Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Лакказы: распространение и роль в окружающей среде 8
1.1.1. Ферментативная активность почв 8
1.1.2. Общая характеристика лакказ как представителей оксидоредуктаз 14
1.1.3. Физиологические функции лакказ 23
1.1.4. Участие лакказы в процессах трансформации ксенобиотиков гуминовыми кислотами 28
1.2. Гуминовые кислоты и их функции в биосфере 29
1.2.1. Общая характеристика состава и структуры гуминовых кислот 32
1.2.2. Взаимодействие гуминовых кислот с ферментами 38
1.2.3. Участие гуминовых кислот в деградации ксенобиотиков 41
1.3. Атразин: применение и поведение в окружающей среде 42
1.3.1. Общая характеристика и применение атразина 42
1.3.2. Поведение атразина в окружающей среде 45
2. Материалы и методы 54
2.1. Выделение и характеристика лакказы Coriolus hirsutus 54
2.1.1. Жидкофазное культивирование Coriolus hirsutus 54
2.1.2. Выделение и очистка лакказы Coriolus hirsutus 55
2.1.3. Определение активности лакказы 56
2.2. Выделение, физико-химическая и биологическая характеристика препарата гуминовых кислот 58
2.2.1. Выделение гуминовых кислот угля 58
2.2.2. Элементный анализ 58
2.2.3. Эксклюзионная хроматография 58
2.2.4. ЯМР спектроскопия 59
2.2.5. Оценка биологической активности (биотест) 59
2.3. Отбор и характеристика почвенных образцов 60
2.3.1. Отбор почвенных образцов 60
2.3.2. Определение кислотности 61
2.3.3. Определение содержания органического углерода 61
2.3.4. Определение содержания обменных катионов 62
2.3.5. Определение гранулометрического состава 62
2.4. Определение атразина и его основных метаболитов 63
2.5. Исследование влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гомогенной среде 65
2.5.1. Взаимодействие лакказы с атразином 65
2.5.2. Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами 65
2.5.3. Влияние лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами 66
2.6. Изучение влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми
кислотами в гетерогенной среде 67
2.6.1. Изучение кинетики адсорбции атразина почвами 68
2.6.2. Влияние лакказы на взаимодействие атразина с почвами 68
2.7 Проведение лабораторно-вегетационных экспериментов 70
2.7.1. Проведение лабораторно-вегетационных экспериментов на перлите 70
2.7.2. Проведение лабораторно-вегетационных экспериментов на почве 72
3. Результаты и их обсуждение 74
3.1. Выделение и характеристика лакказы 74
3.2. Выделение, физико-химическая и биологическая характеристика препарата гуминовых кислот 78
3.2.1. Характеристика физико-химических свойств гуминовых кислот 78
3.2.2. Характеристика биологических свойств гуминовых кислот 83
3.3. Отбор и характеристика почвенных образцов 85
3.4. Исследование влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гомогенной среде 88
3.4.1. Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами 88
3.4.2. Взаимодействие лакказы Coriolus hirsutus с атразином 97
3.4.3. Влияние лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами 97
3.5. Исследование влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гетерогенной среде 100
3.6. Оценка возможности использования лакказы Coriolus hirsutus в биотехнологиях очистки почв, загрязненных атразином 109
3.6.1. Исследование влияния лакказы на детоксификацию атразина гуминовыми кислотами на перлите 109
3.6.2. Исследование влияния лакказы на детоксификацию атразина гуминовыми кислотами в почвенной среде 113
Выводы 118
Список цитируемой литературы 119
Выражение признательности 139
- Общая характеристика лакказ как представителей оксидоредуктаз
- Общая характеристика и применение атразина
- Влияние лакказы на взаимодействие атразина с почвами
- Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами
Введение к работе
В связи с возрастающим загрязнением окружающей среды в целом и земельных ресурсов в частности, остро стоит вопрос создания эффективных биотехнологий для детоксификации загрязненных почв. Одной из доминирующих групп ксенобиотиков в почвах являются гербициды, широко применяемые для контроля численности сорной растительности. Однако неправильное использование гербицидов (превышение доз внесения, нарушение схем применения и др.) часто приводит к негативным последствиям - загрязнению сельскохозяйственной продукции, почв, грунтовых и поверхностных вод.
Наиболее опасным с точки зрения функционирования биогеоценозов является загрязнение высокоустойчивыми гербицидами, одним из наиболее распространенных представителей которых является сим-триазиновый гербицид атразин (2-хлор-4-этиламино-6-изопропиламино-сим-триазин) [Ralebitso et. al., 2002]. Этот гербицид используется в качестве селективного препарата против двудольных сорняков на ряде сельскохозяйственных культур, а также в качестве гербицида сплошного действия для невозделываемых площадей (газонов и территорий промышленного использования). Время его жизни в почве составляет от нескольких недель до четырех лет и более. Одной из основных особенностей сим-триазиновых гербицидов в целом и атразина в частности является их высокая персистентность, т.е. устойчивость в окружающей среде, и мобильность, т.е. способность перемещаться из почвы в сопредельные среды. Указанные характеристики определяют высокую опасность атразина для окружающей среды: предельно-допустимая концентрация (ПДК) атразина в почве составляет 0.5 мг/кг [Письмо Министерства.., 1993], а в воде - 3 мкг/л [Ларина, 2002]. Описан ряд негативных эффектов воздействия триазиновых гербицидов, атразина в частности, на представителей растительного и животного мира. В настоящее время накоплены данные о генотоксичности атразина и его влиянии на организм человека.
Для большинства гербицидов, включая сим-триазины, первичным процессом при попадании в почву является их адсорбция почвенными коллоидами, главным образом минералорганическими. Органическое вещество в составе минералорганических комплексов играет ведущую роль в этом процессе. Согласно литературным данным, гуминовые кислоты (ГК) составляют 85-90% от общего содержания органического вещества почв и являются основным компонентом минералорганических комплексов, поэтому при попадании в почву атразин взаимодействует главным образом с ГК.
Несмотря на то, что сорбционные процессы между атразином и компонентами органического вещества хорошо изучены [Weber et al., 1996], единого мнения о механизме связывания ГК с этим гербицидом не существует. Одной из наиболее распространенных гипотез является связывание по механизму гидрофобного взаимодействия и образование комплексов с переносом заряда [Piccolo et al., 2000]. При связывании атразина происходит уменьшение его свободной концентрации в почве и, как следствие, снижение токсичности [Piccolo et al., 1998]. Однако при изменении условий может происходить десорбция гербицида, что приводит к увеличению его мобильности и, соответственно, токсичности.
В процессах взаимодействия ксенобиотиков с органическим веществом принимают участие ферменты окислительного действия. По литературным данным [Filip et al., 1985] эти ферменты способны катализировать или инициировать реакции деградации, полимеризации, синтеза, связывания и включения ксенобиотиков в гумусовые кислоты почв. Ферментативное связывание некоторых ксенобиотиков является важным природным процессом, который влияет на их поведение (т.е. активность и персистентность) в водной и почвенной средах [Zahir et al., 2001]. В экспериментах [Hatcher, 1993; Nanny, 1996], проводимых in vitro, было показано ковалентное связывание ароматических ксенобиотиков (2,4-дихлорфенолов и пентохлорфенолов) с ГК и фульвокислотами (ФК), катализируемое ферментативными комплексами. Предполагаемый авторами механизм детоксификации ксенобиотиков был назван механизмом окислительного
-6 связывания. Для атразина возможность окислительного связывания с ГК практически не изучена, а существующие литературные данные противоречивы. В ряде исследований было показано [Lesan et al., 2000], что внесение пероксидазы не увеличивало адсорбционную способность почв по отношению к атразину, а в некоторых вариантах даже приводило к снижению последней. Влияние других оксидоредуктаз, таких как лакказа, на связывание атразина почвами не изучено. Однако показано, что высшие и низшие грибы участвуют в процессах трансформации атразина, и одним из ключевых ферментов этого процесса является лакказа (n-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2).
Отличительными чертами данного фермента являются: высокая активность в почве в течение круглого года [Criquet et al., 2000], широкая субстратная специфичность и высокая термо- и рН-стабильность. Кроме того, лакказа является единственной оксидоредуктазой, экстрагируемой из почвы в составе ГК [Ruggiero, 1984]. Основными продуцентами лакказы в почвах являются грибы «белой гнили», представителем которых является Coriolus hirsutus. Именно эта группа базидиомицетов наиболее распространена в почвенном гумусово-аккумулятивном горизонте. Следовательно, базидиальные грибы и продуцируюемые ими ферменты, в частности лакказа, несомненно, являются активными участниками трансформации ксенобиотиков в почвах, хотя и механизм данного процесса не изучен.
Это обусловило актуальность и важность проведения исследований, направленных на изучение влияния лакказы на механизмы адсорбции и десорбции атразина ГК в растворенном и иммобилизованном состоянии. Данные исследования позволят не только установить возможность окислительного связывания этого гербицида с ГК при участии лакказы, но и оценить роль фермента в процессе детоксификации ксенобиотиков сим-триазиновой природы, что даст основу биотехнологическим подходам к рекультивации загрязненных территорий.
Целью работы являлось исследование влияния лакказы на процессы взаимодействия атразина с гуминовыми кислотами в растворенном и
-7 иммобилизованном состоянии для установления механизма деградации гербицида in vivo.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- выделить и охарактеризовать грибную лакказу базидиомицета Coriolus hirsutus;
- провести отбор и характеристику почвенных образцов из различных почвенно-географических зон;
- исследовать взаимодействия, протекающие в гомогенной системе лакказа - атразин - растворенные ГК, в том числе изучение процессов взаимодействия фермента с гуминовыми кислотами;
- исследовать взаимодействия, протекающие в гетерогенной системе лакказа - атразин - почвенные частицы, в том числе изучение процессов адсорбции/десорбции атразина и роли фермента в данном процессе;
- оценить возможность детоксификации почвы, загрязненной атразином, с помощью системы лакказа-ГК.
Общая характеристика лакказ как представителей оксидоредуктаз
Распространение лакказ. В настоящее время при работе с различными типами почв большую проблему составляет выявление конкретных видов продуцентов почвенных ферментов. Лишь в нескольких работах были описаны грибы, продуцирующие лакказу в почвенной среде, и были разработаны методики, позволяющие экстрагировать фермент из почвенных образцов [Lang et al., 1998; Baldrian et al., 2000].
Лакказы представлены во всех типах почв, однако активность фермента распределена неравномерно. Относительно высокая лакказная активность (по сравнению с пахотной и луговой почвами) была показана для лесной подстилки как широколиственного [Criquet et al., 2000; Carreiro et al., 2000] так и хвойного лесов, при этом лакказа в этих почвах являлась доминирующим лигнолитическим ферментом [Ghosh et al., 2003]. Некоторыми исследованиями установлено наличие лакказных генов в почвенных грибах, выделенных из различных типов почв, хотя уровень лакказной активности в них был низким и зависел от количества остатков органического вещества [Farnet, 2002]. Это позволило предположить, что лакказная активность связана с процессами деградации органического вещества почвы, и поэтому она меняется со временем в зависимости от количества органического вещества и степени его трансформации. В работе [Fioretto et al., 2000] было установлено увеличение лакказной активности в процессе деградации лиственной подстилки в среднеземноморском широколиственном лесу в зависимости от величины опада. В подстилке дуба [Criquet et al., 2000] динамика лакказной активности совпадала с сезонной динамикой роста грибной биомассы, коррелирующей с влажностью (сезонные засухи). Сезонные колебания лакказной активности, например, в лесах с умеренным климатом, также достаточно велики, и, скорее всего, связаны с поступлением свежего лиственного опада, т.е. с количеством органического вещества [Baldrian, 2006]. Показано, что вместе с вертикальным градиентом распределения грибов в почвенном профиле лакказная активность падает с увеличением глубины. Уменьшение лакказной активности коррелирует с уменьшением встречаемости гена лакказы в почвенной микрофлоре, распределенной по почвенному профилю [Chen et al., 2003]. Таким образом, одним из основных фактором распространения лакказной активности и, следовательно, почвенных грибов продуцентов фермента, является концентрация кислорода.
Кроме участия в трансформации лигнина древесных пород и лесной подстилки, лакказы способны вступать в реакции взаимодействия с почвенными ГК и участвовать в синтезе и трансформации гуминоподбных веществ (ГПВ) [Yavmetdinov et al., 2003]. Следовательно, взаимодействие лакказы с ГК почв носит двойственный характер: с одной стороны, это взаимодействие приводит к деполимеризации ГК, а с другой, к их синтезу из мономерных единиц. Выдвинутое положение подтверждается данными об обесцвечивании и уменьшении молекулярного веса ГК, что сопровождается формированием фульвокислот (ФК) при росте культуры Т. versicolor, которая продуцирует главным образом лакказу [Fakoussa et al., 1999]. Участие лакказы в синтезе ГК in vitro было подтверждено в ряде работ [Katase et al., 1991].
Следует отметить, что взаимодействие лакказы с ГК приводит не только к изменению свойств ГК, но и самого фермента. Установлено, что при сорбции лакказы на почвенном органическом веществе или на неорганических почвенных составляющих происходит увеличение термостабильности фермента [Criquet et al., 2000]. Однако в исследованиях других авторов наблюдалось ингибирование ферментативной активности практически в тех же условиях эксперимента [Claus et al., 1990; Zavarzina et al., 2004; Keum et al., 2004]. Ингибирующий эффект ГК также «двойственен» как и их взаимодействие с ферментом. Ингибирование ГК лакказы из Panus tigrinus протекало по конкурентному типу, причем сам ингибирующий эффект был обусловлен связыванием фермента с гидрофобными фрагментами ГК [Zavarzina et al., 2004]. Интересно отметить, что константы ингибирования (Ki) отличались для ГК из различных источников практически на порядок: 0.003мг/мл для ГК из торфа и 0.025 мг/мл для ГК из чернозема. Противоположного мнения о природе ингибирования фермента ГК придерживаются другие авторы [Keum et al., 2004]. По их мнению, инактивация фермента происходит не из-за связывания с ГК, а за счет диссоциации меди из молекулы фермента и хелатированием ее ГК. Если учитывать возможность ингибирования лакказы ГК, вызывают сомнения определяемые величины ферментативной активности почв или лесной подстилки, что объясняется существующими методическими подходами, которые не позволяют выделять почвенные ферменты, ненаходящиеся в комплексах с ГК [Criquet et al., 1999].
Роль лакказы в окружающей среде более значима и не ограничивается участием в таких важных процессах круговорота веществ и энергии, как разрушение лигнина и метаболизм ГК. Индукцией биосинтеза лакказ и поступлением их в окружающую среду обычно сопровождаются процессы грибного и микробного взаимодействия, включая взаимодействие почвенных грибов (Trichoderma sp.) и бактерий [Freitag et al., 1992; Velazquez-Cedeno et al., 2004]. Этот процесс не может быть рассмотрен только как частный случай, справедливый для представителей базидиальных грибов - продуцентов лакказ и микробного сообщества - т.к. аналогичный эффект индукции синтеза фермента наблюдался и при взаимодействии патогена R. solani со штаммами Pseudomonas strains, продуцирующим антигрибковые компоненты (фунгициды) [Crowe et al., 2001]. Полученные данные позволили предположить, что лакказы опосредованно влияют на процесс взаимодействия почвенных бактерий и грибов, участвуя в формировании меланинов и пигментов [Baldrian, 2004]. Это положение подтверждается установленной корреляцией увеличения уровня биосинтеза фермента и количества образующихся пигментов и меланинов с присутствием ксенобиотиков, влияющих на процессы жизнедеятельности микроорганизмов.
Кроме того, защитная роль лакказ убедительно продемонстрирована в экспериментах по изучению связывания тяжелых металлов и антигрибковых соединений (ингибиторов роста грибной микрофлоры) меланинами с образованием комплексов [Galhaup et al.5 2001; Baldrian, 2003].
Интересно отметить, что количество описанных лакказоподобных ферментов в значительной степени увеличилось за последнее десятилетие. Анализируя литературу, можно сказать, что лакказоподобные ферменты распространены в насекомых [Diamantidis et al., 2001], бактериях [Claus et al., 1997] и в прокариотах [Claus, 2003].
Общие свойства лакказ. Лакказа является представителем класса медьсодержащих оксидоредуктаз, которые катализируют реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до воды. Семейство лакказ, открытых более столетия назад, по-прежнему остается предметом фундаментальных исследований, что обусловлено, прежде всего, отсутствием детального механизма действия фермента.
Общая характеристика и применение атразина
При попадании в почву атразин, как и другие гербициды, может претерпевать различные превращения: разлагаться химически и биологически, вымываться, испаряться и т.п. (рис. 3).
Несмотря на разнообразие процессов, происходящих в почве с гербицидом, основными являются адсорбция, перемещение и разложение. Все указанные процессы приводят к снижению концентрации свободного гербицида, т.е. токсичности.
Первым процессом, в который вовлекается атразин при попадании в почву, является адсорбция. При адсорбции гербицид не исчезает из почвы, а лишь уменьшается концентрация его свободной формы и, следовательно, ограничиваются перемещение и доступность растениям. Степень адсорбции гербицида зависит как от физико-химических свойств почвы (содержание органического вещества, емкость катионного обмена, рН почвенного раствора, гранулометрический состав и др.), так и от свойств гербицида (растворимость,
полярность, поляризуемость, распределение электронных плотностей и кислотно-основые свойства молекулы) [Senesi, 1992].
В адсорбции атразина могут участвовать и органическая, и минеральная части почвы, но основная роль в поглощении принадлежит органическому веществу [Bariusso et al., 1992]. Барриусо [Barriuso et al., 1992] исследовал сорбцию атразина на двух бразильских оксипочвах и пришел к выводу, что органическое вещество почвы было самым важным фактором, который влиял на сорбцию атразина, что объяснялось сродством молекул гербицида к почвенному органическому веществу. Сходные наблюдения были получены и рядом других авторов. Так, М.Я. Березовским и Г.Н. Немовой [1973] было показано, что торфяная почва адсорбирует атразин в 19 раз сильнее, чем дерново-подзолистая. Пайа-Перец и др. [Paya-Perez et al., 1992] установили, что коэффициент распределения атразина (Kd) между почвенной и водной фазами в наибольшей степени определяется содержанием почвенного органического вещества, в то время как емкость катионного обмена (ЕКО), содержание глины, оксидов алюминия и марганца не оказывают существенного влияния. Этими же авторами на основании исследования поведения атразина в 24 почвенных профилях было высказано предположение о том, что не только общее количество органического вещества в почве, но и его состав играют существенную роль в сорбции атразина почвой.
Дальнейшие работы, посвященные роли органического вещества в определении связывающей способности почвы показали, что ведущую роль в этом процессе играют ГК, способные адсорбировать атразин по целому набору механизмов, включая электронный перенос, водородное связывание, ионное и гидрофобное связывание [Senesi, 1995; Martin-Neto, 2001].
Дальнейшими работами было показано, что на связывание атразина влияет не только содержание, но и качественный состав ГК. Исследования с использованием 13С ЯМР было установлено, что алифатические группы ГВ вносят больший вклад в адсорбцию атразина, чем ароматические [Lesan et al., 2000].
Так как взаимодействие атразина с ГК приводит к уменьшению его концентрации в почвенном растворе, то следствием адсорбции гербицида является снижение уровня его токсичности и замедлению его перемещения по почвенному профилю в грунтовые воды [Dec et al., 1997]. С другой стороны, связывание гербицида почвенными коллоидами заметно снижает скорость его разложения. В экспериментах с меченным атразином через девять лет после внесения 83% меченного 14С все еще находилось в почве, а 50% этого остатка, включая исходное соединение, представляло собой связанное вещество. Показано, что адсорбированный атразин становится менее доступным для микроорганизмов [Лебедева и др., 2002].
Часть адсорбированного почвой гербицида может быть необратимо связана компонентами почвы и не экстрагируется обычными методами, используемыми при определении - это так называемые связанные остатки. По данным различных исследователей связанные остатки, например, сим-триазинов составляют 47-57% от примененного количества [Лебедева и др., 2002]. Механизм образования связанных остатков для многих гербицидов и, в том числе, для атразина окончательно не изучен. Нерешенным также остается вопрос о возможности высвобождения связанных остатков под действием деятельности почвенных микроорганизмов, при выпадении значительных количеств осадков и других факторов.
Несмотря на всю важность адсорбции атразина, десорбция является не менее значимой в понимании поведения атразина в окружающей среде, так как именно она определяет количество вымытого и выщелоченного гербицида, что, в свою очередь, вызывает загрязнение поверхностных и грунтовых вод. В настоящее время установлено, что почвенные минералы адсорбируют атразин обратимо. Так, в работе [Balcke et al., 2002] показано, что коэффициент гистерезиса для связывания атразина каолинитом - глинистым минералом, присутствующим во всех типах почв - близок к 1. Это свидетельствует о том, что практически весь адсорбированный гербицид десорбируется с поверхности минерала. Аналогичные данные были получены для других широко распространенных почвенных минералов смектитов [Bariuso et. al., 1992]. Авторы объясняют наблюдаемое явление тем, что связь между молекулами атразина и поверхностью глинистых минералов обусловлена слабыми Ван-дер-ваальсовыми или водородными взаимодействиями. Для почвенных образцов с высоким содержанием органического углерода ( 1%), где свободных минеральных поверхностей нет вследствие их блокирования органическим веществом [Келдербенк, 1986], адсорбция также обратима, но в меньшей степени. Увеличение гистерезиса наблюдается также и для глинистых минералов, обогащенных ГК [Balcke et al., 2002].
Влияние лакказы на взаимодействие атразина с почвами
Для исследования влияния лакказы С. hirsutus на детоксифицирующий потенциал ГК на перлите использовали препарат ГК угля, ранее изученный при проведении химических экспериментов.
Схема экспериментов включала в себя варианты с тремя возрастающими концентрациями лакказы и двумя концентрациями препарата ГК при постоянной концентрации атразина, которую выбирали на основании предварительно полученного диапазона токсичности атразина. Для изучения стимулирующего действия препарата лакказы и ГК в схему опытов были включены варианты с такими же концентрациями препаратов, но без внесения атразина. Контрольным вариантом служил вариант без внесения лакказы, препарата ГК и атразина.
Проведенные эксперименты показали, что внесение лакказы в перлит не влияло на рост растений пшеницы (рис. 19А).
При всех исследованных дозах внесения лакказы как длина, так и биомасса растений пшеницы значимо не отличались от контрольных значений. Внесение в перлит ГК угля, напротив, приводило к выраженному увеличению длины и биомассы растений. Полученные результаты хорошо согласуются с приводимыми в литературе данными о положительном влиянии гуминовых удобрений на рост и развитие растений [Kulikova et al., 2005].
При этом биомасса растений оказалась более чувствительным параметром к внесению ГК, чем длина: достоверные отличия от контрольных значений при использовании в качестве тест-отклика длины наблюдали только при дозе внесения ne ЮОмг/кг перлита, тогда как при учете биомассы было установлено, что ГК обладают стимулирующим эффектом даже при дозе внесения 10 мг/кг.
Внесение лакказы не оказывало значимого влияния на стимулирующую активность ГК угля: при всех исследованных дозах внесения фермента: полученные значения как длины, так и биомассы растений не отличались от аналогичных, полученных при внесении ГК без лакказы.
Проведенные эксперименты показали, что внесение атразина в дозе 20 мг/кг перлита приводило к выраженному угнетению растений пшеницы: их биомасса снижалась до (45±8)%, а длина - до (73+15)% от контрольных значений. Полученные показатели токсичности атразина свидетельствуют о том, что биомасса растений угнеталась в большей, по сравнению с длиной, степени. Наблюдаемый факт объясняется особенностями механизма действия атразина. Известно, что этот гербицид является специфическим ингибитором фотосинтеза, блокируя отток электронов от акцепторной части фотосистемы II (ФС II), т.е. нарушает нециклический транспорт электронов. Являясь ингибитором транспорта электронов, он действует исключительно на мембранные стадии их переноса между двумя ФС при участии пластохинонного подвижного переносчика [Гольдфельд, 1989.].
Так как атразин угнетает световую стадию фотосинтеза, то для проявления его токсичности необходимо наличие у растений сформировавшегося фотосинтетического аппарата. В условиях лабораторно-вегетационного эксперимента формирование фотосинтетического аппарата растений пшеницы завершается обычно к двухнедельному возрасту растений. При этом максимальное увеличение длины растений также завершается к этому сроку, а в дальнейшем они преимущественно накапливают биомассу, незначительно изменяясь по длине. Поэтому из полученных нами данных можно сделать вывод о том, что при биотестировании атразина в качестве тест-отклика следует использовать биомассу растений как более чувствительный показатель по сравнению с длиной растений.
Как показали проведенные эксперименты, внесение лакказы в перлит, загрязненный атразином, не приводило к значимому изменению токсичности гербицида (рис. 19Б).
Эти результаты хорошо согласуются с полученными нами ранее данными, свидетельствующими об отсутствии взаимодействия лакказы с атразином в гомогенной среде (см. п. 3.4).
Внесение в перлит ГК угля значимо снижало токсичность атразина уже в дозе 10 мг/кг; увеличение дозы внесения ГК приводило к возрастанию наблюдаемого эффекта детоксификации атразина. Так, длина растений при дозе внесения ГК угля 100 мг/кг почвы составляла (95±7)% от контроля и значимо не отличалась от варианта без внесения гербицида. Аналогичный показатель для биомассы растений составлял (84±10)%, что также было близко к контрольным значениям. Детоксифицирующую способность ГК угля по отношению к атразину хорошо объясняют полученные нами данные о возможности взаимодействия ГК с атразином в гомогенных условиях (п. 3.4). Вероятно, наблюдаемый факт объясняется образованием комплексов лакказа-ГК и изменениями свойств ГК в присутствии фермента, такими как полимеризация или частичный гидролиз.
Таким образом, биотестирование с использованием инертного субстрата перлита подтвердили полученные нами результаты о том, что лакказа непосредственно не может инициировать процесс окислительного связывания атразина ГК, а, наоборот, приводит к снижению взаимодействия гербицида с ГК.
Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами
Как показали проведенные эксперименты, внесение лакказы в перлит, загрязненный атразином, не приводило к значимому изменению токсичности гербицида (рис. 19Б).
Эти результаты хорошо согласуются с полученными нами ранее данными, свидетельствующими об отсутствии взаимодействия лакказы с атразином в гомогенной среде (см. п. 3.4).
Внесение в перлит ГК угля значимо снижало токсичность атразина уже в дозе 10 мг/кг; увеличение дозы внесения ГК приводило к возрастанию наблюдаемого эффекта детоксификации атразина. Так, длина растений при дозе внесения ГК угля 100 мг/кг почвы составляла (95±7)% от контроля и значимо не отличалась от варианта без внесения гербицида. Аналогичный показатель для биомассы растений составлял (84±10)%, что также было близко к контрольным значениям. Детоксифицирующую способность ГК угля по отношению к атразину хорошо объясняют полученные нами данные о возможности взаимодействия ГК с атразином в гомогенных условиях (п. 3.4). Вероятно, наблюдаемый факт объясняется образованием комплексов лакказа-ГК и изменениями свойств ГК в присутствии фермента, такими как полимеризация или частичный гидролиз.
Таким образом, биотестирование с использованием инертного субстрата перлита подтвердили полученные нами результаты о том, что лакказа непосредственно не может инициировать процесс окислительного связывания атразина ГК, а, наоборот, приводит к снижению взаимодействия гербицида с ГК.
Для исследования влияния лакказы С. hirsutus на детоксифицирующий потенциал ГК в почвенной среде, как и при проведении экспериментов на перлите, использовали препарат ГК угля, ранее изученный при проведении химических экспериментов.
Проведенные эксперименты показали, что внесение лакказы не влияло на рост растений пшеницы (рис. 20А). При исследованных дозах внесения фермента длина и биомасса растений пшеницы варьировались в диапазоне (95±8)% - (107±7)% от контроля и не отличались значимо от вариантов без внесения фермента.
Небольшое положительное влияние ГК на рост растений было отмечено только в варианте внесения ГК 100 мг/кг почвы, когда биомасса растений составила около (115+6)% от контрольных величин. Таким образом, в отличие от экспериментов на перлите, стимулирующее действие ГК по отношению к растениям пшеницы было менее выраженным. Наблюдаемые различия объясняются, по-видимому, особенностями использованных субстратов. Перлит представляет собой вспененный вулканический песок, не содержащий органических веществ, т.е. является инертным субстратом. Широко известным является факт о большей активности органических удобрений, включая гуминовые, на почвах, содержащих незначительное количество органических веществ.
Почва, в свою очередь, представляет собой субстрат, содержащий все необходимые для роста и развития растений вещества, включая органические. Поэтому потребность растений на почве в дополнительных источниках питания выражена незначительно. Таким образом, большая отзывчивость пшеницы на внесение ГК угля в условиях инертного субстрата объясняется отсутствием в последнем набора органических веществ, необходимых для нормального роста и функционирования растений.
Особо следует отметить, что внесение фермента привело к небольшому снижению положительного действия ГК. Этот факт объясняется, по-видимому, взаимодействием лакказы с ГК и изменениями свойств последних в присутствии фермента, такими как полимеризация или частичный гидролиз. Принимая во внимание, что гидролиз ГК приводил бы к образованию низкомолекулярных продуктов, более доступных и, следовательно, активных в отношении растений, на основании полученных результатов можно высказать предположение, что в выбранных нами условиях при взаимодействии лакказы с ГК происходит преимущественно полимеризация, а не гидролиз гуминового материала.
Проведенные эксперименты показали, что внесение атразина в дозе 2 мг/кг почвы приводило к выраженному угнетению растений. Биомасса пшеницы снижалась до (64±5)%, а длина - до (80+12)% от контрольных значений. Полученные показатели токсичности атразина подтверждают полученные нами ранее в экспериментах на перлите закономерности: среди использованных тест-откликов биомасса растений была более чувствительна, чем длина.
В отличие от экспериментов на перлите, внесение лакказы в почву, загрязненную атразином, вызывало выраженное снижение токсичности гербицида (рис. 20Б). При этом наблюдаемое снижение токсичности гербицида имело явную зависимость от концентрации фермента в почве. При дозах внесения лакказы 0.076, и 7.6 мг/кг биомасса растений пшеницы возрастала с (64±5)% до (69+6)% и (73+5)%, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют, что в почвенных условиях лакказа способна снижать токсичность атразина. Это хорошо согласуется с данными по положительному влиянию фермента на адсорбцию атразина, в том числе необратимую, почвами различных типов (п. 3.5).
