Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Клиника и диагностика диабетической полиневропатии 12
1.1.1. Клиника диабетической полиневропатии 12
1.1.2. Диагностика диабетической полиневропатии 14
1.2. Патогенез диабетической полиневропатии 18
1.2.1. Теории патогенеза диабетической полиневропатии 18
1.2.2. Активация полиолового пути 20
1.2.3. Неферментативное гликозилирование белков 22
1.2.4. Оксидативный стресс 23
1.2.5. Эндотелиальная дисфункция 25
1.2.6. Генетические факторы риска развития диабетической полиневропатии 27
1.2.7 Лечение диабетической полиневропатии 29
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1. Общая характеристика групп больных для генетического исследования 38
2.2. Общая характеристика групп больных для изучения эффективности таблетированной формы альфа-липоевой кислоты 41
2.3. Общая характеристика групп больных для изучения длительности эффекта внутривенного введения альфа-липоевой кислоты 42
2.4. Клинические методы диагностики диабетической полиневропатии... 43
2.5. Электромиографические методы оценки функционального состояния периферических нервов 47
2.6. Количественное сенсорное тестирование 48
2.7. Количественное автономное тестирование 50
2.8. Молекулярно-генетический анализ 51
2.9. Статистические методы анализа полученных результатов 54
Глава 3. Результаты собственных исследований Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с риском развития диабетической полиневропатии 56
3.1. Анализ ассоциации полиморфного микросателлита (АС)п гена альдозоредуктазы (ALR2) с развитием диабетической полиневропатии 56
3.2. Анализ ассоциации полиморфного микросателлита (СА)п гена NO-синтазы нейронов с развитием диабетической полиневропатии ... 59
3.3. Анализ ассоциации полиморфного микросателлита (ССТТТ)п гена индуцируемой NO-синтазы с развитием диабетической полиневропатии 61
3.4. Анализ ассоциации полиморфных маркеров ecNOS34a/4b и Glu298Asp гена NO-синтазы клеток эндотелия с развитием диабетической полиневропатии 62
Глава 4. Эффективность лечения диабетической полиневропатии альфа-липоевой кислотой 67
4.1. Сравнительная эффективность внутривенного введения и приема больших доз таблетированной альфа-липоевой кислоты у больных диабетической полиневропатией 67
4.2. Длительность действия курса внутривенного введения альфа-липоевой кислоты у больных диабетической полиневропатией 72
Обсуждение результатов 78
Выводы 101
Практические рекомендации 103
Список литературы
- Патогенез диабетической полиневропатии
- Общая характеристика групп больных для изучения длительности эффекта внутривенного введения альфа-липоевой кислоты
- Анализ ассоциации полиморфного микросателлита (СА)п гена NO-синтазы нейронов с развитием диабетической полиневропатии
- Длительность действия курса внутривенного введения альфа-липоевой кислоты у больных диабетической полиневропатией
Введение к работе
Актуальность темы. Число больных сахарным диабетом (СД) неуклонно растет во всем мире, в том числе и в России [Дедов И.И.,2003]. Эксперты ВОЗ оценивают ситуацию с СД, как «эпидемию неинфекционного заболевания». Рассчитано, что к 2010 году число больных СД в мире достигнет почти 240 млн. человек. При этом на первый план в качестве причины лимитирующей качество и продолжительность жизни выходят не осложнения непосредственно СД, то есть различные комы, а осложнения СД: невропатия, ретинопатия, нефропатия. По меткому выражению венгерского профессора П.Кемплера, «эпоха диабетических ком прошла, настала эпоха поздних осложнений диабета». Из всех форм диабетической невропатии наибольшее распространение, а следовательно, наивысшую медицинскую и социально-экономическую значимость имеет сенсорно-моторная симметричная дистальная полиневропатия - диабетическая полиневропатия (ДПН). Распространенность диабетической полиневропатии в России составляет чуть больше 50% в популяции больных СД [Дедов И.И. и др., 1997, 1998; Галеев И.В., 2003; Бурса Т.Р., 2004], что сопоставимо с распространенностью ДПН в США [Dyck P.J., Dyck P.J.B., 1999].
Целый ряд клинических факторов свидетельствует о том, что развитие ДПН определяется не только длительностью СД и качеством контроля СД, т.е. уровнем его компенсации, но и генетическими факторами. В пользу последнее говорит развитие ДПН у некоторых больных в очень короткие сроки после манифестации СД, в то время как у ряда больных и после 20 лет течения СД не удается выявить ни субклиническую, ни симптомную форму ДПН. Отчетливым маркером наличия генетической предрасположенности к какому-либо заболеванию является этническая зависимость к ее формированию. Для ДПН известно, что ее распространенность значительно варьирует между этническими группами. В России и США распространенность ДПН в популяции СД составляет более 50%, а у жителей Индийского субконтинента - менее 10%. Это подтвердили исследования распространенности ДПН в популяции больных СД, живущей на острове Маврикий, где основное население составляют индусы [Shaw J.E. et al.,1998, Ramachandran A. et al., 2000]. Впервые связь времени развития ДПН с генетическим фактором была показана в исследованиях, проведенных в России [Strokov I.A. et al., 2004]. Проведенные исследования связали развитие ДПН с полиморфизмом генов антиоксидантной защиты организма, в первую очередь, с геном супероксиддисмутазы [Бурса Т.Р., 2004]. По современным представлениям, патогенез ДПН обусловлен как метаболическими нарушениями (активация полиолового пути метаболизма глюкозы), так и сосудистыми нарушениями с формированием эндоневралыюй гипоксии (оксидативный стресс, снижение продукции оксида азота - NO - основного регулятора релаксации сосудистой стенки) [Brownlee М. et al., 2001]. Активация полиолового пути осуществляется посредством фермента альдозоредуктазы, переводящего глюкозу в сорбитол. Изучение полиморфизма гена альдозоредуктазы проводилось только в единственной работе английских авторов на небольшом материале и показало слабую ассоциацию изученного полиморфизма с риском развития ДПН [Heesom А.Е. et al., 1998]. Для решения вопроса о роли метаболических факторов в развитии ДПН необходимо проведение более масштабного исследования полиморфизма гена альдозоредуктазы. Это же относится и к различным N0-синтазам, ответственным за образование оксида азота в цитоплазме клеток, митохондриях и кровеносном русле. Во всяком случае, известно, что синтез оксида азота снижен у больных с ДПН [Казиханова С.А., 2003]. Известны различные варианты полиморфизма генов NO-синтаз, связанные с активностью синтеза оксида азота и различными осложнениями СД, в частности, диабетической ретинопатии. Полученные данные позволят расширить представления о генетических факторах, ответственных за формирование ДПН.
Методы лечения ДПН определяются представлениями о патогенезе ее развития. Считается, что действие на конкретные механизмы развития ДПН может оказать тиамин, за счет действия на транскетолазу, и антиоксиданты, за счет уменьшения выраженности окислительного стресса [Brownlee M.et al., 2001; Ziegler D. et al., 1995; 1999]. Другие препараты, воздействующие на отдельные звенья патогенеза ДПН, столь широкого применения как тиамин и антиоксиданты пока не имеют - блокаторы протеинкиназы С, блокаторы альдозоредуктазы, гамма-линоленовая кислота, блокаторы образования конечных продуктов избыточного гликирования. Во всем мире наиболее применяемым для лечения ДПН препаратом является альфа-липоевая (тиоктовая) кислота [D.Ziegler, 2003]. Большинство исследований эффективности этого препарата при лечении ДПН проведено в Германии [D.Ziegler et al., 1999]. Всего было проведено шесть рандомизированных плацебо-контролируемых двойных слепых исследований, ответивших на многие вопросы стратегии и тактики лечения ДПН альфа-липоевой кислотой. Наименее ясными остаются два вопросы: 1) эффективность таблетированной формы тиоктовой кислоты и 2) длительность эффекта стандартного курса внутривенного введения препарата. Ответ на первый вопрос крайне важен для медицинской практики, так как далеко не всегда возможно применение внутривенного введения альфа-липоевой кислоты из-за необходимости стационарного лечения, наличия определенных противопоказаний (сердечная аритмия, свежие геморрагии на глазном дне, возраст старше 75 лет и т.д.). Ответ на второй вопрос должен помочь определиться со временем повторного курса лечения, если первый оказал эффект непосредственно во время лечения или сразу после него.
Цель исследования. Изучить патогенетические механизмы реализации генетической предрасположенности к диабетической полиневропатии у больных сахарным диабетом типа І в Московской популяции. Изучить эффективность и длительность эффекта при лечении диабетической полиневропатии альфа-липоевой кислотой.
Задачи исследования.
1. Изучить ассоциацию полиморфного маркера гена альдозоредуктазы с риском развития диабетической полиневропатии у больных СД типа I Московской популяции.
2. Изучить ассоциацию полиморфных маркеров генов нейрональной, индуцируемой и эндотелиальной NO-синтаз у больных СД типа I Московской популяции.
3. Изучить эффективность таблетированной формы альфа-липоевой кислоты при лечении диабетической полиневропатии.
4. Изучить длительность эффективности внутривенного введения альфа-липоевой кислоты у больных диабетической полиневропатией.
Научная новизна.
1. Впервые в мировой практике изучена ассоциация полиморфного микросателлита (АС)п гена альдозредуктазы (ALR2); ассоциация полиморфного микросателлита (СА)п гена N0- синтазы нейронов; ассоциация полиморфного микросателлита (ССТТТ)п гена индуцируемой N0- синтазы; ассоциация полиморфных маркеров cNOS34a/4b и Glu298Asp гена N0-синтазы клеток эндотелия с развитием диабетической полиневропатии у больных СД типа I Московской популяции.
2. Впервые в отечественной практике проведен анализ эффективности таблетированных форм альфа-липоевой кислоты.
3. Впервые в отечественной и зарубежной практике проведен анализ длительности эффекта лечения ДПН внутривенным введением альфа-липоевой кислоты.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Ассоциации полиморфного микросателлита (АС)п гена альдозоредуктазы (ALR2) с развитием диабетической полиневропатии у больных СД типа I Московской популяции не выявлено.
2. Выявлена ассоциация полиморфного микросателлита (ССТТТ)п гена индуцируемой NO-синтазы (NOS2) с развитием диабетической полиневропатии у больных СД типа I Московской популяции.
3. Эффективность приема таблетированной формы альфа-липоевой кислоты в дозе 1800 мг в течение 3 недель не отличается от эффективности плацебо.
4. Эффективность внутривенного введения альфа-липоевой кислоты в дозе 600 мг в течение 3 недель (14 инфузий) сохраняется в течение 6 месяцев.
Практическая значимость. Проведенное исследование показало, что генетическая предрасположенность с развитием диабетической полиневропатии связана в первую очередь с сосудистыми, а не метаболическими механизмами, что предполагает более широко использование лечения диабетической полиневропатии препаратами, улучшающими кровоснабжение периферических нервов. Проведение изучения полиморфного маркера индуцируемой синтазы оксида азота может позволить своевременно назначать профилактическое лечение больным СД, имеющим высокий риск развития диабетической полиневропатии. Результаты исследования эффективности таблетированной формы альфа-липоевой кислоты показывают, что начинать лечение необходимо с внутривенного введения препарата. Результаты исследования длительности эффекта внутривенного введения альфа-липоевой кислоты позволят своевременно спланировать назначение повторных курсов лечения.
Внедрение в практику. Материалы диссертации включены в программу лекций на сертификационных курсах и курсах усовершенствования врачей на кафедре эндокринологии и диабетологии РМАПО. Лечение альфа-липоевой кислотой диабетической полиневропатии в соответствии с положениями диссертации проводятся на кафедре эндокринологии и диабетологии РМАПО, в эндокринологических отделениях ЦКБ № 1 ОАО «Российские железные дороги» и на кафедре нервных болезней ММА им. И.М.Сеченова.
Патогенез диабетической полиневропатии
Диабетическая полиневропатии - это генерализованное, симметричное, преимущественно дистальное поражение периферической нервной системы, включающее сенсорные, моторные и автономные нарушения [Прихожан В.М., 1981]. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о том, что распространенность ДПН незначительна в момент диагностики СД и прогрессивно нарастает по мере увеличения длительности и тяжести диабета [Young M.J. et al., 1993]. Распространенность ДПН составляет 1-2 % при впервые диагностированном СД типа I и 50-70% - при длительности СД типа I свыше 15 лет [Аметов А.С., Строков И.А., 2001]. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что одним из основных этиологических факторов развития ДПН является, безусловно, гипергликемия. Считается, что гипергликемия приводит к активации двух путей ее метаболизма: полиолового и гексозоаминового [Brownlee М. et al., 2001]. Одни исследователи считают, что основная роль в развитии ДПН принадлежит метаболическим расстройствам, включающим активацию полиолового или сорбитолового пути обмена глюкозы, изменение метаболизма липидов, повышенное образование конечных продуктов гликозирования и усиление окислительного стресса [Ceriello A.et al., 1996; Van Dam P.S. et al., 1995]. Другие исследователи главную роль отводят сосудистым факторам, которые могут способствовать ишемии нерва. К ним относятся структурные изменения в эндоневральной микроциркуляторной сети наряду с реологическими нарушениями и повышением активности вазоактивных агентов (таких как эндотелины, тканевого активатора плазминогена, оксида азота), играющих ключевую роль в контроле состоянии тонуса сосудистой стенки и кровоснабжения нервов [Cohen R.A., 1997]. Однако большинство исследователей считает, что развитие ДПН обусловлено совместным действием метаболических и сосудистых нарушений [Cameron N.E., Cotter М.А., 1997; Cameron N.E. et al., 2001, Балаболкин М.И. и др., 2001]. Была предложена следующая схема (рис.1) связи метаболических изменений при СД с эндотелиальной дисфункцией, снижением перфузии нервной ткани и ухудшением функции периферических нервов. Это позволяет сделать вывод о том, что патогенез ДПН является многофакторным. Можно утверждать, что для развития данной патологии необходимым условием являются метаболические и сосудистые нарушения, но основой для их проявления должна служить генетическая предрасположенность [Vinik A. et al., 2000, Аметов А.С., Строков И.А., 2001].
Выделяют следующие метаболические нарушения, связанные с состоянием гипергликемии и участвующие в патогенезе развития ДПН: активация полиолового пути обмена глюкозы, накопление промежуточных продуктов метаболизма глюкозы из-за блокирующего действия супероксида и связанное с этим образование конечных продуктов избыточного гликирования белков, активацию протеинкиназы С [Brownlee М, 2001].
Термин «полиоловый» относится к продуктам, образующимся при ферментативном окислении глюкозы. Превращение глюкозы в сорбитол -ациклический спирт, осуществляется под действием фермента альдозоредуктазы в присутствии NADPH. Затем сорбитол окисляется до фруктозы под действием сорбитолдегидрогеназы с участием NAD+. Основным ферментом, определяющим активность полиолового пути, является альдозоредуктаза. Она обнаруживается в тканях человека, особенно в органах, которые наиболее часто поражаются при СД, в том числе периферическом нерве. Альдозоредуктаза обеспечивает относительно небольшое в процентном отношении превращение глюкозы, находящейся в цитоплазме - около 10%, т.к. обладает низким сродством к глюкозе по сравнению с гексокиназой [Brownlee М, 2001]. Образование сорбитола ускоряется только при наличии гипергликемии. Сорбинилдегидрогеназа обладает низкой активностью и высоким сродством к сорбитолу, поэтому этот спирт обнаруживается в высоких концентрациях в клетках тех тканей, где захват глюкозы не зависит от инсулина. Было предложено несколько механизмов влияния полиолового пути на функцию нервов [Cameron N. et al., 1997]. Усиление сорбитолового пути обмена глюкозы приводит к истощению клеточных запасов NADPH и NAD+, что может влиять на синтез важного вазодилятатора и нейромедиатора - оксида азота, с участием NO-синтазы, использующей NADPH как кофактор. Снижение количества NADPH приводит к усугублению окислительного стресса за счет нарушения восстановления глутатиона, одного из основных ферментов антиоксидантной системы.
Общая характеристика групп больных для изучения длительности эффекта внутривенного введения альфа-липоевой кислоты
Длительность клинического эффекта внутривенного введения альфа-липоевой кислоты оценивалась у 103 больных СД типа 1 и 2 с дистальной симметричной сенсорно-моторной полиневропатией, принимавших участие в моноцентровом двойном слепом рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании «SYDNEY STUDY», проводившемся на кафедре эндокринологии и диабетологии РМАПО. Все пациенты были разбиты на две группы в соответствии с видом терапии, которую они получали в процессе исследования «SYDNEY STUDY». В первую группу вошли 49 больных, получавших внутривенно альфа-липоевую кислоту (препарат «Тиоктацид»). Во вторую группу вошли 54 больных, получавших вігутривенно плацебо. Все больные на протяжении исследования получали постоянную сахароснижающую терапию без ее изменений. Клиническая характеристика больных обеих групп представлена в таблице 3. Отличия между группами ни по одному показателю не было достоверным. СД типа I был у 30 пациентов, СД типа II у 73 пациентов. Меньшее число больных по сравнению с исследованием «Сидней» - 120 больных, объясняется тем, что часть больных, принимавших участие в этом исследовании, были иногородними. После окончания исследования, которое было стационарным, связь с ними была утеряна. В этой связи вызвать их на повторное динамическое исследование не представлялось возможным. Основным критерием оценки длительности клинического эффекта альфа-липоевой кислоты, как и в исследовании «Сидней», служила шкала TSS, оценивающая частоту и интенсивность основных позитивных невропатических симптомов: боль, жжение, онемение, парестезии. Дополнительными показателями служили шкала NISLL, оценивающая негативную невропатическую симптоматику: силу мышц, рефлексы и чувствительность всех модальностей, т.е. неврологический дефицит, а таюке показатели ЭМГ тестирования функции периферических соматических нервов.
При диагностике ДПН, которая проводилась всем больным, принимавших участие в исследованиях, использовались клинические методы, к которым относили: 1) определение выраженности позитивной невропатической симптоматики, т.е. жалоб больных на типичные неприятные ощущения - боль, жжение, парестезии и онемение; 2) определение выраженности негативной невропатической симптоматики, т.е. неврологического дефицита - оценка порога чувствительности в дистальных отделах ног для всех сенсорных модальностей, тестирование силы мышц ног и определение коленного и ахиллова рефлексов.
По шкале TSS оценивают четыре наиболее часто встречающихся при ДПН позитивных невропатических симптома - стреляющую боль, жжение (жгучую боль), парестезии (ощущение ползания мурашек, покалывания иголками) и онемение [М.В.Новосадова, 2002]. Оценивали частоту и интенсивность этих симптомов в течение последних 24 часов. Сумму баллов по шкале TSS получали путем суммирования баллов оценки каждого из анализируемых симптомов. Таким образом, минимальная сумма баллов - 0 баллов, а максимальная - 14,64 балла. Учитывалось наличие симптомов только в пальцах, стопах и голенях.
Негативная неврологическая симптоматика (неврологический дефицит) оценивали по шкале NISLL (Neuropathy Impairment Score Low Limb - Счет невропатических нарушений для нижних конечностей) [Dyck P.J., Thomas Р.К., 1999] (таблица 5).
Анализ ассоциации полиморфного микросателлита (СА)п гена NO-синтазы нейронов с развитием диабетической полиневропатии
Ген NO-синтетазы нейронов (NOS1) расположен в хромосомной области 12q24.2-q24 [Marsden Р.А. et al., 1993] и состоит из 29 экзонов [Hall A.V. et al., 1994]. Полиморфный микросателлит (СА)п гена NO-синтетазы нейронов расположен в 29 экзоне и содержит динуклеотидные повторы (СА)п. Обнаружено достоверное различие частоты встречаемости аллелей этого полиморфного маркера в популяциях североамериканских европейцев и афроамериканцев [Grasermann Н. et al., 1999].
На нашем материале были идентифицированы 9 фрагментов ДНК длиной от 173 до 189 п.н. Фрагмент длиной 173 п.н. соответствует аллелю 17, длиной 175 п.н. - аллелю 18, длиной 177 п.н. - аллелю 19, длиной 179 п.н. аллелю 20, длиной 181 п.н. - аллелю 21, длиной 183 п.н. - аллелю 22, длиной 185 п.н. - аллелю 23, длиной 187 п.н. - аллелю 24, длиной 189 п.н. - аллелю 25.
Из 45 возможных генотипов обнаружено 19 (42%). В обеих группах, как «ДПН+», так и «ДПН-», наблюдалось значительное преобладание аллелей 20 и 21, а также генотипа 20/21 (таблица 7). При этом различия в распределении аллелей и генотипов в обеих группах были незначительными и носили недостоверный характер.
Полученные данные свидетельствуют о том, что ассоциация между данным полиморфным микросателлитом гена NO-синтетазы нейронов и риском развития диабетической полиневропатии в Московской популяции больных СД типа I отсутствует.
Ген индуцируемой NO-синтетазы (NOS2) расположен на хромосоме 17 в области qll-ql2 и состоит из 27 экзонов [Marsden Р.А. et al., 1994]. В промоторном участке гена NOS2 обнаружены высокополиморфные пентануклеотидные повторы (CCTTT)n [Xu W. et al., 1997]. Кроме того, было обнаружено большое количество однонуклеотидных полиморфных маркеров.
На нашем материале проведено исследование полиморфного микросателлита с пентануклеотидным повтором (ССТТТ)п. Удалось идентифицировать 12 аллелей длиной от 181 до 236 п.н., кодированных как А-9 - А-20, содержащих от 9 до 20 пентануклеотидных повторов.
У обследованных больных был обнаружен 31 генотип из 78 возможных (40%). В группе с наличием диабетической полиневропатии самым распространенным вариантом генотипа были гетерозиготы 13/16. В группе без диабетической полиневропатии самым часто встречающимся был гетерозиготный генотип 13/15.
В группе «ДПН-» гомозиготы 14/14 встречались в 1,39 раз чаще, но данное увеличение частоты встречаемости не было достоверным. При этом происходил достоверный (р=0,03) рост содержания аллеля 14 в группе больных без ДПН (0,237 против 0,162). Распределение остальных аллелей и генотипов в обеих группах были незначительными и носили недостоверный характер (таблица 8).
Ген NO-синтазы клеток эндотелия (NOS3) расположен на хромосоме 7 в области q36 и состоит из 26 экзонов [Marsden Р.А. et al., 1993; Robinson L.J. et al., 1994]. В экзонах и энтронах обнаружен ряд полиморфных участков, из которых лишь один в 7 экзоне ведет к аминокислотной замене. В большинстве исследований использованы два полиморфных маркера гена NOS3: 1) минисателлит в нитроне 4 (ecNOS3 4a/4b), состоящий из 4 (аллель 4) или 5 (аллель 5) повторяющихся единиц длиной 27 п.н.; 2) однонуклеотидныи полиморфизм (G—»Т) в положении 894 в экзоне 7, ведущий к замене остатка глутаминовой кислоты на остаток аспарагиновой кислоты в положении 298 (Glu298Asp) [Shimasaki Y. et al., 1998].
На нашем материале проведено исследование ассоциации двух полиморфных маркеров гена NOS3: минисателлита ecNOS 4a/4b, расположенного в 4 интроне и полиморфного маркера GIu298Asp, содержащего однонуклеотидныи полиморфизм в виде остатков глицина или тимина в положении 894, приводящие к аминокислотному полиморфизму (глутаминовая или аспарагиновая кислоты) в кодоне 298 аминикислотной цепи (рисунок 3).
Аллели полиморфного минисателлита ecNOS 4a/4b состоят из 4 (аллель 4а) или 5 (аллель 4Ь) повторяющихся единиц длиной 27 п.н. и идентифицируются по длине продукта амплификации - 393 и 420 п.н. соответственно.
В группах «ДПН+» и «ДПН-» частота встречаемости аллеля 4Ь значительно преобладала над частотой встречаемости аллеля 4а (в 3,33 раза в группе «ДПН+» и 3,55 раза в группе «ДПН-». Встречаемость гомозигот 4b/4b значительно превышала встречаемость гомозигот 4а/4а (таблица 9).
Различия в распределении аллелей и генотипов в обеих группах были незначительными и носили недостоверный характер. Таким образом, полученные результаты позволяют считать, что полиморфный маркер ecNOS 4a/4b гена NOS3 не ассоциирован с развитием диабетической полиневропатии у больных СД типа І в Московской популяции.
Полиморфизм по кодону 298 (глутаминовая/аспарагиновая кислоты) гена NOS3 обусловлен однонуклеотидным полиморфизмом (G/T) в положении 894. Аллели полиморфного маркера Glu298Asp выявляли после расщепления амплифицированного фрагмента длиной 248 п.н., содержащего полиморфный участок, рестриктазой Mbol. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Glu остается нерасщепленным, в то время как фрагмент ДПН, содержащий аллель Asp расщепляется на фрагменты размером 90 и 158 п.н.
На нашем материале при исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Glu298Asp гена NOS3 у больных с наличием и отсутствием диабетической полиневропатии обнаружено преобладание частоты встречаемости аллеля Glu над частотой встречаемости аллеля Asp и частоты встречаемости генотипа Glu/Glu над частотой встречаемости генотипа Asp/Asp в обеих исследованных группах (таблица 10).
Длительность действия курса внутривенного введения альфа-липоевой кислоты у больных диабетической полиневропатией
Предположение о генетической предрасположенности к формированию ДПН основывалось на том факте, что, несмотря на отчетливую зависимость времени развития ДПН от периода наличия СД, у ряда больных ДПН выявлялось уже при первичной диагностике СД, а у других больных через 20 лет течения СД не выявлялась даже субклиническая форма ДПН [Аметов А.С., Строков И.А., 2001; Dyck P.J. et al., 1997]. Действительно, почему при среднем времени развития ДПН от 9 до 11 лет по разным данным [Strokov LA. et al., 2003; Dyck P.J. et al., 1997], имеются такие исключения. Самой простой была мысль, что имеются факторы являющиеся «предрасполагающими» или «защитными» для развития ДПН. Наиболее вероятной гипотезой в такой ситуации было предположение о наличии генетической зависимости времени формирования ДПН.
Предпринималась попытка найти генетическую предрасположенность к ДПН, обследовав семьи больных СД с ДПН. При исследовании семейных случаев СД типа I была выявлена так называемая кластерная предрасположенность к развитию отдельных поздних осложнений СД (нефропатии и ретинопатии): выявление у одного из сибсов какого либо позднего осложнения СД повышало риск развития этого осложнения у другого сибса во много раз [Quinn М. et al., 1996]. Вместе с тем, при обследовании членов «ядерной семьи» больных СД типа І, у родственников не больных СД обнаружить признаков поражения периферических нервов не удалось. Это привело к тому, что на долгие годы данное предположение не рассматривалось и считалось, что все определяется только длительностью и степенью компенсации СД. Вместе с тем, факт появления ДПН вне связи со временем течения СД и во многих случаях с контролем СД требовал объяснения. Кроме того, отсутствие поражения периферических нервов у близких родственников больных СД мог свидетельствовать скорее о том, что именно гипергликемия приводила к выявлению генетического дефекта. Другим объяснением могла быть связь времени развития ДПН с какими-то факторами, определяющими возникновение так называемых поздних осложнений СД. В пользу наличия генетического фактора в механизмах развитии ДПН была и несомненная этническая зависимость распространенности ДПН. Действительно трудно объяснить феномен значительных различий в распространенности ДПН в различных этнических популяциях. У жителей России и США в общей популяции больных СД типа I, который сам по себе относится по данным Рочестерского исследования к факторам риска развития ДПН, распространность ДПН была чуть больше 50% [Галеев И.В., 2003; Бурса Т.Р., 2004; Dyck P.J. et al., 1997]. В то время как у индусов она не превышала 15% [Shaw J.E. et al., 1998], и не было оснований считать, что СД у индийского населения контролируют лучше, чем в США и России. Известно, что имеется отчетливая разница в распространенности ДПН у жителей Европы и Северной Африки, а также популяциями больных СД, проживающих в США и относящихся к англоговорящим или испаноговорящим жителям [Harris М. et al., 1993; Vague P. et al., 1996]. Анализ распространенности поздних осложнений в группах больных с различной длительностью СД позволил сформировать представление о роли генетических и метаболических факторов в развитии ДПН. Так у 5% больных отмечается высокая степень предрасположенности к развитию поздних осложнений независимо от степени компенсации СД. У 20-25% больных поздние осложнения наблюдаются крайне редко вследствие низкой генетической предрасположенности. У большей части больных (70-75%) степень генетической предрасположенности неопределенно варьирует и именно у них поддержание хорошей компенсации СД оказывает выраженное защитное влияние на развитие и прогрессирование диабетической микроангиопатии [Raskin P., Rosenstock J., 1986].
Прогресс в изучении наследственной предрасположенности к формированию ДПН связан с появлением методов молекулярно-генетического анализа, в частности ПЦР, так называемых генов-кандидатов, и расширением представлений о механизмах развития ДПН, что позволяет очертить круг этих генов-кандидатов [Я.Ю.Кондратьев, 1998; Brownly М., 2001; Hammes Н.-Р. et al., 2003]. Основной концепцией молекулярной генетики заболеваний является представление об ассоциации определенных аллелей полиморфных генетических маркеров с предрасположенностью или устойчивостью к развитию изучаемой патологии.
