Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Морфологические, иммуногистохимические и молекулярно-биологические подходы к диагностике и оценке потенциала злокачественности различных вариантов папиллярного рака щитовидной железы (обзор литературы) 10
1.1. Краткая морфологическая характеристика различных вариантов папиллярного рака щитовидной железы 11
1.2. Иммуногистохимические маркеры, связанные с агрессивностью биологического поведения опухоли 20
1.3. Молекулярно-генетические особенности различных гистологических вариантов папиллярного рака щитовидной железы
ГЛАВА II. Общая характеристика материала и методов исследования 36
ГЛАВА III. Анализ значимости иммуногистохимических маркеров в дифференциальной диагностике и оценке потенциала злокачественности различных вариантов папиллярного рака щитовидной железы (результаты собственных исследований) 41
3.1. Анализ морфологических особенностей различных вариантов папиллярного рака щитовидной железы 41
3.2. Диагностическое значение экспрессии тиреоглобулина, MUC1, В-катенина и циклина D1 клетками различных вариантов папиллярного рака щитовидной железы 57
3.3. Особенности экспрессии MUC1, В-катенина и циклина D1 в опухолях различного размера, инвазивных свойств и метастатического потенциала 74
3.4. Связь статуса онкогена BRAF с гистологическим строением опухоли, гиперэкспрессией MUC1, аберрантной экспрессией В-катенина и гиперэкспрессией циклина D1 84
ГЛАВА IV. Обсуждение полученных результатов 90
Заключение 102
Выводы 104
Практические рекомендации список литературы
- Иммуногистохимические маркеры, связанные с агрессивностью биологического поведения опухоли
- Молекулярно-генетические особенности различных гистологических вариантов папиллярного рака щитовидной железы
- Диагностическое значение экспрессии тиреоглобулина, MUC1, В-катенина и циклина D1 клетками различных вариантов папиллярного рака щитовидной железы
- Связь статуса онкогена BRAF с гистологическим строением опухоли, гиперэкспрессией MUC1, аберрантной экспрессией В-катенина и гиперэкспрессией циклина D1
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В настоящее время существует множество морфологических вариантов папиллярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ), отличающихся особенностями гистологического строения, различной степенью злокачественности и клиническими проявлениями. В последнем издании Международной гистологической классификации опухолей щитовидной железы экспертами Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) выделено 15 вариантов папиллярного рака [89]. Вероятно, что этими вариантами не исчерпывается список возможных морфологических типов строения ПРЩЖ. С другой стороны, остается открытым вопрос о причинах выраженного многообразия клинических проявлений даже при одинаковом гистологическом строении опухолей. И если морфологическому описанию различных гистотипов ПРЩЖ и их корреляции с клиническим течением посвящено достаточно большое число исследований, то изучению молекулярно-генетических и иммуногистохимических маркеров, которые служили бы задачам дифференциальной диагностики ПРЩЖ и объяснению причин столь широкого диапазона возможностей биологического поведения рака от латентно текущих микрокарцином до агрессивных опухолей с регионарными и отдаленными метастазами, уделено пока недостаточно внимания. В последние годы наряду с общепринятыми маркерами, связанными со способностью клеток ПРЩЖ синтезировать и накапливать белковые продукты (тиреоглобулин) [29], для дифференциальной диагностики все чаще используют иммуногистохимические реакции с антителами к тиреопероксидазе [4, 58], факторам адгезии клеток (лектины, кадгерины) [4], высокомолекулярным цитокератинам [13], антигенам, связанным с пролиферацией клеток и регуляцией клеточного цикла (Ki-67, PCNA, bcl-2) [4, 20, 24], ростовым факторам (IGF, h-MET, VEGF), онкогенам и антионкогенам {BRAF, RET/РТС, р53) [1, 4, 14] и другим. Значительно меньше внимания уделено теоретической и практической (диагностической) значимости муцинов (MUC1), р-катенина и циклина D1, которые могут осуществлять передачу клеточного сигнала, например, в Wnt сигнальном пути [129, 150]. Несмотря на то, что имеются свидетельства причастности MUC1 к функционированию в опухолевых клетках ПРЩЖ МАР-киназного сигнального пути [48], пока еще отсутствуют публикации, раскрывающие возможную связь онкогенов, играющих центральную роль в МАР-киназном каскаде (BRAF), с экспрессией MUC1. Опубликованные данные о биологической роли указанных маркеров зачастую имеют противоречивый характер [41, 73, 56]. Анализ связи экспрессии Р-катенина и циклина D1 в ПРЩЖ проведен в единичных работах авторских коллективов [84, 94], а комплексные исследования связи MUC1 с особенностями экспрессии р катенина и циклина D1 опухолевыми клетками отсутствуют.
ЦЕЛЬ - изучить экспрессию белков MUC1, Р-катенина и циклина D1, в том числе в их взаимодействии и связи с мутациями онкогена BRAF, для уточнения роли в дифференциальной диагностике и оценке злокачественного потенциала различных гистологических вариантов папиллярного рака щитовидной железы.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие ЗАДАЧИ исследования:
1. Представить морфологическую характеристику различных гистологических типов папиллярного рака щитовидной железы в зависимости от размера первичной опухоли (макро- и микрокарциномы), инвазивных свойств, степени выраженности воспалительной инфильтрации и склероза стромы, а также метастатического потенциала.
2. Показать особенности иммуноэкспрессии клетками различных гистологических вариантов папиллярного рака щитовидной железы тиреоглобулина, MUC1, Р-катенина, циклина D1 и установить их дифференциально-диагностическую роль.
3. Изучить возможную связь экспрессии MUC1, Р-катенина, циклина D1 с потенциалом злокачественности опухоли.
4. Изучить взаимосвязь экспрессии MUC1, Р-катенина, циклина D1 друг с другом и статусом онкогена BRAF в клетках папиллярного рака щитовидной железы различного гистологического строения.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. Обнаружена взаимосвязь экспрессии MUC1 с аберрантной экспрессии В-катенина и сверхэкспрессией циклина D1 в папиллярном раке обычного строения и микрокарциномах с обычным типом роста, что может служить морфологическим отражением функционирования Wnt пути передачи клеточного сигнала в большинстве опухолей указанного строения. Отсутствие аналогичной взаимосвязи с точковыми мутациями BRAFT1799A, вероятно, свидетельствует об альтернативности молекулярных нарушений в разных каскадах передачи сигнала.
Установлено, что мутационный статус онкогена BRAF < связан с гистологическим типом ПРЩЖ: Точковые мутации BRAFT1/99A редко встречаются в раке солидно-фолликулярного строения, но свойственны раку из высоких и столбчатых клеток, обычному, онкоцитарному и Уортиноподобному вариантам.
Показаны морфологические (многофокусный рост, участки криброзного и морулярного строения) и иммуногистохимические особенности криброзно-морулярного рака (отсутствие или слабая очаговая экспрессия тиреоглобулина, аберрантная цитоплазматическая и ядерная экспрессия В-катенина), позволившие обосновать целесообразность выделения его в отдельную классификационную категорию.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. На основании полученных результатов значительно расширены существующие диагностические и дифференциально-диагностические критерии различных гистологических вариантов ПРЩЖ. Интенсивная диффузная реакция опухолевых клеток с антителами к тиреоглобулину характерна для фолликулярного, онкоцитарного и Уортино-подобного вариантов, отсутствие или слабая очаговая реакция - для солидного компонента солиднофолликулярного варианта, рака из высоких и столбчатых клеток и криброзно-морулярного рака. Кроме того, диагностическую ценность имеют MUC1, р-катенин и циклин D1: позитивная экспрессия этих маркеров характерна для обычного, онкоцитарного, Уортино-подобного вариантов ПРЩЖ и рака из высоких и столбчатых клеток, негативная - для фолликулярного варианта ПРЩЖ. Дополнительным критерием дифференциальной диагностики криброзно-морулярного рака может служить аберрантная ядерная экспрессия В-катенина, которая отличает его от других гистологических типов рака с низкими уровнями экспрессии тиреоглобулина (например, солидно-фолликулярного варианта).
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. ПРЩЖ представлен гетерогенной группой новообразований, отличающихся по размеру, гистологическому строению, клеточному составу и имеющих иммуногистохимические и молекулярногенетические особенности.
2. Иммуногистохимические (экспрессия MUC-1, Р-катенина и циклина D1) и молекулярно-генетические маркеры (статус онкогена BRAF) дополняют дифференциально-диагностические признаки морфологических вариантов папиллярного рака. Цитоплазматическая экспрессия MUC1 и точковые мутации BRAF ' характерны для обычного, онкоцитарного, Уортино-подобного вариантов и рака из высоких и столбчатых клеток. Аберрантная цитоплазматическая и ядерная экспрессия р-катенина обнаружена в криброзно-морулярном
3. Не обнаружено связи повышенной экспрессии MUC-1, циклина D1, <гр i "7QQ 1 аберрантной экспрессии Р-катенина и точковых мутаций BRAF / с потенциалом злокачественности (инвазивный рост и регионарное
метастазирование) в наиболее распространенных вариантах папиллярного рака щитовидной железы.
СВЯЗЬ ДИССЕРТАЦИИ С ПЛАНОМ НАУЧНЫХ РАБОТ ГУ МРНЦ РАМН. Диссертационная работа выполнена в рамках плановой НИР ГУ МРНЦ РАМН на тему «Диагностика, лечение и реабилитация больных новообразованиями щитовидной железы, пострадавших в результате Чернобыльской аварии в детском и подростковом возрасте» (№ государственной регистрации 0120.0501317).
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ДОЛОЖЕНЫ на II Научной конференции «Клиническая морфология новообразований эндокринных желез» (Москва, 2007 г.), на конференции «Балтийский форум современной эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2008 г.), на научнопрактической конференции клинического радиологического сектора ГУ МРНЦ РАМН (декабрь, 2008 г.) и на межлабораторной конференции в ГУ НИИ морфологии человека (январь, 2009 г).
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ. ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Результаты научной работы внедрены в практическую работу лаборатории патологической анатомии (заведующий - Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор
Е.Ф.Лушников) и отделения радиохирургического лечения закрытыми радионуклидами (заведующий - доктор медицинских наук В.С.Медведев) ГУ МРНЦ РАМН. ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА В ПОЛУЧЕНИИ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Автором диссертации обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования. Диссертант лично систематизировала и провела микроскопический анализ архивного гистологического материала, накопленного в лаборатории патологической анатомии ГУ МРНЦ РАМН за период с 1986 по 2006 гг. Автором самостоятельно выполнены иммуногистохимические исследования с антителами к тиреоглобулину и циклину D1, проведен статистический анализ полученных результатов. Иммуногистохимические исследования с антителами к MUC1 и Р-катенину, а также молекулярно-генетические исследования статуса BRAF выполнены совместно с сотрудниками Медицинской школы Университета г. Нагасаки (Япония).
Иммуногистохимические маркеры, связанные с агрессивностью биологического поведения опухоли
К биологическим свойствам опухолевых клеток, которые могут определять особенности клинического течения (размер опухоли, распространенность инвазивного роста, склонность к рецидивам и метастазированию), относятся многочисленные показатели, связанные с пролиферацией и гибелью клеток, регуляцией клеточного цикла, действием ростовых факторов и факторов ангиогенеза, адгезией опухолевых клеток, а также различными молекулярно-генетическими нарушениями, ведущими к активации протоонкогенов и нарушениям функции опухолесупрессорных генов. Ниже приведен анализ литературных данных о связи различных иммуногистохимических маркеров с биологическими свойствами ПРЩЖ и их возможной роли в определении прогноза.
Одним из главных факторов прогрессии опухоли является усиление пролиферативной активности клеток. По данным некоторых исследователей [20, 24] ПРЩЖ имеет низкий уровень экспрессии Ki-67. Этот показатель выше в клинически агрессивных случаях рака, хотя М. Papotti и соавт. [111] не получили доказательства существования статистически значимых различий. Д. С. Ланцов [17], Т. Е. Свиридова и соавт. [24] установили взаимосвязь между экспрессией Ki-67 и размером опухоли. Y. Ito и соавт. [74] полагают, что папиллярные микрокарциномы с клинически определяемыми метастазами отличаются более высокой пролиферативной активностью и имеют меньший безрецидивный промежуток по сравнению с микрокарциномами без таковых или с наличием оккультных метастазов. Однако установлен парадоксальный факт относительно высоких показателей этого маркера в фолликулярном варианте ПРЩЖ и самых низких в варианте из высоких клеток [24], что свидетельствует против возможности однозначного суждения о злокачественном потенциале ПРЩЖ только по уровню экспрессии Ki-67 [24, 136].
Известно, что прогноз опухоли определяется как ее пролиферативной активностью, так и уровнем апоптоза. В ПРЩЖ фигуры митоза редки и процент клеток, находящихся в S-фазе, более низок по сравнению с внеопухолевой тиреоидной тканью [136]. Сообщают, что инактивация гена-супрессора опухолевого роста р53 ассоциирована со снижением дифференцировки раковых опухолей вплоть до анапластических форм [1]. Высокая экспрессия его мутантной формы отмечена в клинически агрессивных случаях [111] и свидетельствует о неблагоприятном прогнозе ПРЩЖ [1, 4, 20]. Е.А. Коган и соавт. [14] установили, что опухоли с гиперэкспрессией данного маркера чаще дают рецидивы и метастазы.
Данные литературы о прогностическом значении і?&-гена-супрессора опухолевого роста, чей белок pRb предотвращает переход клетки из G1 в S фазу, также противоречивы. Y. Ito и соавт. [74] полагают, что уровень экспрессии pRb повышен в папиллярных микрокарциномах с клинически определяемыми метастазами в лимфатические узлы по сравнению с микрокарциномами без таковых или с наличием скрытых метастазов. K.Omura и соавт. [106] считают, что уровень экспрессии pRb значительно снижен в опухолях размером более 20 мм. Возможно, существует отличие в механизме экспрессии pRb между микрокарциномами и опухолями более крупного размера [74]. Однако отсутствие информации о причинах подобного расхождения делает невозможным использование этого маркера в качестве прогностического фактора.
Относительно ингибитора апоптоза bcl-2 в литературе также имеются -достаточно противоречивые сведения. М. Papotti и соавт. [111] считают, что утрата экспрессии bcl—2 имеет место в случаях с агрессивным биологическим поведением опухолей. Y. Ito и соавт. [74] полагают, что сниженная экспрессия bcl-2 отражает феномен быстро растущей опухоли и выявляется в микрокарциномах с клинически определяемыми метастазами. Однако Т. Е. Свиридова и соавт. [24] определили наибольшее значение экспрессии bcl-2 в фолликулярном варианте ПРЩЖ, что ставит под сомнение значимость этого маркера в качестве прогностического фактора.
Молекулярно-генетические особенности различных гистологических вариантов папиллярного рака щитовидной железы
В работе использован операционный материал (гистологические препараты и парафиновые блоки) ПРЩЖ, диагностированного у 264 пациентов, находившихся на лечении в отделениях лучевых и хирургических методов лечения открытыми (зав. - д.м.н. Крылов В. В.) и закрытыми (зав. -д.м.н. Медведев В. С.) радионуклидами ГУ МРНЦ РАМН за период с 1986 по 2006 гг. Из парафиновых блоков были сделаны гистологические срезы толщиной 5 мкм. Один из срезов окрашивали гематоксилином и эозином, а остальные использовали для проведения иммуногистохимических реакций. Определение гистологического варианта ПРЩЖ проводили на основании критериев Международной гистологической классификации опухолей щитовидной железы ВОЗ (2004) [89] с дополнениями, описанными в руководствах V. LiVolsi (1990) [88] и J. Rosai, М. L. Carcangiu, R. A. DeLellis (1992) [124]. Данные о половой принадлежности, возрасте пациентов и размере опухолевых очагов были получены из историй болезни вышеупомянутых пациентов ГУ МРНЦ РАМН. В гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли наличие пери- и интратуморальной лимфоидной инфильтрации и фиброза, каждый из указанных параметров рассматривали как слабый, умеренный и выраженный. Лишь последние два варианта учитывали как позитивные при проведении анализа. Клиническая стадия заболевания была определена с учетом рекомендаций L. J. DeGroot и соавт. [57].
Для иммуногистохимического исследования парафиновые срезы были депарафинированы в ксилоле и регидратированы в серии растворов этанола понижающейся концентрации и фосфатном буфере. Демаскирующую обработку антигенных участков молекул MUC1, 6-катенина и циклина D1 проводили методом кипячения в растворе цитратного буфера (рН 6,0) в микроволновой печи в течение 15 мин. Активность эндогенной пероксидазы блокировали методом погружения стекол с гистологическими срезами в 0,3% раствор перекиси водорода в дистиллированной воде. Для предотвращения неспецифической фоновой реакции вторичных антител была использована нормальная козья сыворотка, 10% раствор которой наносили на гистологические срезы и инкубировали во влажной камере при комнатной температуре в течение 20 мин. Иммуногистохимическое исследование гистологических срезов проведено по общепринятой методике с использованием первичных антител к тиреоглобулину, MUC1, р-катенину и циклину D1. Гистологические срезы инкубировали с первичными моноклональными (MUC1, Р-катенин и циклин D1) и поликлональными (тиреоглобулин) антителами в течение 18 ч при температуре +4С. Первичные моноклональные антитела к MUC1 (VU4H5): sc-7313 (Santa Craz Biotech Inc, SA, USA) использовали в разведении 1:100; к В-катенину (Transduction Labs, Lexington, KY, USA) - в разведении 1:100; к циклину Dl (Zymed Labs, South San Francisco, SA, USA) - в разведении 1:50. Первичные поликлональные антитела к тиреоглобулину (DAKO Corporation А0251) были использованы в разведении 1:10000. В каждой серии иммуногистохимических реакций были взяты позитивный (ткань щитовидной железы для тиреоглобулина, молочной железы для MUC1, рака щитовидной железы с ранее установленной аберрантной экспрессией В-катенина и ткань лимфатического узла для циклина D1) и негативный контроли (использование вместо первичных антител нормальной мышиной сыворотки). Связанные с соответствующими антигенными участками белковых молекул первичные антитела выявляли с помощью универсального комплекса вторичных козьих антител с чувствительной авидин-стрептавидин-пероксидазной (не содержащей биотин) системой визуализации (Nichirei, Tokyo, Japan). Продукты иммуногистохимической реакции были окрашены диаминобензидином.
Для изучения корреляции экспрессии MUC1/р-катенин, Р-катенин/циклин Dl, MUC1/циклин D1 (одновременного установления на одном и том же срезе сразу двух маркеров) выполнено двойное иммуногистохимическое окрашивание. Проанализированы три возможных сочетания из двух маркеров: MUC1 и В-катенин, В-катенин и циклин D1, MUC1 и циклин D1. Методика заключалась в том, что после завершения иммуногистохимической реакции с одним из первичных антител при комнатной температуре в течение часа и последующего нанесения вторичных антител, меченых пероксидазой, выявляемой диаминобензидином, срезы ткани промывали в 0,1 М растворе глицина (рН которого доводили до 2,2 добавлением раствора соляной кислоты). Промыванием обеспечивали уменьшение неспецифической реакции вторичных антител в последующей процедуре иммуногистохимической реакции со вторым из пары первичных антител, которые после нанесения меченых щелочной фосфатазой вторичных антител, были визуализированы с помощью смеси BCIP/NBT (DAKO Corporation). На срезы негативного контроля при двойном иммуногистохимическом окрашивании наносили лишь вторичные антитела без добавления первичных (при второй процедуре иммунного окрашивания).
Определение экспрессии опухолевыми клетками тиреоглобулина проводили с учетом численности клеток, демонстрирующих позитивную реакцию с соответствующими антителами, и интенсивности реакции. Численность положительно реагирующих клеток оценивали по следующим параметрам: 1) положительно реагирующие клетки отсутствуют «-»; 2) 0-25% позитивно реагирующих клеток «+»; 3) 26-50% положительно реагирующих клеток «++»; 4) 51-75%) положительно реагирующих клеток «+++»; 5) 76-100% положительно реагирующих клеток «++++». Интенсивность реакции оценивали по следующим параметрам: 1) реакция отсутствует «-»; 2) слабая реакция «+»; 3) умеренная реакция «++»; 4) выраженная реакция «+++».
Диагностическое значение экспрессии тиреоглобулина, MUC1, В-катенина и циклина D1 клетками различных вариантов папиллярного рака щитовидной железы
Экспрессия опухолевыми клетками тиреоглобулина в значительной степени варьировала по распространенности и интенсивности между различными гистологическими вариантами.
Обычный вариант ПРЩЖ характеризовался неравномерным распределением тиреоглобулин-позитивных опухолевых клеток. Максимальная интенсивность в участках сосочкового строения отмечалась со стороны апикальных частей опухолевых клеток.
Фолликулярный вариант ПРЩЖ отличался равномерным распределением тиреоглобулин-позитивных клеток и высокой интенсивностью иммуногистохимической реакции.
Солидно-фолликулярный вариант ПРЩЖ демонстрировал негативную или слабо-позитивную очаговую реакцию с антителами к тиреоглобулину.
Онкоцитарный и Уортино-подобный варианты характеризовались выраженной равномерной реакцией с антителами к тиреоглобулину, рак из высоких и столбчатых клеток - негативной или слабой очаговой реакцией, а большая часть клеток КМР демонстрировала негативную реакцию.
В нашем исследовании случай диффузного склерозирующего варианта ПРЩЖ характеризовался выраженной равномерной реакцией с антителами к тиреоглобулину, а ПРЩЖ с мукоэпидермоидным компонентом отличался слабой очаговой реакцией.
Распределение тиреоглобулин-позитивных клеток в микрокарциномах не отличалось от такового в макрокарциномах. Многочисленные Tg-позитивные опухолевые клетки (+++ и ++++) обнаружены в 90,9% случаев фолликулярного варианта; в 84,6% случаев онкоцитарного и Уортино-подобного вариантов; в 66,2% ПРЩЖ обычного строения; в 14,3% случаев рака из высоких и столбчатых клеток; в 4,3% случаев солидно-фолликулярного варианта; а также в 87,0% микрокарцином фолликулярного строения; 68,4% микрокарцином обычного строения и в 4,0% микрокарцином солидно-фолликулярного строения. Не было выявлено случаев криброзно-морулярного рака, демонстрирующих распространенную реакцию с антителами к тиреоглобулипу. Последняя отличалась более высокой частотой в обычном варианте ПРЩЖ по сравнению с солидно-фолликулярным вариантом (Р 0,0001), раком из высоких и столбчатых клеток (Р 0,0001) и криброзно-морулярным раком (Р 0,0001); в фолликулярном варианте по сравнению с солидно-фолликулярным (Р 0,0001), с раком из высоких и столбчатых клеток (Р=0,0003) и криброзно-морулярным раком (Р=0,0003); в онкоцитарном варианте ПРЩЖ по сравнению с солидно-фолликулярным (Р 0,0001), раком из высоких и столбчатых клеток (Р=0,004) и криброзно-морулярным раком (Р=0,0005); в микрокарциномах сосочкового строения по сравнению с микрокарциномами солидно-фолликулярного строения (Р 0,0001); в микрокарциномах фолликулярного строения по сравнению с микрокарциномами солидно-фолликулярного строения (Р 0,0001).
Интенсивность реакции с антителами к тиреоглобулину была выраженной (+++) в 84,6% случаев онкоцитарного и Уортино-подобного вариантов; 81,8% фолликулярного варианта; в 77,4%) ПРЩЖ обычного строения; в 8,7% солидно-фолликулярного варианта; а также в 82,6% микрокарцином фолликулярного строения; в 69,6% микрокарцином обычного строения и в 24,0%о микрокарцином солидно-фолликулярного строения. Не было выявлено случаев рака из высоких и столбчатых клеток и криброзно-морулярного рака, демонстрирующих интенсивную реакцию с антителами к тиреоглобулину. Последняя чаще отмечалась в обычном варианте ПРЩЖ по сравнению с солидно-фолликулярным (Р 0,0001), раком из высоких и столбчатых клеток (Р=0,0001) и криброзно-морулярным раком (Р=0,0001); в фолликулярном варианте по сравнению с солидно-фолликулярным (Р 0,0001), раком из высоких и столбчатых клеток (Р=0,0011), криброзно-морулярным раком (Р=0,0011); при онкоцитарном варианте ПРЩЖ по сравнению с солидно-фолликулярным (Р 0,0001), раком из высоких и столбчатых клеток (Р=0,0005) и криброзно-морулярным раком (Р=0,0005).
Результаты иммуногистохимических реакций с антителами к тиреоглобулину показаны на рисунке 4.
Сравнительная характеристика количественной экспрессии тиреоглобулина опухолевыми клетками различных гистологических вариантов ПРЩЖ представлена в таблицах 4 и 5.
Экспрессия MUC1 была выявлена в клетках ПРЩЖ и в эпителии окружающей ткани щитовидной железы. Цитоплазматическое окрашивание было неравномерным и отличалось по распространенности и интенсивности в центре и на периферии опухоли. Чаще опухолевые клетки были MUC1-позитивными, находясь на периферии, а не в центре опухолевых узлов. Интенсивность иммуногистохимической реакции также варьировала, была более выраженной в периферических отделах опухоли. В ткани щитовидной железы, окружающей опухоль, цитоплазматическую экспрессию MUC1, как правило, обнаруживали в участках хронического тиреоидита.
Экспрессия MUC1 была отмечена в 100% случаев онкоцитарного варианта и рака из высоких и столбчатых клеток; в 77,8% случаев Уортино-подобного варианта; в 60,6% ПРЩЖ обычного и 60,9% солидно-фолликулярного варианта; в 51,9% случаев микрокарцином обычного строения. Реже экспрессия MUC1 выявлена в фолликулярном варианте ПРЩЖ (27,3%), а также в микрокарциномах солидно-фолликулярного (24,0%) и фолликулярного строения (13,0%) (табл. 6). Значимо чаще экспрессия MUC1 присутствовала в группе рака из высоких и столбчатых клеток по сравнению с обычным вариантом (Р=0,05) и фолликулярным вариантом ПРЩЖ (Р=0,001).
Связь статуса онкогена BRAF с гистологическим строением опухоли, гиперэкспрессией MUC1, аберрантной экспрессией В-катенина и гиперэкспрессией циклина D1
Частота мутации BRAF / связана с гистологическим строением опухоли. Наиболее высокие показатели встречаемости мутаций указанного онкогена обнаружены в ПРЩЖ из высоких и столбчатых клеток (83%). Клетки онкоцитарного и Уортино-подобного вариантов имели мутации в половине исследованных случаев, а ПРЩЖ обычного строения - в 45% случаев. В отличие от рака из высоких и столбчатых клеток, онкоцитарного и Уортино-подобного типов, а также обычного ПРЩЖ, клетки солидно-фолликулярного варианта демонстрировали наличие мутаций лишь в 6% (1 случай из 17). Мутация BRAFT1799A значимо реже встречалась в солидно-фолликулярном варианте по сравнению с остальными гистологическими типами (табл. 14). Частота встречаемости меньше и в микрокарциномах солидно-фолликулярного строения по сравнению с мирокарциномами с обычным типом роста, но различия не достигали уровня статистической значимости (Р=0,07), вероятно, по причине недостаточного числа исследованных случаев микрокарцином солидно-фолликулярного строения.
В связи с малочисленностью наблюдений ПРЩЖ солидно-фолликулярного строения с мутацией BRAFT,799A (1 случай), рака из высоких и столбчатых клеток с «диким» типом BRAF (1 наблюдение) и отсутствием микрокарцином солидно-фолликулярного строения с мутацией BRAF не удалось провести сравнение частоты и характера экспрессии MUC1, (3-катенина и циклина D1, а также других морфологических особенностей V/700 і опухолей между группами с «диким» и мутантным типом BRAF . Сравнение было ограничено лишь группами ПРЩЖ обычного строения, объединенной группой онкоцитарных и Уортино-подобных опухолей, а также микрокарциномами с обычным типом роста. Как следует из таблицы 15, не обнаружено значимых различий в половой и возрастной характеристиках пациентов, среднем размере опухолей, наличии лимфоидной инфильтрации и фиброза стромы, инвазивных свойствах и метастатическом потенциале опухолей при сравнении групп с наличием и г п л Т-Т1799Л т т отсутствием мутации BRAb . Не установлено значимых различии в частоте экспрессии MUC1, р-катенина и циклина D1 в зависимости от ТІ 70Q і статуса онкогена BRAF . Не обнаружено различий в частоте экспрессии этих маркеров при анализе внутри отдельных гистологических вариантов ПРЩЖ (табл. 15). Однако в суммарной группе опухолей (макро- и микрокарцином различных гистологических вариантов) было установлено, что MUC1-позитивные раки чаще демонстрировали мутацию BRAF (46%) по сравнению с MUC1-негативными (25%). Различия были статистически значимыми (Р=0,02). Результаты исследования статуса онкогена BRAF в совокупной группе опухолей показаны в таблице 16.
Различия в более высокой частоте аберрантной экспрессии р-катенина и сверхэкспрессии циклина D1 в опухолях, клетки которых имели точковые мутации BRAF J по сравнению с опухолями, клетки которых имели «дикий» тип BRAF, не достигали уровня статистической значимости (табл. 16).
Таким образом, анализ статуса онкогена BRAF установил связь наличия мутаций в клетках опухоли с гистологическим строением папиллярного рака щитовидной железы. Мутации BRAF чаще встречаются в раке из высоких и столбчатых клеток, онкоцитарном и Уортино-подобном типах, а также в ПРЩЖ обычного строения и ТІ 100 і микрокарциномах с обычным типом роста. Точковые мутации BRAF не характерны для макро- и микрокарцином солидно-фолликулярного строения. Не обнаружено связи между частотой экспрессии MUC1, Р-катенина и циклина D1, морфологическими параметрами опухолевого роста и статусом онкогена BRAF внутри групп одного гистологического варианта.
