Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12
1.1. Каталитические антитела как часть иммунной системы 12
1.2. Каталитические антителакак искусственные ферменты 19
Проблема антидотной терапии отравлений фоєфорорганическими токсинами 43
Экспериментальная часть 49
Результаты и их обсуждение 49
1. Одноцепочечное антитело А. 17 взаимодействует с фосфорорганическим пестицидом параоксон 50
2. Создание эукариотической системы экспрессии полноразмерного антитела А.17 54
3. Сравнение функциональной активности одноцепочечного и полноразмерного антитела А.17 70
4. Структурный анализ антитела А.17: 75
5. Сайт-направленный мутагенез антитела А.17. Функциональный анализ антитела А.17 и его мутантов 84
6. Взаимодействие антитела А.17 с пестицидом параоксон 98
7. Детализация механизма катализа абзима А.17 102
Материалы и методы 107
Химические реактивы и сопутствующие материалы 107
реактивы и материалы 107
ферменты
ингибиторы протеаз 108
маркеры 108
антитела и конъюгаты 108
плазмиды 108
штаммы Е. соїі 109
Эукариотические клетки линии растворы 110
Бактериальные среды
- Каталитические антителакак искусственные ферменты
- Создание эукариотической системы экспрессии полноразмерного антитела А.17
- Сайт-направленный мутагенез антитела А.17. Функциональный анализ антитела А.17 и его мутантов
- антитела и конъюгаты
Введение к работе
Актуальность проблемы. Поиск эффективного антидота, способного нейтрализовать фосфорорганические токсины (ФОТ), остается актуальной проблемой молекулярной биологии и биотехнологии. Самыми многообещающими среди прочих в этой области являются разработки препаратов на основе ферментов. Ферменты, участвующие в метаболизме ацетилхолина, являются основными мишенями ФОТ в организме человека. На сегодняшний день бутерилхолинэстераза (BChE) считается перспективным средством антидотной профилактики и лечения отравлений ФОТ. Существующие в данный момент промышленные системы экспресии BChE дороги, недостаточно эффективны и требуют существенного улучшения. В настоящее время рекомбинантные антитела широко применяются как терапевтические агенты и имеют ряд преимуществ перед ферментами в качестве лекарственных средств. Потенциальный антидот на основе каталитического антитела (абзима) будет сочетать в себе свойство фермента - способность эффективно осуществлять катализ - с низкой иммуногенностью, продолжительным периодом циркуляции в кровотоке и действенными механизмами выведения из организма в составе комплекса антиген-антитело, характерными для молекул иммуноглобулинов. В связи с этим создание «каталитической» вакцины - каталитического антитела, способного нейтрализовать ФОТ, - актуально. Кроме того, изучение механизма катализа подобных искусственных ферментов представляет собой самостоятельную, весьма интересную с точки зрения фундаментальной науки проблему.
ЦбЛЬ работы. Цель настоящего исследования состояла в проведении структурно-функционального анализа каталитического антитела А. 17, полученного ранее в лаборатории биокатализа методом фагового дисплея. Вариабельные домены данного антитела были отобраны из полусинтетической библиотеки генов одноцепочечных антител по принципу «механизм-зависимого» связывания с w-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонатом (фосфонатом X), аналогом ФОТ по механизму действия на сериновые гидролазы. Кроме того, самостоятельной задачей представленной работы стало изучение каталитического механизма деградации ФОТ на примере фосфорорганического пестицида параоксон.
Научная НОВИЗНа И практическая Значимость работы. Полученные в результате работы данные позволили существенно продвинуться в понимании структурной организации активного центра искусственно полученного биокатализатора имму-ноглобулиновой природы. Впервые разрешена структура как Fab фрагмента каталитического антитела АЛ 7 и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната X. Комплекс-
ное физико-химическое исследование позволило предположить осуществление механизма индуцированного соответствия при взаимодействии А. 17 с фосфонатом X. Изучение функциональной активности абзима позволило выявить его способность ускорять гидролиз фосфорорганического пестицида параоксон. Было показано, что данное превращение осуществляется по пути ковалентного катализа. Полученные результаты могут быть использованы как основа для рационального дизайна с целью улучшения каталитической эффективности имеющейся активности А. 17 или при получении новых биокатализаторов. Полученные данные могут иметь биотехнологическое значение.
Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на 3-ей международной конференции «Ранние события при патологиях человека» (Барбизон, Франция, 2010), 35-м конгрессе FEBS (Ґетеборг, Швеция, 2010), 36-м конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011), 21-м ШВМВ и 12-м FAOBMB Международном конгрессе Биохимии и Молекулярной биологии (Шанхай, Китай, 2009). По материалам работы вышли 3 статьи в рецензируемых журналах.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах ма
шинописного текста и состоит из разделов введение, обзор литературы, эксперимен
тальная часть, включающая разделы «результаты и их обсуждение» и «материалы и ме
тоды», выводы, дополнительные материалы и список цитируемой литературы, содер
жащий 149 ссылок. В работе содержится рисунка и таблиц.
Каталитические антителакак искусственные ферменты
Поскольку, с одной стороны, ц-цепи, но не кА-цепи преимущественно образовывали ковалентный комплекс с фосфонатом, и, с другой стороны, секретируемые IgM образовывали ковалентный комплекс лучше, чем IgG, авторы предположили, что высокая нуклеофильность (то есть потенциальная способность к протеолизу) присуща В-клеточным рецепторам незрелых В-лимфоцитов и постепенно исчезает по ходу терминальной дифференцировки и переключения класса производимых иммуноглобулинов. Следует подчеркнуть, что такая интерпретация полученных авторами данных плохо согласуется с их более ранним предположением о том, что активный центр протеазы в секретируемых антителах класса IgG расположен в продукте гена зародышевой линии легкой цепи иммуноглобулина.
Другим интересным фактом, указывающим на возможный механизм образования каталитических антител (или, в свете вышеприведенного исследования, — сохранения каталитической активности у секретируемых антител), является преимущественное присутствие каталитических антител при различных аутоиммунных состояниях; конкретные примеры таких случаев будут приведены ниже. Наиболее яркой иллюстрацией этой взаимосвязи является работа Д. Тавфика и соавторов [12]. В своем исследовании ученые показали, что при иммунизация мышей линий SJL и MRL/lpr, обладающих аутоиммунными нарушениями и дефицитными по Fas, аналогом переходного состояния реакции гидролиза сложных эфиров вероятность получения гибридомного клона, секретирующего каталитические антитела, на 1-2 порядка выше, чем в случае иммунизации мышей линии Balb/c. Различие в частоте встречаемости"каталитических" клонов было особенно высоко-при "короткой" схеме иммунизации. Авторами было высказано предположение о том, что в "нормальных" условиях селекция клонов В-клеток препятствует появлению каталитических.антител.
Можно предположить, что роль генов зародышевых линий, обладающих "готовой" структурой протеазыили ДНКазы, в появлении соответствующих секретируемых каталитических антител может быть установлена только1 путем создания, нокаутных мышей и перенесения полученных нокаутов на различные аутоиммунные фенотипы. В настоящий момент трудоемкость такого исследования- представляется-несопоставимой с ожидаемыми результатами.
Необходимо также отметить, что аутоиммунные проявления не являются необходимым условием для появления каталитических антител. В работе [13] исследовали относительный уровень протеолитической активности высокоочищенного сывороточного IgG при- остром сепсисе. В качестве субстрата, реакции протеолиза использовали производные трехчленных пептидов. Было продемонстрировано, что уровень протеолитической активности IgG коррелировал с выживаемостью при сепсисе, одновременно с этим наблюдалась обратная корреляция уровня протеолитической активности IgG и некоторых маркеров активации системного внутрисо суд истого свертывания крови. Авторы предполагают, что протеолитическая активность IgG может способствовать положительному исходу заболевания путем протеолитического разрушения факторов свертываемости крови. При скрининге фаг-дисплейной библиотеки, созданной на основе генома больных системной красной волчанкой (СКВ), группой Паула были получены вариабельные фрагменты (scFv) антител, связывающих вазоактивный интестинальный пептид (VIP). Был выявлен один клон с VIP-селективным связыванием и несколько клонов, проявивших кросс-реактивность с другим пептидом [14]. В следующей работе [15] показан протеолиз VIP под воздействием! очищенных рекомбинантных Fv конструкций, что доказывает расположение активного центра УІРазньгх. антител в пределах вариабельных доменов.
Поскольку в работах группы С. Паула было установлено, что активных центр моноклонального каталитического антитела, расщепляющего вазоактивный интестинальный- пептид, состоит из аминокислотных остатков легкой цепи, были исследованы каталитические свойства отдельных цепей. Было показано, что мономер4 рекомбинантной легкой цепи сохраняет полную удельную активностью отношении вазоактивного интестинального пептида и расщепляет метилкумаринамидные производные трипептидов с существенно меньшей эффективностью [16]. Комплекс тяжелой и легкой цепей проявлял меньшую гидролитическую активность [17].
К настоящему моменту в результате работы многих исследовательских групп были обнаружены природные протеолитические антитела у пациентов на фоне паталогий различной природы. Например, антитела, участвующие в деградации протромбина при тромбоэмболии[18, 19], каталитические антитела, участвующие в развитии тромбоцитопенической анемии у ВИЧ-инфицированных [20], иммуноглобулины, обладающих протеолитической активностью по отношению к тироглобулину при аутоиммунном тироидите [21], аллоантитела к фактору VTII у больных гемофилией А[22]. В лаборатории биокатализа ИБХ РАН под руководством профессора Габибова впервые было показано возникновение каталитических иммуноглобулинов класса G, специфичных к основному белку миелина (ОБМ), в организме человека при рассеянном склерозе, а также в случае индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у модельных животных [23, 24].
Наличие каталитических ДНК-гидролизующих антител отмечается при широком спектре аутоиммунных патологий. При исследовании сывороток крови пациентов с ревматоидным артритом, склеродермией и системной красной волчанкой (СКВ), среди большого разнообразия антител к различным аутоантигенам, в том числе к ферментам метаболизма нуклеиновых кислот, к нуклеопротеидным комплексам и ДНК, обнаружены ДНК-специфические аутоантитела, обладающие ДНК-гидролизующей активностью [7]. Присутствие ДНК-гидролизующих антител было выявлено и при ряде других патологий — хроническом лимфолейкозе, В-клеточном лимфолейкозе, остром миелолейкозе и СПИД III-IV стадий [25], вирусных гепатитах, рассеянном склерозе [26] и тироидите Хашимото [27]. ДНК-гидролизующие антитела также были найдены у мышей линий SJL, MRL/lpr и [NZBxNZW]Fl, обладающих аутоиммунными нарушениями различной природы [23].
Создание эукариотической системы экспрессии полноразмерного антитела А.17
Авторы предположили, что подобный гаптен будет способствовать образованию антител, содержащих остаток лизина в антигенсвязывающем центре. Ковалентная связь первичной аминогруппы лизина с гаптеном обеспечит наивысшее сродство антитела к антигену. Для ее формирования аминогруппа лизина должна выступать в качестве нуклеофила в каталитическом центре антитела и образовывать ковалентный комплекс с кетоном на промежуточной стадии реакции альдольной конденсации. В свою очередь, структура дикетона будет индуцировать структуру активного центра антитела, способную связывать оба субстрата одновременно.
Полученные моноклональные абзимы действительно образовывали ковалентный комплекс (амид) с молекулой дикетона через остаток лизина; таким образом, катализируемая реакция протекала по енаминовому механизму. Интересно отметить, что данные абзимы обладали приблизительно таким же уровнем ускорения реакции глидролиза, что и соответствующие природные ферменты. В то же время, в отличие от ферментов, они были способны катализировать широкий диапазон химических реакций [72]. Высокая каталитическая эффективность одного из полученных реакционной иммунизацией альдолазных абзимов (38С2) позволила использовать его в качестве катализатора при органическом синтезе [73] и при активации предшественников лекарств in vitro [74-76] и in vivo [77].
Поверхностный «тликопротеин gpl20 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) является основным антигеном вируса и ключевым участником системы подавления вирусом, иммунного ответа реципиента [78] і Он представляется перспективной- мишенью для создания каталитических вакцин, поскольку попытки нейтрализовать» ВИЧ т vivo связывающими антителами, полученными- непосредственно иммунизацией животных поверхностными антигенами и их аналогами, остаются безуспешными [79 81]. Это является следствием гипервариабельности иммунодоминантных областей gpl20 и маскирования константных частей белка в результате тримеризации gpl20 и? экранирования- многочисленными N-связанными олигосахаридными группами [82, 83]. Большинство антител, присутствующих в сыворотке ВИЧ-инфицированных людей, узнают пространственные эпитопы gpl20, а среди антител, узнающих линейные эпитопы, преобладают антитела к области третьего гипервариабельного участка gpl20 [84]. В то же время, получено множество антител к константным районам- этого белка, не обладающих нейтрализующим эффектом. Описанные на настоящий момент антитела, обладающие некоторым нейтрализующим эффектом in vivo, направлены против эпитопов gpl20 включающих олигосахаридные группы белка- и потенциально могут проявлять кросс-реактивность к собственными гликопротеинами человека [85].
Расщепление gpl20 в организме пациента по специфическим сайтам, позволит преодолеть иммунологическую мимикрию вируса, нарушить упаковку поверхностного антигена, экспонировать его константные эпитопы и обеспечить возможность элиминации или эффективного сдерживания инфекции ВИЧ иммунной системой пациента. Для получения антител, расщепляющих gpl20, среди прочих подходов было предложено использовать реакционную иммунизацию пептидилфосфонатом (LAEEE-VPhos), пептидная часть которого представлена фрагментом гликопротеина. Было показано, что полученные-таким способом поликлональные антитела обладали специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакционного» гаптена и были способны ковалентно, взаимодействовать с его фосфонатной составляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз.
Селезенки- иммунизированных мышей были использованы для получения моноклональных антител путем- гибридомной технологии. Вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей полученных антител были клонированы в виде рекомбинантных одноцепочечных антител. Полученные таким образом одноцепочечные антитела ЕМ и Е6 обладали каталитической активностью по отношению, к низкомолекулярному субстрату LAEEEV-MCA. Кинетические параметры гидролиза амидной -з -1 связи характеризовались kcat (1,1 ± 0,5)х10 min , Км 53±14 мкМдля -4 -1 антитела Еб и kcat,(3,2±0,7)xl0 min , KMt48±ll мкМ для антитела Е1К [86]. Реакционная селекция на основе фагового дисплея. В основе всех методологий скрининга и селекции лежит связь между геном, кодирующим фермент, и ферментативной активностью, экспрессированного белка. Фаговый дисплей является одним из наилучших методов, известных на сегодняшний день, который позволяет обеспечить физическую связь между белком и геном, который его кодирует [87-89].
Сайт-направленный мутагенез антитела А.17. Функциональный анализ антитела А.17 и его мутантов
Использование необратимых ингибиторов сериновых гидролаз, таких как фосфонаты, являющихся аналогами ФОТ по механизму действия, позволяет проводить селекцию по способности активных биокатализаторов образовывать с ними ковалентные комплексы. Отбор; по способности к ковалентному взаимодействию имеет ряд преимуществ и позволяет применять жесткие условия селекции. Более того, условия реакции и выбор реагента могут изменяться для достижения кинетической или термодинамической селективности. Существует большое число ингибиторов сериновых гидролаз, образующих стабильные ковалентные комплексы по типу ацил-фермент (2,3 Рис. 15). Одним из хорошо изученных необратимых ингибиторов сериновых гидролаз является диизопропилфторфосфат (ДФФ). Пептидил фосфонаты и фтор фосфонатьг являются производными ДФФ и интенсивно изучаются. Образуя ковалентную связь ингибитор-фермент, фосфонаты имитируют стабильное переходное состояние реакции.
Ранее в лаборатории биокатализа методом фагового дисплея был осуществлен отбор на связывание с. фосфонатом X антител из полусинтетической библиотеки сегментов вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека Griffin. 1 (MRG, Center for proteing engineering, Великобритания). Библиотека построена на основе зародышевых линий 49 сегментов вариабельных регионов тяжелых цепей, а также 26 и21 сегмента вариабельных регионов к и А, легких цепей, соответственно: Третий гипервариабельный-участок как тяжелых, так и легких цепей был рандомизирован методом ПЦР [128] Г Гены вырожденных одноцепочечных антител (scFv) были клонированы в фагемидный вектор pHEN2. Представительность библиотеки г составляла 1,2x10 . Для" проведения химической селекции и скрининга были использованы и-нитрофенил 8метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонат (X) и его биотинилированное производное (Bt-X) (рис. 15). Данный фосфонат был разработан как ингибитор сериновых гидролаз [129] и ранее использовался для детекции протеолитической активности у природных антител при различных аутоиммунных нарушениях [96]. Наличие л-нитрофенильной группы делает его весьма реакционно-способным по отношению к сериновым гидролазам. В отличие от фторпроизводных фосфонатов, данное соединение достаточно устойчиво в водных растворах и не проявляет неспецифической активности по отношению к инертным белкам.
Для селекции активных антител, способных, ковалентно; взаимодействовать с Bt-Xy была использована стандартная схема [55]. В результате трехфаундов селекции из библиотеки были отобраны хорошо экспрессирующиеся растворимые одноцепочечные антитела, способные взаимодействоватьг, с Bt-X фосфонатом либо ковалентно - («реакционные» клоны), либо нековалентно, (связывающие клоны). Все «реакционные» КЛОНЬІІ были: охарактеризованы: по кинетике взаимодействия- с: небиотинилированным;фосфонатом X. Детекцию«протекания1 реакции?во времени проводили спектрофотометричёски при 405; нм« по» образующемуся; окрашенному продукту (/ -нитрофенолу); Параметры: взаимодействия; фермента с необратимым ингибитором оценивали с: использование кинетической схемы Китца-Уилсона, описывающей взаимодействие ковалентныхя механизм-зависимых- ингибиторов, с ферментами; Реакцию «описывают в/виде двух стадийного: процесса: 1-) образование обратимого нековалентного комплекса фермент-ингибитор и 2) более медленный процесс образования ковалентной связи между ингибитором и ферментом [130]. Схематически этот процесс можно изобразить в виде: кк . к2 Е + ІІ - [Е !Т]\— Е-Д где Е-фермент, I- ингибитор, Е 1- обратимый; /f-7 комплекс, Е-1-ковалентный;комплекс. Кинетические характеристики; реакции, взаимодействиям с фосфонатом X длявсех реакционных scFv варьировались в оченьузком диапазоне. Однако антитело А.17 оказалось практически: на порядок более реакционноспособным (константа скорости первого порядка 2,.. являющаяся основной характеристикой скорость-лимитирующего -і процесса образования ковалентной связи, для А.17 составляет 0,32 мин ). Согласно ранее опубликованным данным значения констант скорости реакции, для бутирилхолинэстеразы, химотрипсина и. трипсина; с: -1 - 1 фосфонатом X составляли 1800; 2600 и 4100 М мин , соответственно [129]. Таким образом, наиболее активное одноцепочечное антитело А.17 обладает реакционной способностью, сравнимой с таковой для природных сериновых гидролаз.
Для дальнейшего изучения было выбрано антитело А.17 как наиболее реакционноспособное. Функциональный анализ этого клона, наработанного в виде одноцепочечного антитела в прокариотической системе экспрессии, был проведен ранее [55]. Было установлено, что модификации фосфонатом X подвергается остаток Туг37 легкой цепи, расположенный в консервативном коркасном регионе FWR2.
Представлялось значимым и интересным проверить связывание и каталитические функции данного антитела по отношению к ряду ФОТ. На первом этапе настоящей работы было показано, что реакция одноцепочечного антитела А.17 с биотинилированным производным фосфоната X (Bt-X) ингибируется диизопропилфтор фосфатом (ДФФ), 4-(2-аминоэтил) бензилсульфонил фторидом (АЭБСФ) и инсектицидом параоксон (Рис. 15). Детекцию взаимодействия проводили с помощью Вестерн блот анализа, результаты приведены на рисунке 16.
антитела и конъюгаты
Для детализации каталитического механизма антитела А.17, наряду со стационарной, была изучена предстационарная кинетика его взаимодействия с фосфонатом X. Измерения проводились Н. Кузнецовым в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирской отделения РАН, Новосибирск на приборе SX.18MV (Applied Photophysics, Великобритания). Для детекции элементарных стадий взаимодействия абзима с субстратами использовали метод «остановленного потока». За реакцией следили по изменению внутренней флуоресценции триптофана в молекуле абзима при длинах волн 280 нм и Хет330 нм. Количественную обработку результатов кинетических экспериментов осуществляли с помощью пакета программ DynaFit software (BioKin, США). Образцы исходных кривых представлены в разделе Дополнительные материалы (Рис. Д6). Во всех расчетах фосфонат X рассматривался как полностью P(R) энантиомер. Из представленных экспериментальных данных видно, что при взаимодействии антитело - фосфонат X наблюдались значительные изменения внутренней флуоресценции абзима, которые могут быть оценены количественно как функция от времени (Рис. 43Б, В). Каждая экспериментальная кривая была независимо аппроксимирована к виду кривой с одной экспонентой для получения значения наблюдаемой константы скорости &набл. Зависимость наблюдаемой константы скорости &набл имела гиперболический вид и описывалась уравнением (1) соответствующим механизму индуцированного соответствия:
Описание механизма модификации - антитела А.17 фосфонатом X. А -экспериментальные и расчетные кривые1 взаимодействия А.17 и фосфоната X. Качество выбранной модели оценивалось статистически (врезки). Б -эксперимантальная кривая-изменения триптофановой флуоресценции антитела А.17, в зависимости от концентрации добавленного фосфоната X/ полученная в условиях пред-стационарной кинетики (слева). Зависимость наблюдаемой константы. взаимодействия А.17 с фосфонатом X Abbs от концентрации субстрата, и элементарные константы взаимодействия (справа).
Представленная схема включает стадии связывания субстрата и перестройку комплекса абзим/субстрат. Стадии образования ковалентного комплекса и отхода «-нитрофенола по изменению флуоресценции триптофана разрешить не удалось. Для подтверждения правомерности выбранного механизма модель взаимодействия- абзима с субстратом, представленная на схеме, была, подвергнута статистической проверке, выявившей, что представленная модель действительно содержит минимально возможное число стадий, и представленные кинетические данные не могут быть описаны более простой схемой: Таким образом, анализ предстационарной кинетики взаимодействия А.17 с фосфонатом X наряду с данными структурного анализа и изучением термодинамики процесса указывает на реализацию антителом механизма индуцированного соответствия. Тем не менее, полученные результаты не исключают возможности осуществления модификации абзима по альтернативному пути взаимодействия.
Пример каталитического антитела А.17 раскрывает альтернативный способ решения проблемы реорганизации белковой структуры для выполнения каталитической функции. В его структуре повышенная нуклеофильность остатка Y-L37 обеспечивается скрытым от растворителя положением в глубоком активном центре. Наличие длинной подвижной петли HCDR3 А.17 обеспечивает эффективные перестройки в полости активного центра в непосредственной близости от боковой цепи реакционного тирозина. Неупорядоченная структура этой петли, образуя своего рода гибкую стену кармана активного центра, облегчает миграцию лиганда в нижнюю камеру.
Уникальные свойства примитивного активного центра антитела А.17, способного к катализу, являются моделью сочетания белковой динамики и реактивности. Сама по себе иммуноглобулиновая структура абзима накладывает строгие границы подвижности его структуры. Однако принцип получения искусственного фермента может быть приложен сходным образом к любой другой белковой матрице.
Полученные результаты могут быть использованы как основа для рационального дизайна с целью улучшения каталитической эффективности имеющейся активности А.17 или при получении новых биокатализаторов. Полученные данные могут иметь биотехнологическое значение.
