемодинамическими изменениями, иммунным ответом, сопротивлением внутрипеченочному кровотоку, генной модуляцией и вазоактивными веществами. С другой стороны, висцеральная васкулопатия способствует прогрессированию портальной гипертензии, вовлекаясь таким образом в патогенез кровотечений из варикозно расширенных вен пищевода [180].
Изменение эндотелиальной функции с дисбалансом вазоактивных веществ, в том числе эндотелина-1, нарушение внутрипеченочной микроциркуляции играют роль в развитии и прогрессировании портальной гипертензии при циррозе печени [85,150,209]. За изменения печеночного микроциркуляторного русла в виде уменьшения диаметра и числа фенестр и формирования базальных мембран может быть ответственен эндотелии-1, экспрессируемый звездчатыми клетками и синусоидальными эндотелиоцитами [209]. По мнению Leng Е. [177], повышение плазменного уровня эндотелина-1 и GMP140 (показателя активации тромбоцитов) у больных циррозом печени отражает эндотелиальное повреждение и активацию тромбоцитов, что свидетельствует об их важной роли в микроциркуляторных нарушениях [177].
Выявлена корреляция плазменного [214,216,247] и печеночного [134] эндотелина-1 с наличием спленомегалии и асцита [214]. Так, в случаях асцита содержание эндотелина-1 в крови было выше, чем при его отсутствии [92,94,188,213,216], хотя P.S. Kamath и соавті. [147] не обнаружили корреляции уровней эндотелина-1 с асцитом, портокавальным градиентом давления, скоростью и объемом портального кровотока при циррозе печени [213].
Нарушение баланса между вазодилататорами и факторами вазоконстрикции способствует появлению портопульмональной гипертензии, гепаторенального синдрома, изменениями мозгового кровотока при циррозе печени [190]. При гепатопульмональном синдроме наблюдалось увеличение эндотелина-1 в плазме, ассоциированное с легочными сосудистыми нарушениями [214,220], которые успешно устранялись применением антагониста рецепторов эндотелина-1 (бозентана) [113,122,124,171].
Имеются мнения о возможной роли эндотелина-1 в патогенезе острой почечной недостаточности при гепаторенальном синдроме [120,195], основанные в том числе на существовании негативной корреляции плазменного уровня эндотелина-1 с почечной функцией, определяемой по клиренсу креатинина [93,213]. Вазоконстрикторная дисрегуляция функции почек, обусловленная изменением количества эндотелина-1 при циррозе печени [127,271], бьша продемонстрирована при остром повышении портального давления, на фоне которого отмечалось возрастание содержания медиатора и уменьшение почечного кровотока [243].
Конъюнктивальная биомикроскопия сосудов глазного яблока
Выбор конъюнктивы глазного яблока для исследования микроциркуляции определился рядом особенностей ее анатомического строения, позволяющих проводить детальную оценку структуры артериол, капилляров и венул, кровотока в отдельных микрососудах, состояния периваскулярного пространства и внутрисосудистой гемодинамики. С другой стороны конъюнктивальная циркуляция представляет собой статистически правильный образец системной микроциркуляции, что отражает состояние микроциркуляции в других органах и тканях [41] и идентичность изменений в конъюнктиве и других органах в условиях патологии позволяет эктраполировать на печень результаты, в частности, у больных с ее хронической вирусной патологией [57].
Конъюнктивальную биомикроскопию проводили всем больным в первые дни поступления в стационар. Исследование не выполнялось пациентам с локальными воспалительными состояниями, с патологией роговицы и век. Повторно методику использовали через 12 недель противовирусной терапии хронического вирусного гепатита и вирусного цирроза печени для оценки микроциркуляторных сдвигов в динамике.
Конъюнктивальную биомикроскопию сосудов темпоральной части глазного яблока осуществляли с помощью щелевой лампы ЩЛ-56 при 60-кратном увеличении. Состояние микроциркуляции оценивали по качественно-количественной системе критериев, предложенной Л.Т.Малой и соавт. [41]. Выявлялись изменения сосудов (соотношение диаметров артериол и венул, неравномерность калибра, меандрическая, извитость, венулярные саккуляции, микроаневризмы, сосудистые клубочки, сетевидная структура сосудов, состояние артериоловенулярных анастомозов, количество функционирующих капилляров); внесосудистые изменения (периваскулярный отек и геморрагии) и нарушения внутрисосудистой гемодинамики (сладж-феномен и микротромбы). Каждый признак в зависимости от выраженности оценивали в баллах (от 1 до 5) при максимально возможном количестве баллов 37. Сумма всех баллов, полученных при анализе микроциркуляции больного, составляла общий (интегральный) конъюнктивальный индекс. С целью более дифференцированной оценки состояния конечного кровотока вычисляли парциальные индексы, характеризующие периваскулярные (КИї), сосудистые (КИ2), и внутрисосудистые (КИ3) изменения. В контрольной группе, состоящей из 42 практически здоровых людей, интегральный конъюнктивальный индекс составил 2,40+0,20 баллов, КИї -0,04±0,04 балла, КИ2 - 2,35±0,18 баллов, КИ3 - 0,02±0,02 балла. 3.3. Определение уровня эндотелиальных маркеров в плазме крови 3.3.1. Определение содержания эндотелина-1 в плазме Содержание эндотелина-1 в плазме крови определяли с использованием стандартного тест-набора («Biomedica-Gruppe», Австрия) в соответствии с инструкцией. Образцы плазмы, стандарты и контроли в количестве 50 мкл вносились в лунки планшета, сорбированные поликлональными антителами к эндотелину, добавляли по 200 мкл детектирующих моноклональных мышиных антител к эндотелину и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. После инкубации и пятикратной промывки буфером добавлялся ферментный конъюгат, содержащий анти-мышиные IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена, по 200 мкл в каждую лунку с последующей инкубацией в течение 60 минут при комнатной температуре. После пятикратной промывки буфером вносился субстратный раствор тетраметилбензидина в количестве 200 мкл в каждую лунку. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре реакция останавливалась добавлением 50 мкл стоп-реагента. Интенсивность окраски раствора измеряли с определением оптической плотности на автоматическом фотометре вертикального сканирования («Мультискан», Венгрия) при длине волны 450 нм. Оптическая плотность раствора была прямо пропорциональна концентрации эндотелина-1, присутствующего в образце. Строили калибровочную кривую, по которой находили искомые концентрации эндотелина-1 в образцах плазмы. Минимально определяемая концентрация эндотелина-1 равна 0,02 фмоль/мл. У 30 здоровых добровольцев плазменная концентрация эндотелина-1 составила 0,23±0,03 фмоль/мл.
Содержание оксида азота в плазме крови определяли по количеству нитратов (NCV) и нитритов (N02") с использованием стандартного тест-набора («R&D Systems», США) в соответствии с инструкцией.
В основе метода лежит колориметрическое определение в реакции Грисса эндогенного нитрита, затем превращение нитрата в нитрит с использованием нитрит-редуктазы и измерение общего нитрита. Для получения концентрации нитрата вычисляется концентрация эндогенного нитрита из значения общего нитрита. Реакция Грисса основана на двухстадийной реакции диазотирования, в которой нитрит производит нитрозатирующий агент, реагирующий с сульфаниловой кислотой с образованием иона диазония. Этот ион присоединяется к К-(1-нафтил)-этилендиамину с формированием цветного азопроизводного, который поглощает свет на длине волны 540 нм.
При анализе эндогенного нитрита разведенные в два раза образцы плазмы, стандарты в количестве 50 мкл вносились в лунки планшета, добавлялись реакционный разбавитель, реактивы Грисса I и II, каждый по 50 мкл и инкубировались в течение 10 минут при комнатной температуре. После инкубации интенсивность окраски раствора измеряли с определением оптической плотности на автоматическом фотометре вертикального сканирования («Мультискан», Венгрия) при длине волны 540 нм. Оптическая плотность раствора была прямо пропорциональна концентрации эндогенного нитрита, присутствующего в образце.
Строили калибровочную кривую, по которой находили искомые концентрации эндогенного нитрита в образцах плазмы. При анализе нитрата разведенные в два раза образцы плазмы, стандарты в количестве 50 мкл вносились в лунки планшета, добавлялись NADH и нитрат-редуктаза по 25 мкл и инкубировались в течение 30 минут при 37 С. Затем вносились реактивы Грисса I и II, каждый по 50 мкл и инкубировались в течение 10 минут при комнатной температуре. После инкубации интенсивность окраски раствора измеряли с определением оптической плотности на автоматическом фотометре вертикального сканирования («Мультискан», Венгрия) при длине волны 540 нм.
Строили калибровочную кривую, по которой находили искомые концентрации общего нитрита в образцах плазмы. После этого определяли концентрация нитрата в образце плазмы путем вычитания из концентрации общего нитрита концентрации эндогенного нитрита. У 40 здоровых добровольцев суммарное содержание нитратов и нитритов (NCV/NCV) составило 32,54±2,64 мкмоль/л.
Состояние микроциркуляторного русла у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени
Особенности микроциркуляции по данным конъюнктивальной биомикроскопии были изучены у 120 больных ХВГ и ЦП (77 мужчин и 43 женщины) в возрасте от 18 до 58 лет. Диагноз ХВГ В был установлен у 22 пациентов, ХВГ С - у 62, ХВГ D - у 6. Цирроз печени вирусной этиологии был выявлен у 30 больных, в том числе у 20 HCV-ассоциированный и у 10 на фоне HBV-инфекции. К классу А по Child-Pugh были отнесены 12 больных ЦП, к классам В и С — 18 больных. Для сравнительного анализа использовались значения конъюнктивальных индексов у 42 здоровых добровольцев. Показатели интегрального и парциальных конъюнктивальных индексов у здоровых и больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени представлены в таблице 4.1.1. Таблица 4.1.1 Конъюнктивальные индексы у здоровых и больных ХВГ и ЦП (X±s-) Показатель КИ (баллы) Группы обследованных здоровые, п=42 больные ХВГ, п=90 ЦП, п=30 кии 2,40±0,20 6,92±0,19 9,42±0,40 / КИ, 0,04±0,04 1,01±0,09 1,18±0,13 ки2 2,35±0,18 5,75±0,16 6,89+0,32 / КИз 0,02±0,02 0,17+0,05 1,36±0,18 / - р 0,05 по сравнению со здоровыми; - р 0,05 между группами больных.
Показатели КИИ, КИь КИ2 были увеличены у пациентов с хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени, при этом значения интегрального КИ и его сосудистых и внутрисосудистых составляющих в случаях ЦП достоверно превышали соответствующие показатели в группе хронического гепатита. КИ3, характеризующий внутрисосудистые изменения, возрастал при циррозе печени и не изменялся в случаях хронического гепатита.
Как видно из таблицы, у больных хронической патологией печени изменения микроциркуляторного русла касались в основном сосудистого компонента КИ, который составлял от 73,16±1,09% при ЦП до 83,72+1,24% при ХВГ. Периваскулярные изменения также не различались в исследуемых группах больных, занимая удельный вес от 14,34+1,04% при ХВГ до 12,53±1,34% при ЦП. Вместе с тем внутрисосудистые нарушения вносили небольшой вклад в КИ при хроническом гепатите (1,95±0,54%), что было достоверно ниже удельного веса их в. случаях цирроза печени (14,43±1,22%, р 0,05).
Установлено, что параметры микроциркуляции, будучи повышенными, не различались в зависимости от пола больных при хроническом гепатите и циррозе печени, хотя отмечена тенденция к более низким значениям КИИ (КИ2, КИ3) у женщин с циррозом печени. Также конъюнктивальные индексы не различались в зависимости, от возраста больных, хотя отмечалась некоторая тенденция к более высоким значениям КИз у больных циррозом печени среднего возраста второго периода.
Показатели микроциркуляции также не зависели от степени вирусной нагрузки (высокая или низкая) при HCV- и HBV-инфекции, хотя при HCV-инфекции определялась достоверная положительная корреляция между КИИ и степенью виремии (г= 0,30; р 0,05). Тип гепатотропного вируса (HBV или HCV) не оказывал влияния на показатели микроциркуляции при вирусном циррозе печени. При изучении изменений в микроциркуляторном русле у больных с разной степенью тяжести мезенхимально-воспалительного синдрома выявлено, что все конъюнктивальные индексы (кроме КИз при хроническом вирусном гепатите): были увеличены с достоверно более высокими значениями КИ, у больных XBF, а показателей интегрального КИ и КИ, - у пациентов с ЦП при тяжелом мезенхимальном воспалении. Холестатический синдром не влиял на состояние микроциркуляции, хотя отмечены более высокие величины КИ, у больных циррозом печени при наличии холестаза (табл. 4.1.5, 4.1.6). /
Анализ микроциркуляторных нарушений у больных ЦП с учетом критериев интегрированного индекса тяжести Child-Pugh показал, что при прогностически тяжелых случаях (классы В и С) регистрировались максимальные значения интегрального КИ и КИ3, достоверно отличающиеся от таковых при компенсированном варианте заболевания (табл. 4.1.7). Увеличение КИИ сочеталось с наличием позитивной корреляции с индексом Child-Pugh (г = 0,30; р 0,05).
Таблица 4.1.7
Конъюнктивальные индексы у больных циррозом печени различной тяжести (по индексу Child-Pugh) (X+ ).
Проведена оценка динамики параметров микроциркуляции у больных циррозом печени в зависимости от выраженности нарушений портальной гемодинамики. Конъюнктивальные индексы были повышены при любой степени портальной гипертензии с максимальными значениями КИИ и КИ3 в случаях суб- и декомпенсации портального кровотока .
