Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Исследование ангиогенеза опухолей (литературный обзор) 10
ГЛАВА 2. Материал и методы 51
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 62
3.1. Дифференциальная диагностика первичных карцином печени. 62
3.2. Изучение экспрессии гепатоцитарного антигена в первичных карциномах печени . 69
3.3. Изучение влияния клинико-морфологических показателей на выживаемость больных первичными карциномами печени. 73
3.4. Количественная оценка микррциркуляторного русла в первичных раках печени по маркеру CD31. 76
3.5. Изучение морфо-функционального состояния микроциркулятор-ного русла в первичных раках печени с помощью маркеров, отражающих дифференцировку гладкомышечных клеток (гладкомышечный актин, калпонин). 90
3.6. Изучение факторов ангиогенеза в сопоставлении с плотностью микрососудистого русла. , Q ,
3.6. Изучение показателей цитоморфометрии (площадь ядра и цито плазмы, ядерно-цитоплазматическое соотношение) в первичных раках печени.
3.7. Изучение экспрессии общего лейкоцитарного антигена (CD45RB) в первичных раках печени. 124
3.8. Изучение экспрессии СК LW, СК19, CEAp, CD10, TTF, &-фетопротеина в первичных раках печени. 127
3.9. Однофакторный анализ прогностической значимости клинических, морфологических и иммуногистохимически признаков. 136
3.10. Многофакторный анализ прогностической значимости клинических, морфологических и иммуногистохимически признаков. 157
3.11. Регрессионная модель Кокса в анализе выживаемости больных первичным раком печени (ГЦК). 163
ГЛАВА 4. Обсуждение и заключение. 167
Выводы. 179
Практические рекомендации. 181
Список литературы. 183
- Изучение экспрессии гепатоцитарного антигена в первичных карциномах печени
- Количественная оценка микррциркуляторного русла в первичных раках печени по маркеру CD31.
- Изучение экспрессии общего лейкоцитарного антигена (CD45RB) в первичных раках печени.
- Многофакторный анализ прогностической значимости клинических, морфологических и иммуногистохимически признаков.
Введение к работе
Актуальность темы.
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является одной из наиболее часто встречаемых злокачественных опухолей, особенно в определенных регионах мира (Гранов A.M., Петровичев Н.Н., 1977), и составляет более 90% всех первичных раков печени. Ежегодно в мире регистрируется более 500 000 новых случаев этой опухоли, однако распространенность ее неравномерна. Так, в Северной Америке ежегодно регистрируется 3,2 случая на 100000 населения, а в странах Юго-Восточной Азии доходит до 35,8/100000 человек (Hirphashi S. и соавт., 2000). В тоже время имеются сведения о резком учащении этих опухолей в США (El-Serag Н. В.2002), что привело к двукратному увеличению смертности от онкологических заболеваний за последние 20 лет. Вторая разновидность злокачественных опухолей печени - холангиоцеллюлярный карцинома (ХЦК) также характеризуется резко выраженными географическими различиями: США-0,4, а Таиланд-84,6 на 100000 жителей (Nakamuna Y. и соавт., 2000) Средняя продолжительность жизни у больных с первичными раками печени (гепа-тоцеллюлярным раком и холангиоцеллюлярным раком) является одной из наименьших, не превышая 8 мес. с момента установления диагноза (Schoniger-Henike М, 2001).
Известно, что лучшие данные выживаемости среди пациентов со злокачественными опухолями печени достигаются путём выполнения радикальных резекций (Таразов П.Г., 2001). Однако такие операции до сих пор осуществимы лишь у 5-15% больных (Гранов A.M. и Таразов П.Г., 1999). Низкая эффективность различных хирургических, химио- и радиотерапевтических методов лечения заставляет искать новые подходы к терапии первичных раков печени (Гранов A.M., Петровичев Н.Н., 1977).
Одним из таких направлений может быть разработка так называемой антиангиогенной терапии (Kerbel Т., 2002), которая базируется на специфическом действии противоопухолевого химиотерапевтического средства на сосудистое русло опухоли, таким образом, редуцируя его, приводит к некробиотическим и апоптотическим изменениям в самой опухоли.
В настоящее время опухолевый неоангиогенез интенсивно изучается во многих странах в различных аспектах: роль его в патогенезе опухолевого роста, диагностических методах, в качестве противоопухолевой терапии, прогностических маркеров течения онкологических заболеваний, значение разработки методов интервенционной радиологии и хирургических способов лечения разнообразных опухолей.
Учение об опухолевом ангиогенезе, инициированное и обоснованное J. Folkman (Folkman J., 1971), и развитое другими исследователями (Harris A.L., 1997; Hoeben А. и соавт., 2004; Holash J. и соавт.,1999; Kerbel R.S., 2000), оказалось весьма продуктивным в онкоморфологии. Оно, с одной стороны, внесло много важных фактов в патогенез опухолевого роста (Hanahan D., Folkman J., 1996; Harris A.L., 1997; Hoeben А. и соавт., 2004; Holash J. и соавт., 1999), а, с другой стороны, стало значительным достижением в практической медицине как для поиска новых мишеней лекарственного воздействия на опухоль, так и в определении прогноза при многих онкологических заболеваниях. В этом направлении проведено огромное количество исследований, показавших, что степень кровоснабжения опухоли является фактором, определяющим клиническое течение новообразования (Gasparini G., Harris A.L., 1999). Такие сведения получены для рака молочной железы (Vartanian R.K., Weidner N., 1994), простаты (Halvorsen O.J. и соавт., 2000), легкого (Fontanini G. и соавт., 1997), мела-номы (Graham С.Н. и соавт., 1994). К сожалению, в нашей стране это важное и крайне перспективное направление практически не получило разви-
тия. В то же время, в связи с внедрением в научные исследования методов иммуногистохимии, создались хорошие предпосылки для широкого и глубокого изучения проблемы опухолевого неоангиогенеза в самых различных направлениях. Сейчас трудно найти опухоли, которые не подвергались бы изучению в плане особенностей их ангиогенеза.
Однако, ангиогенезу в опухолях печени посвящено мало исследований. Кроме того, в работах, по изучению ангиогенеза в гепатоцеллюляр-ной карциноме, обычно используются единичные иммуногистохимиче-ские маркеры [Kimura Н. и соавт.. 1998; Jin-no К. и соавт., 1998; Li Х.М. и соавт., 1999; Sasaki Y. и соавт., 2002; Sugimachi К. и соавт., 2003; Moon W.S. и соавт., 2003; Chen X. и соавт., 2004.], что не дает возможности получить целостное представление об этом процессе в опухоли. Для этого необходимы комплексные исследования с анализом экспрессии многочисленных маркеров, отражающих как уровень неоангиогенеза, так и факторы его регуляции.
Этому способствует широкое распространение компьютерных технологий (цифровые камеры, анализаторы изображений и т.д.) для использования морфометрии, в частности для количественной и качественной характеристики кровоснабжения новообразований. При компьютерной обработке изображений достигается высокая воспроизводимость результатов за счет большого массива исследованных объектов (Ваак К., 1994; Sallinen С, 1994). Осуществление такого изучения возможно только в центрах, занимающихся оперативной гепатологией и владеющих многочисленными иммуногистохимическими технологиями и способами мор-фометрического анализа.
Цель исследования.
Целью настоящей диссертационной работы является комплексное сравнительное иммуногистохимическое изучение уровня развития микроциркуляторного русла (плотности микрососудов на единицу площади), степени его дифференцировки и факторов ангиогенеза в гепатоцеллю-лярном и холангиог\еллюлярном раках с для определения роли степени кровоснабжения опухоли в ее биологическом поведении (клиническом течении) и исходе заболевания.
Эта цель реализована путем использования широкой панели имму-ногистохимических маркеров (более 15), отражающих гистогенетическое происхождение опухоли, степень развития ее микроциркуляторного русла и факторов, способствующих опухолевому неоангиогенезу с количественной оценкой перечисленных факторов при помощи компьютерного анализа изображений.
Задачи исследования.
Разработка оптимальной иммуногистохимической панели для определения нозологической формы (гистогенеза) первичных опухолей печени гепатоцеллюлярные, холангиоцеллюлярные карциномы
Разработка оптимальных способов исследования сосудистого статуса опухоли, методики измерения плотности микрососудистой сети, экспрессии факторов ангиогенеза и их соотношения с выраженностью микроциркуляторного русла.
Количественная оценка микроциркуляторного русла в первичных раках печени.
Изучение морфо-функционального состояния микроциркуляторного русла в первичных раках печени с помощью маркеров, отражающих дифференцировку гладкомышечных клеток.
.Выявление значения плотности микрососудов, уровни их дифферен-цировки и факторов ангиогенеза в клиническом поведении первичных опухолей печени (рецидивирование, метастазирование, выживаемость) на основании изучения корреляционных связей между изучаемыми параметрами
Изучение факторов ангиогенеза: VEGF, ангиопоэтин - 1, ангиопоэтин - 2 в сопоставлении с количественными параметрами микроциркуля-торного русла.
Построение математической модели клинического поведения опухоли печени по количественным показателям оценки экспрессии имму-ногистохимических маркеров.
Научная новизна исследования.
Впервые проведено комплексное клинико-иммуногистохимическое исследование первичных карцином печени с одновременным определением ряда маркеров, характеризующих наиболее важные патогенетические особенности опухоли, а именно, микрососудистую плотность (количество микрососудов сосудов, суммарный периметр микрососудов и суммарная площадь просвета на единицу площади препарата), ядерно-цитоплазматическое соотношение, воспалительную лейкоцитарную реакцию, экспрессия факторов ангиогенеза (эндотелиальный сосудистый фактор роста, ангиопоэтины 1 и 2).
Показано, что суммарный периметр стенки микрососудов и суммар
ная площадь просвета являются высокозначимыми прогностическими
признаками. Впервые показано взаимодействие изученных морфометри-
ческих показателей микрососудистой плотности, ядерно-
цитоплазматического соотношения, воспалительной лейкоцитарной реак-
ции и экспрессии факторов ангиогенеза, обусловливающее биологическое поведение ГЦК.
Основные положения, выносимые на защиту:
Наиболее адекватным гистогенетическим маркером ГЦК является ге-патоцитарный антиген (HepParl) чувствительность 100%, специфичность 92%, а ХЦК - СК19 чувствительность 83%, специфичность 78%
ГЦК характеризуется богатой, равномерно распределенной сосудистой сетью, что может служить дифференциально-диагностическим признаком для отличия ее от гиперпластических изменений печени, с одной стороны, холангиоцеллюлярной карциномы, с другой.
3. Выраженность микроциркуляторного русла ГЦК, определенная по сумме периметров сосудов и или сумме площади сечения сосудов, выявляемых иммуногистохимическим маркером эндотелия CD31, служит достоверным прогностическим признаком для оценки общей и безрецидивной выживаемости больных этим типом рака. 4. Экспрессия факторов ангиогенеза (VEGF, ангиопоэтины 1 и 2), определенная иммуногистохимически не является прогностическим признаком для оценки общей и безрецидивной выживаемости больных ГЦК.
Изучение экспрессии гепатоцитарного антигена в первичных карциномах печени
Микрососудистое русло в первичных рака печени оценивали по методике, предложенной в 1994 году N.Weidner - MVD, и по методике основанной на определении суммарного периметра сосудистой стенки (периметр) и определение суммарной площади сечения сосудов (площадь) приходящихся на единичное поле зрения при увеличении х400 (размер поля зрения - 0,054 мм2) смотри рис.12.
MVD и суммарная длина сосудистой стенки (периметр) определялись в одних и тех же полях в опухоли (о), перифокальной зоне (п) и в нормальной печени. Показатели микрососудистого русла определяли отдельно в двух группах: ГЦК и ХЦК. В целях оценки влияния окружающей ткани печени т.е. организма пациента на опухолевый ангиогенез был рассчитан и оценен показатель отношения плотности микрососудистого русла в опухоли и перифокальной зоне (табл. 15,16).
Средняя плотность микрососудов в ГЦК составила 58.4±5,46 на единицу площади (0,22 мм ), а в прилежащей неопухолевой зоне -10,1 ±1,95, что практически в 6 раз ниже чем в опухоли. Для сравнения скажем, что в нормальной печени число микрососудов на единицу площади , суммарный периметр сосудов в ГЦК составил 1830,3±130,29 мкм/0,0549 мм2, а в прилежащей неопухолевой зоне 486,2±56,02 мкм/0,0549 мм2. Анализируя эти показатели, можно сказать, что количество сосудов в ГЦК больше, а протяженность их ниже ,чем в окружающей ткани печени, т.е. для ГЦК характерно большее число мелких сосудов. Таблица 17 Количественные показатели микрососудистого русла в ХЦК Показатель Ед. изм. Среднее Ст. ошибка Уровень р Уровень t MVD0 шт/п.з 11,767 1,012 0,00001 11,63 MVDn шт/п.з 5,688 1Д28 0,00014 5,04 MVD0/n 3,907 1,033 0,00182 3,78 периметро мкм 1201,810 103,335 0,00001 11,63 периметрп мкм 784,600 59,009 0,00001 13,30 периметр0/п 1,698 0,186 0,00001 9,109
При анализе ХЦК нами получены следующие показатели: плотность микрососудов составила 11,8±1, 01/0,22 мм2 в ХЦК - 1201,8 ±1003,33 мкм/0,0549 мм". Резюмируя, можно сказать, что для ХЦК характерно небольшое количество сосудов большой протяженности.
При анализе показателей прилежащей к опухоли зоны в ГЦК и ХЦК нами получены следующие результаты: при ГЦК в перифокальной зоне плотность микрососудов выше , чем при ХЦК 10,1 ±1,95/0,22 мм2 против 5,7± 1,13/0,22 мм", а суммарный периметр при ГЦК короче, чем при ХЦК: 486,2±56,02 мкм/0,0549 мм2 против 784,6±59,01 мкм/0,0549 мм2, т.е. процессы построения сосудов в перифокальной неопухолевой зоне печени сходны и повторяют те, что характерны для первичной опухоли: для ГЦК и перифокальной зоны при ГЦК характерно большое количество мелких сосудов, а для ХЦК и перифокальной зоны при ХЦК характерен другой паттерн - небольшое количество длинных сосудов.
Как видно из указанных таблиц, показатели обладают высокой степенью достоверности по уровню р и t и большей достоверностью обладают показатели на основе суммарной длины сосудистой стенки. Все показатели при Test для одиночных показателей обладают высоким уровнем достоверности, что позволило количество исследуемых пациентов посчитать достаточным для применения статистических методов исследования. Таблица 18
Сравнение показателей микрососудистого русла в ГЦК и ХЦК (табл. 18, 19) указывает на значимое различие плотности микрососудов в сравниваемых группах и это делает иммуногистохимический маркер CD31 ценным диагностическим средством. Необходимо отметить, что реакция перифокальной ткани печени по показателю MVD в обеих группах различается недостоверно, а по показателю суммарной длины различие достоверно. Плотность микрососудистого русла в опухоли значительно выше в группе ГЦР, более чем в 5 раз по показателю MVD, а по показателю суммарной длины только в 1,5 раза. Если рассматривать плотность микрососудистого русла в перифокальной зоне, достоверная разница обнаруживается только по показателю суммарной длины сосудов. Причем реакция перифокальной зоны выше на опухоль в ХЦК почти в два раза.
При анализе общей и безрецидивной выживаемости способом test для группирующих показателей, в подгруппе с MVD0 (в опухоли) выше медианы — 56 шт./0,216 мм средняя выживаемость составила 83,8 мес. (ст. отклонение 94,05 мес), ниже медианы - 43,7 мес. (ст. отклонение 48,91 мес), при р=0,23. График выживаемости по методу Каплана-Мейера (рис. 17) (Cox s Fest, р = 0,087), 5-летняя выживаемость 45% и 25% соответственно.
MVD 56 MVD Рис. 17. График выживаемости по методу Каплана-Мейера в зависимости от количества микрососудов в ГЦК. Средняя безрецидивная выживаемость в подгруппах достоверно не отличалась. График безрецидивной выживаемости по методу Каплана-Мейера (рис. 18) (Cox s Fest, р = 0,092), 20-месячная безрецидивная выживаемость 75% и 42% соответственно.
При анализе общей и безрецидивной выживаемости способом test для группирующих показателей, в подгруппе с MVDo/n - соотношение количества микрососудов в опухоли к количеству их в перифокальной зоне выше медианы - 8,1 средняя выживаемость составила 93,6 мес. (ст. отклонение 82,86 мес), ниже медианы 32,0 мес. (ст. отклонение 47,19 мес), при р=0,051. График выживаемости по методу Каплана-Мейера (рис. 19) (Cox s Fest, р = 0,044), 5-тилетняя выживаемость 56% и 14% соответственно. В данном случае наблюдается достоверное влияние относительного показателя на общую выживаемость, но полученный результат противоречит теории ангиогенеза.
Количественная оценка микррциркуляторного русла в первичных раках печени по маркеру CD31.
В первичных раках печени калпонин экспрессировался в цитоплазме опухолевых клеток, в цитоплазме гепатоцитов перифокальной зоны и гладкомышечных элементах стенки сосудов опухоли, перифокальной зоны и псевдокапсулы. По экспрессии этого маркера невозможно выделить сосудистую стенку и определить микрососудистую плотность как по маркеру CD31. В ГЦК по экспрессии калпонина проводился подсчет гладкомышечных клеток сосудистой стенки: на фиксированных изображениях (ув. х400) подсчитывались гладкомышечные клетки, расположенные возле идентифицированных сосудов, по эндотелиоцитам и эндотелиальной выстилке в 5-10 полях зрения. В более чем 50 % случаев ГЦК калпонин не экспрессировался в гладкомышечных клетках сосудистой стенки. Среднее количество гладкомышечных клеток сосудистой стенки, экспрессирующих калпонин 3,4±1,04 шт/0,054 мм (стандартное отклонение 5,86 шт/0,054 мм ). Количественный анализ: подсчет количества гладкомышечных клеток, экспрессировавщих калпонин, не дал значимых результатов для выживаемости. Исследование количества гладкомышечных клеток маркированных калпонином проводился с целью оценить зависимость количества зрелого и незрелого гладкомышечного актина, и их соотношения на выживаемость.
Анализ выживаемости не выявил влияния количества гладкомышечных клеток, маркированных калпонином, показателей отношения суммарного периметра и суммарной площади сечения микрососудов к количеству гладкомышечных клеток, маркированных калпонином, на выживаемость и безрецидивную выживаемость способом test для группирующих показателей и методом Каплана-Мейера.
Иммуногистохимический маркер калпонин считается показателем зрелости гладкомышечных клеток, поэтому было высказано предположение, что отношение количества гладкомышечных клеток маркированных калпонином и гладкомышечным актином будет влиять на выживаемость. Данное предположение в нашем исследовании не подтвердилось.
Экспрессия калпонина в ГЦК (Ув. х50).
В дальнейшем были рассчитаны совокупные показатели, учитывающие разность количества гладкомышечных клеток сосудистой стенки, маркированных калпонином и гладкомышечным актином (т.е. количество незрелых гладкомышечных элементов), с одной стороны и микрососудистую плотность, суммарный периметр, суммарное поперечное сечение сосудов, с другой стороны. Таблица 24 Количественные показатели экспрессии калпонина в ГЦК. Показатель Среднее Медиана Ст. отклонение Ст. ошибка шт/шт/0,054 мм2 0,66 0,44 0,628 0,117 мкм/шт/0,054 мм2 89,4 78,4 44,82 8,32 мкм /шт/0,054 мм 318,8 260,6 215,22 39,97 Рассчитанные показатели на общую и безрецидивную выживаемость влияния не оказывают.
С помощью анализатора изображения мы оценили площадь экспрессии калпонина к общей площади фиксированного изображения. Таблица 25 Количественные показатели экспрессии калпонина в ГЦК Показатель Ед. Среднее , Ст. Р t Калпонин s мкм 809,60 201,699 0,0003 4,01 Калпонин s % 1,501 0,367 0,0003 4,09
Все показатели при Test для одиночных показателей обладают высоким уровнем достоверности, что позволило количество исследуемых пациентов посчитать достаточным для применения статистических методов исследования.
Анализ выживаемости не выявил влияния экспрессии калпонина на выживаемость и безрецидивную выживаемость способом test для группирующих показателей и методом Каплана-Мейера.
Для оценки экспрессии маркера калпонин использовался и полуколичественный метод. Отдельно оценивали экспрессию калпонина в гепатоцитах опухоли и перифокальной зоны, в гладкомышечных элементах псевдокапсулы, в гладкомышечных элементах стенки сосудов опухоли и перифокальной зоны. Учитывали степень экспрессии калпонина по интенсивности окраски: (0 - нет окраски, 1 балл - слабое окрашивание, 2 балла - умеренное, 3 балла - выраженное окрашивание цитоплазмы). В последующем случаи со степенью окрашивания 0-1 балла были отнесены в подгруппу - 0 (отрицательные), со степенью окрашивания 2-3 в подгруппу -1 (положительные)
Из таблицы сопряженности выявлена высокая диагностическая значимость калпонина для дифференциального диагноза первичных раков печени. Калпонин экспрессируется в гепатоцитах перифокальной ткани печени в 96% случаев первичного рака печени (можно использовать как внутренний позитивный контроль). Высокой диагностической значимостью обладают два показателя: экспрессия калпонина в гладкомышечных элементах псевдокапсулы опухоли (р=0,0001) и экспрессия в клетках опухоли особенно в опухолях ХЦК (р=0,0004). Анализ выживаемости не выявил влияния параметрических показателей экспрессии калпонина на выживаемость и безрецидивную выживаемость способом test для группирующих показателей и методом Каплана-Мейера.
Изучение экспрессии общего лейкоцитарного антигена (CD45RB) в первичных раках печени.
Экспрессия указанных маркеров в первичных опухолях печени позволяет провести дифференциальную диагностику ГЦК негативных к гепатоцитарному антигену от ХЦК, а так же ХЦК от метастазов прочих локализаций.
Оценку степени экспрессии этих иммуногистохимических маркеров в опухолях первичных раков печени проводили по полуколичественной методике как отсутствие экспрессии, слабо положительная и выраженная экспрессия. В дальнейшем для простоты анализа все случаи со слабой и выраженной экспрессией отмечены как позитивные, остальные как негативные. Для иммуногистохимических маркеров CEAp, CD 10 дополнительно проводили оценку каналикулярного рисунка окрашивания, выявляя желчные капилляры.
Положительное окрашивание СК LW в опухолевых гепатоцитах. СК LW (цитокератин низкого молекулярного веса, СК 8) является промежуточным филаментом, для которого характерна экспрессия в нормальных гепатоцитах. Считается, что в процессе злокачественной трансформации этот антиген сохраняется и в опухолевых гепатоцитах. Мембранное и цитоплазматическое окрашивание обнаружено в 72% случаев ГЦК и в 83% случаев ХЦК.
СК19 принадлежит к кислому типу цитокератинов и является цитокератином с низкой молекулярной массой. СК19 экспрессируется в простых эпителиях, поверхностных, промежуточных и базальных клетках переходного эпителия, а также в люминальных, базальных и миоэпителиальных клетках сложного эпителия. СК 19. Экспрессия этого цитокератина характерна для эпителия желчных протоков в норме и сохраняется в опухолях с признаками билиарной дифференцировки. Мембранное и цитоплазматическое окрашивание СК 19 обнаружено в 3% ГЦК и 65% ХЦК.
CD 10 это одноцепочный клеточный поверхностный гликопротеин, также обозначаемый как общий антиген острых лимфобластных лейкемий и нейтральная эндопептидаза. CD 10 является цинк-зависимой пептидазой (металлопротеазой), определяемой в различных биоактивных пептидах. CD 10 присутствует в костном мозге, определяется в энтероцитах, в желчных протоках и др. В ГЦК для CD 10 характерен каналикулярный рисунок окрашивания мембран опухолевых гепатоцитов, который встречался в 59% случаев, в ХЦК-17%.
CEAp - канцероэмбриональный антиген является гликопротеином. СЕАр имеет перекрестную реакцию с биллиарным гликопротеином I. Окрашивание СЕА р в ГЦК имеет подобно CD 10 характерный каналикулярный рисунок. В нашем исследовании СЕАр встречался в ГЦК в 91%о случаев, в ХЦК - в 87% фетопротеин 3(10%) 29 (90%) Неисследовали Как следует из таблицы, экспрессия CKLW наблюдалась в 72% ГЦК в оставшихся 28% случаев экспрессии CKLW не встречалось. В 83%) ХЦК также наблюдалась экспрессия этого маркера, а в 17%) нет. Таким образом, частота встречаемости или отсутствия этого маркера в ГЦК и ХЦК приблизительно одинаковы, что исключает возможность проведения дифференциально-диагностического анализа между первичными раками печени, используя этот маркер. Экспрессия СК19 наблюдалась лишь в 9% ГЦК, а в 91%о случаев этот маркер отсутствовал, в то время как в ХЦК СК19 экспрессировался в 65% случаев и отсутствовал в 35%. Это означает, что маркер билиарной дифференцировки СК19 может встречаться в ГЦК, но его экспрессия сохраняется в ХЦК. Специфичность и чувствительность СК 19 для ХЦК является высокой. ГЦК в 95% (30) случаях были позитивны к гепатоцитарному антигену, что свидетельствует о высокой чувствительности и специфичности этого маркера. Экспрессия CD 10 наблюдалась в 59% ГЦК, а в 41% случаев этот маркер отсутствовал, в то время как в ХЦК СК19 экспрессировался в 17% случаев и отсутствовал в 83% (р=0,0046, % с поправкой Иетса=8,5). Специфичность и чувствительность CD 10 для ГКЦ средняя. В итоге были составлены таблицы частот признаков, по которым проведен анализ разницы частоты встречаемости признака в ГЦК и ХЦК с помощью составления таблиц сопряженности 2x2. Таблица 39.
Таблица сопряженности 2x2 для оценки экспрессии СК19 в первичных карциномах печени. Показатели позитивные негативные Частота, ГЦК 3 29 Частота, ХЦК 15 8 X2(drM) 18,95 р = 0,00001 % с поправкой Йетса 16,50 р = 0,00001 9Ф 0,34461 Р - значения для статистики % и статистики %2 с поправкой Йетса: 0,00001, таким образом на уровне значимости 0,05 принимается гипотеза о зависимости окрашивания иммуногистохимическим маркером СК19 от гистологического диагноза.
Таблица сопряженности 2x2 для оценки экспрессии CD 10 в первичных карциномах печени. Показатель позитивные негативные Частота, ГЦК 19 13 Частота, ХЦК 4 19 X2(dfM) 9,69 р = 0,0018 X2 с поправкой Йетса 8,05 р = 0,0046 2 Ф 0,17626 131 P - значения для статистики %2 и статистики %2 с поправкой Йетса: соответственно равны 0,0018 и 0,0046, таким образом на уровне значимости 0,05 принимается гипотеза о зависимости окрашивания иммуногистохимическим маркером CD 10 от гистологического диагноза.
Иммуногистохимические маркеры СК19 и CD 10 обладают высокой диагностической значимостью для дифференциальной диагностики ГЦК от ХЦК.
Составление таблиц сопряженности 2x2 по иммуногистохимическим маркерам СК LW и СЕАр не показал значимых различий экспрессии этих маркеров в ГЦК и ХЦК. Два случая ГЦК, негативных к гепатоцитарному антигену, оценены как негативные к маркерам СК19 и CD 10.
Из восьми случаев ХЦК негативных к СК19, четыре случая были оценены как негативные к СК LW и в этих же случаях не выявлен по экспрессии гладкомышечного актина сетчатый или синусоидныи рисунок экспрессии гладкомышечного актина. Можно предположить, что данные случаи являются метастазами неясного генеза, но подобное предположение требует более тщательного исследования.
Многофакторный анализ прогностической значимости клинических, морфологических и иммуногистохимически признаков.
1. Гистогенез первичных карцином печени (гепатоцитарный антиген, СК LW, СК19, CEAp, TTF, CD 10). Изучение экспрессии в первичных раках печени. Определение диагностических критериев и иммуногистохимических маркеров, позволяющих установить нозологическую форму опухоли печени (холангио,-гепатоцеллюлярные, смешанные новообразования).
Пациенты с холангиоцеллюлярным раком или со смешанным (гепато-холангиоцеллюлярным) имеют значительно более худший прогноз заболевания, чем пациенты с чистым гепатоцеллюлярным раком [181, 271, 123, 165, 109, 166, 271] что было подтверждено и в нашем исследовании. Для разделения ГЦР и ХЦР и точной верификации холангиоцеллюлярного компонента исследователи используют различные комбинации цитокератинов. Так, считается, что экспрессия цитокератинов 7 и 19 характерна для холангиоцеллюлярного рака, а цитокератина 8 и пан-цитокератина - для гепатоцеллюлярного.
Использование широкой панели антител позволили выделить значительную группу ХЦК - 23 случая. Такое подразделение новообразований нашло отражение в выживаемости больных: среди ХЦК общая средняя выживаемость составила 19,7 мес, а при ГЦК она достигала 86,7 мес. [5].
Наиболее информативным является гепатоцитарный антиген, так как он является высокочувствительным и специфичным маркером гепатоцитов [150, 155, 287,297]. Чувствительность этого маркера по разным данным варьирует от 85% до 97% [155, 176]. Эпитопы, распознаваемые этим антителом (HepParl), являются компонентами мембран митохондрий гепатоцитов и не выявляются в митохондриях других типов нормальных тканей [83, 287]. В нашем исследовании показатели его чувствительности и специфичности совпадают с общепринятыми, и составили 100% и 92% соответственно.
Обнаружение гепатоцитарной дифференцировки достигается также обнаружением некоторых протеинов, синтезируемых и экспортируемых печенью в норме или патологии. К числу таких белков относятся альбумин, фибриноген, а-антитрипсин и а-фетопротеин [29]. Обнаружение м-РНК альбумина с помощью гибридизации in situ является однозначным доказательством наличия гепатоцитарной дифференцировки опухолевых клеток [133], так как альбумин может синтезироваться только гепатоцитами [150, 297]. Этот метод имеет высокую чувствительность (93%-96%) и специфичность, близкую к 100%.
Другим характерным антигеном, выявляемым при ГЦК, является секреция альфа-фетопротеина [48, 192]. Его присутствие в межклеточных канальцах является уникальной характеристикой ГЦК, другие опухоли очень редко экспрессируют этот маркер [45], но его низкая выявляемость (17%-65%) является препятствием для широкого использования этого белка на практике [120, 176]. Только небольшая часть ГЦК (по разным данным 17-40%) имеют позитивное окрашивание с этим маркером при иммуногистохимическом исследовании [29]. Чувствительность этого маркера варьирует по разным данным от 17% до 65% [120, 176]. В нашем исследовании обнаружение этого протеина не превысило 10% (3 случая), причем окрашивание во всех случаях было фокальным и слабым.
Межклеточные канальцы являются частью выводящей системы печени, которая отводит желчь из гепатоцитов в систему желчевыводящих путей. Специфическим антигеном, имеющим диагностическое значение при ГЦК, является поликлональный канцероэмбриональные антиген (р-СЕА), который имеет перекрестное окрашивание с билиарным гликопротеином 1 и экспрессируется в виде характерного каналикулярного рисунка окрашивания в гепатоцитах и опухолях из них [41, 120].
В нормальной печени окрашивание, достигаемое СЕ Ар и CD 10, каналикулярный рисунок окрашивания представляет собой длинную, разветвленную и зигзагообразную линию, расположенную между гепатоцитарными балками. Считается, что в условиях опухолевой
168
трансформации наличие специфического каналикулярного образца окрашивания является специфическим для ГЦК. По разным данным [41, 45, 124, 162] каналикулярное окрашивание СЕАр варьирует в пределах 50%-70% наблюдений. Чувствительность этого теста достигает по разным данным 50-90%, а специфичность - 47-71% [162, 176]. В нашем исследовании каналикулярный рисунок окрашивания СЕАр встречался в 47%, ГЦК и 10% ХЦК, что говорит о чувствительности этого показателя 63%, однако специфичность его довольно низка - 55%). В группе первичных карцином печени СЕАр не является надежным диагностическим критерием для разделения ГЦК и ХЦК. Следует отметить, что авторы, исследовавшие диагностическую ценность СЕАр и CD 10, рассматривали их в качестве инструментов в дифференциальной диагностике опухолей различной тканевой природы. Так PG Chu с соавт. [41] исследовали 96 ГЦК и 311 других негепатоцитарных опухолей, из них только 14 ХЦК, в то время как мы исследовали группу только первичных карцином печени. Различный материал и различные методические подходы и цели исследования ограничивают возможности сравнительного анализа.
![Клинико-морфологическое исследование гастродуоденальной зоны при бронхиальной астме [Электронный ресурс]](/i/i/4471/187413.png "Клинико-морфологическое исследование гастродуоденальной зоны при бронхиальной астме [Электронный ресурс] Корабельников Даниил Иванович")
