Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Кофакторы транскетолазы 11
2. Взаимодействие тиаминдифосфата с апотранскетолазой 14
2.1 Двустадийный процесс взаимодействия тиаминдифосфата с апотранскетолазой 14
2.2 Изменение спектральных характеристик транскетолазы в результате ее взаимодействия с коферментом 16
2.3 Кинетическая модель связывания кофермента с апотранскетолазой 23
2.4 Неэквивалентность активных центров в димере транскетолазы при связывании кофермента 27
2.5 Влияние субстратов на реконструкцию холотранскетолазы и ее стабильность 28
3. Связывание субстратов с транскетолазой и их каталитические
превращения 33
3.1 Изменение спектра холотранскетолазы в результате связывания и превращения субстратов 33
3.2 Двусубстратная транскетолазная реакция 34
3.3 Неэквивалентность активных центров транскетолазы по отношению к субстрату-донору 38
3.4 Односубстратная транскетолазная реакция 41
1. Теоретический анализ взаимодействия лиганд-связывающих центров в димерном белке 46
1.1. Модель с эквивалентными и невзаимодействующими лиганд- связывающими центрами 46
1.1.1. Описание схемы двустадийного связывания тиаминдифосфата с транскетолазой 46
1.1.2. Вывод теоретических уравнений 47
1.2. Модель с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами 50
1.2.1. Описание схемы 50
1.2.2. Вывод теоретических уравнений 52
1.2.3. Исследование модели с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами 55
1.2.3.1. Построение графиков зависимостей степени насыщения белка лигандом (Г), степени конформационных изменений (Z) и нормированной степени конформационных изменений (Z„opM) от концентрации лиганда, L 55
1.2.3.2. Построение трехмерного графика, связывающего степень насыщения белка лигандом (У), нормированную степень конформационных изменений (ZHopM) и концентрацию лиганда, L 57
1.2.3.3. Построение и анализ графиков зависимости нормированной степени конформационных изменений (ZHopM) от степени насыщения белка лигандом (У) 57
1.3. Исследование кооперативных взаимодействий для теоретических моделей 63
1.3.1. Модель Моно, Уаймена и Шанжё 63
1.3.1.1. Описание модели 63
1.3.1.2. Сопоставление модели Моно, Уаймена, Шанже и разработанной нами модели с взаимодействующими лиганд- связывающими центрами 64
1.3.2. Модель Кошланда, Немети и Филмера 65
1.3.2.1. Описание модели 65
1.3.2.2. Сопоставление модели Кошланда, Немети, Филмера и разработанной нами модели с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами 68
2. Возможность практического использования теоретических разработок на примере транскетолазы .. 71
2.1. Выбор модели для изучения взаимодействия тиаминдифосфата с апотранскетолазой 72
2.1.1. Сравнение графиков остаточной разности 72
2.1.2. Коэффициент смешанной корреляции, как критерий выбора модели 75
2.2. Расчет равновесных и кинетических констант при связывании тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов Mg2 76
2.2.1. Построение зависимости начальной скорости связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой от концентрации тиаминдифосфата и определение параметров Vo,npwi и . 76
2.2.2. Определение равновесных констант K\YLKI 78
2.2.3. Определение констант скорости к+и к.\, &+2 и к.2 81
2.2.4. Построение графика зависимости нормированной степени конформационных изменений (Z) от степени насыщения белка лигандом (У) для экспериментальных данных 85
2.2.5. Связывание тиаминдифосфата с транскетолазой в присутствии субстрата-донора 85
2.3. Расчет равновесных и кинетических констант при связывании тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов Са2+ 87
2.3.1. Определение параметров Уо,пред и К& 87
2.3.2. Определение равновесных и кинетических констант 89
2.3.3. Построение графика зависимости нормированной степени конформационных изменений (ZHOpM) от степени насыщения белка лигандом (У) для экспериментальных данных 93
2.3.4. Связывание тиаминдифосфата с транскетолазой в присутствии субстрата-донора 93
3. Заключение 97 1]с
4. Выводы 100 5q
5. Список литературы 102
- Двустадийный процесс взаимодействия тиаминдифосфата с апотранскетолазой
- Неэквивалентность активных центров транскетолазы по отношению к субстрату-донору
- Построение и анализ графиков зависимости нормированной степени конформационных изменений (ZHopM) от степени насыщения белка лигандом (У)
- Определение равновесных и кинетических констант
Введение к работе
Транскетолаза (ТК, седогептулозо-7-фосфат: D-глицеральдегид-3-фосфатгликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1) является ключевым ферментом неокислительной ветви пентозофосфатного пути превращения углеводов. Катализирует перенос дигидроксиэтильного остатка (остатка гликольальдегида) с кетозы на альдозу [1-3]:
СН2ОН СН2ОН
с=0 НСО ТК нсо С=0
I + | * | + I
носн Rl R носн
неон неон
R R'
R и R' могут быть представлены различными группами. Фермент характеризуется достаточно широкой субстратной специфичностью [4]. Функцию субстрата-донора гликольальдегидного остатка могут выполнять 0-седогептулозо-7-фосфат, D-фруктозо-б-фосфат, D-ксилулозо-5-фосфат, Б-октулозо-8-фосфат, L-эритрулоза и гидроксипируват. За исключением последнего, у всех известных субстратов-доноров гидроксильные группы при Сз и С4 находятся в транс-положении. В случае гидроксипирувата одним из продуктов реакции является СОг, ввиду чего транскетолазная реакция становится необратимой:
CH2OH
СН2ОН с=о
I XI/ I
с=о + нсо носн
I I "* с2 + I
СООН R R
Фосфорилированные субстраты имеют значительно более высокое сродство к ТК по сравнению с теми, у которых фосфатная группа отсутствует [4].
Кофакторами ТК являются тиаминдифосфат (ТДФ) и ионы двухвалентных металлов, такие как Са2+ и Mg2+. Транскетолаза была обнаружена в 1953 г. [5, 6]. В настоящее время наличие ее показано практически во всех исследованных тканях животного и растительного происхождения, а также у микроорганизмов. Фермент локализуется, преимущественно, в растворимой фракции клетки. Что касается объекта нашего исследования, ТК Saccharomyces cerevisiae, то к настоящему времени определен ее аминокислотный состав и пространственная структура [7-9]. Методами химической модификации [10-13], рентгеноструктурного анализа [9, 14-18] и направленного мутагенеза [19-23] идентифицированы аминокислотные остатки, необходимые для связывания ТДФ, субстратов и осуществления катализа. Имеется достаточно подробная информация, касающаяся оптических свойств фермента и их изменений при взаимодействии с транскетолазой различных лигандов [4, 24-35]. Показано различное влияние двухвалентных катионов на связывание тиаминдифосфата с транскетолазой [36-41].
Молекула ТК состоит из двух идентичных субъединиц и содержит два активных центра, образованных на границе между контактирующими поверхностями этих субъединиц. Молекулярная масса ТК составляет 148 кДа [14,42]. Активные центры характеризуются одинаковой каталитической активностью. Каталитически активной единицей ТК является димер [43-45].
Транскетолаза пекарских дрожжей - первый тиаминдифосфат-зависимый фермент, для которого в 1992 г. был сделан рентгеноструктурный анализ [14]. Помимо апо- и холофермента, к настоящему времени, с помощью рентгеноструктурного анализа, проанализированы комплексы ТК с различными аналогами ТДФ [17, 18], с дигидроксиэтилтиаминдифосфатом - интермедиатом транскетолазной реакции [46], и комплекс холоТК с субстратом-акцептором (эритрозо-4-фосфатом) [23]. Данные рентгеноструктурного анализа позволили охарактеризовать структуру активного центра фермента и дали толчок к более глубокому изучению механизма тиаминового катализа. В настоящее время сделан рентгеноструктурный анализ и других тиаминдифосфат-зависимых ферментов, таких как пируватдекарбоксилаза дрожжей [47, 48] и Zimomonas mobilis [49], пируватоксидаза [50, 51], бензоилформиатдекарбоксилаза [52], человеческая дегидрогеназа а-кетокислот [53]. Общие структуры этих тиаминдифосфат-зависимых ферментов достаточно сильно различаются, однако область связывания кофакторов (двухвалентных катионов и ТДФ) имеет значительное сходство.
Что касается механизма функционирования ТК, понимая под этим процесс взаимодействия ТК с кофакторами, взаимодействие с субстратами, их каталитические превращения, характеристика
индивидуальных стадий реакции, катализируемой ТК, до последнего времени был исследован недостаточно.
Задачей данного исследования являлась разработка теоретической модели взаимодействия лигандов с димерным белком, с учетом существования кинетически значимых стадий конформационных изменений лиганд-связывающих центров, и использование этой модели для характеристики взаимодействия кофермента, тиаминдифосфата, с транскетолазой.
Двустадийный процесс взаимодействия тиаминдифосфата с апотранскетолазой
АпоТК достаточно быстро инактивируется под действием тетранитрометана [80]. Скорость инактивации холо- и полухолоТК одинакова и существенно ниже, чем скорость инактивации апоТК (ср. графики II и I на рис.13). В присутствии кетозы (III на рис.13) скорость инактивации холоТК повышается и сравнивается со скоростью инактивации апоТК (I на рис. 13), но только в начальный промежуток времени. Затем, когда фермент инактивируется, примерно, наполовину по отношению к исходной его активности, инактивация прекращается. В присутствии кетозы повышается скорость инактивации и полухолоТК, причем в такой же степени, как скорость инактивации холоТК. Отличие заключается лишь в том, что в данном случае график инактивации остается линейным с начала и до конца инактивации фермента (ср. I и III на рис.13).
Двухфазный характер кривой инактивации холоТК, как полагают авторы [80], обусловлен тем, что кетоза повышает скорость инактивации одного из активных центров и предотвращает инактивацию другого. Начальный участок кривой инактивации холоТК совпадает с кривой инактивации полухолоТК, следовательно, тот активный центр, скорость инактивации которого в присутствии субстрата повышается, содержит субстрат.
Активные центры ТК характеризуются одинаковой каталитической активностью, т.е. активность холоТК в два раза выше, чем активность полухолоТК [44, 74, 82]. Нельзя поэтому исключить, что в действительности, субстрат содержится и в первом активном полухолоТК (2); активность полухолоТК в присутствии и отсутствие кетозы, была измерена без добавления ТДФ с тем, чтобы определить активность только тех активных центров, которые содержат ТДФ; III: холоТК в присутствии Ф6Ф (4); IV: контроль в отсутствие ингибитора (7) [81]. центре, и во втором (который в присутствии субстрата не теряет каталитической активности), но в различных состояниях -расщепленном и нерасщепленном. Другими словами, активные центры функционируют одновременно, но в противофазе: когда в одном из них кетоза расщепляется (с образованием интермедиата, ДОЭТДФ - первая стадия реакции), в другом она образуется (осуществляется вторая стадия реакции - перенос гликольальдегидного остатка с ДОЭТДФ на субстрат-акцептор) [81, 83]. Такое представление о функционировании активных центров нашло подтверждение в результатах экспериментов, в которых холоТК инкубировали с фруктозо-6-фосфатом, содержащим радиоактивную метку в первом углеродном атоме [84]. В результате, связанная с ферментом метка распределялась примерно поровну между Ф6Ф и одним из продуктов его расщепления - гликольальдегидом. Как уже указывалось выше, при добавлении к холоТК кетозы изменяется амплитуда индуцированной полосы поглощения в спектрах КД, обусловленное образованием ДОЭТДФ в результате расщепления субстрата. Причем, в присутствии Ф6Ф (обратимо расщепляемого субстрата) амплитуда изменения примерно в два раза меньше, чем в присутствии ПТ (необратимо расщепляемого субстрата) - ср. спектры 3 и 4 на рис.5. Это указывает на то, что в первом случае дигидроксиэтилтиаминдифосфата («расщепившегося» субстрата) образовалось, примерно, в два раза меньше, чем во втором. Другими словами, расщепление Ф6Ф произошло только в одном из двух активных центров, в то время как необратимо расщепляемый субстрат, гидроксипируват, расщепляется (декарбоксилируется) одновременно в обоих активных центрах. До сих пор речь шла о классической транскетолазной (трансферазной) реакции, для осуществления которой необходимо наличие двух субстратов - субстрата-донора и субстрата-акцептора. Оказалось, однако, что ТК может катализировать и односубстратную реакцию, с использованием только субстрата-донора, кетозы, в отсутствии субстрата-акцептора [85,86]. Поводом для изучения этого вопроса стало наблюдение динамики изменения спектра холоТК после добавления к ней кетозы. Сразу после добавления наблюдалось изменение интенсивности индуцированной полосы поглощения (ср. 1 и 2 на рис.14), обусловленное, как уже говорилось, образованием ДОЭТДФ, интермедиата транскетолазной реакции, в результате расщепления субстрата. Однако, со временем интенсивность полосы восстанавливалась (ср. 2, 4-7 на рис.14). Это и навело на мысль о том, что гликольальдегидный остаток может отщепляться от ДОЭТДФ не только при наличии субстрата-акцептора (и связываться с ним, образуя кетозу - обычный для двусубстратной транскетолазной реакции продукт), но и в его отсутствии. Обнаружить гликольальдегид в свободном виде в качестве продукта реакции не удалось; вместо него обнаруживалась лишь эритрулоза. В данном случае могут иметь место, как минимум, две возможности [85]. Первая - гликольальдегид в свободном виде все же выделяется, но сразу же вступает (будучи способным выполнять функцию субстрата-акцептора) во взаимодействие со второй молекулой гликольальдегида, образующейся при расщеплении второй молекулы кетозы; продуктом такого взаимодействия оказывается эритрулоза.
Неэквивалентность активных центров транскетолазы по отношению к субстрату-донору
До сих пор речь шла о классической транскетолазной (трансферазной) реакции, для осуществления которой необходимо наличие двух субстратов - субстрата-донора и субстрата-акцептора. Оказалось, однако, что ТК может катализировать и односубстратную реакцию, с использованием только субстрата-донора, кетозы, в отсутствии субстрата-акцептора [85,86]. Поводом для изучения этого вопроса стало наблюдение динамики изменения спектра холоТК после добавления к ней кетозы. Сразу после добавления наблюдалось изменение интенсивности индуцированной полосы поглощения (ср. 1 и 2 на рис.14), обусловленное, как уже говорилось, образованием ДОЭТДФ, интермедиата транскетолазной реакции, в результате расщепления субстрата. Однако, со временем интенсивность полосы восстанавливалась (ср. 2, 4-7 на рис.14). Это и навело на мысль о том, что гликольальдегидный остаток может отщепляться от ДОЭТДФ не только при наличии субстрата-акцептора (и связываться с ним, образуя кетозу - обычный для двусубстратной транскетолазной реакции продукт), но и в его отсутствии. Обнаружить гликольальдегид в свободном виде в качестве продукта реакции не удалось; вместо него обнаруживалась лишь эритрулоза.
В данном случае могут иметь место, как минимум, две возможности [85]. Первая - гликольальдегид в свободном виде все же выделяется, но сразу же вступает (будучи способным выполнять функцию субстрата-акцептора) во взаимодействие со второй молекулой гликольальдегида, образующейся при расщеплении второй молекулы кетозы; продуктом такого взаимодействия оказывается эритрулоза. Вторая возможность заключается в том, что гликольальдегид в свободном виде в среду вообще не выделяется, а, отщепившись от ДОЭТДФ, остается связанным с белком до тех пор, пока не образуется вторая молекула гликольальдегида и не произойдет их конденсация, в результате чего опять же образуется эритрулоза -конечный продукт односубстратной транскетолазной реакции.
Односубстратная реакция обратима и протекает до тех пор, пока не установится равновесие между исходным субстратом (кетозой) и продуктами его превращения - гликольальдегидом, первым продуктом реакции, и эритрулозой.
Наглядной иллюстрацией такого рода заключения являются эксперименты, результаты которых приведены на рис.15. В качестве субстрата в данном случае использовали К5Ф. За ходом односубстратной транскетолазной реакции следили по изменению оптической плотности при 340 нм, обусловленному восстановлением НАД за счет окисления ФГА (первого продукта реакции) под действием добавленной ГАФД. По величине изменения оптической плотности определяли и количество образующейся в процессе реакции ФГА.
График 1 на рис. 15а отражает протекание односубстратной транскетолазной реакции в полной системе. В отсутствие ГАФД реакция, естественно, не идет. Если же ГАФД добавлять не сразу, а через определенные промежутки времени, то сначала, после добавления, наблюдается «всплеск» на кривой изменения оптической плотности, после чего наступает монотонное ее повышение, аналогичное тому, что наблюдается в контроле (ср. графики 2-6 с графиком 1 на рис. 15а). Причем, величина «всплеска» примерно через Кинетика накопления первого продукта односубстратной транскетолазной реакции (ФГА), определяемого по изменению поглощения при 340 нм. ТК, 5 мкг; К5Ф 70 мкМ. а: 1 - ГАФД добавлена в пробу до начала инкубации; 2-6, ГАФД добавлена, соответственно, через 0,5; 1,5; 2; 4 и 7 мин после начала инкубации (показано стрелками); б: 1 - в присутствии ГАФД; непрерывная запись на приборе; 2 в отсутствие ГАФД; через определенные промежутки времени определяли количество ФГА, образовавшегося в инкубируемой пробе [86].
Построение и анализ графиков зависимости нормированной степени конформационных изменений (ZHopM) от степени насыщения белка лигандом (У)
Для анализа функции насыщения апотранскетолазы коферментом была использована схема, включающая стадии связывания тиаминдифосфата с каждым из двух активных центров и их последующие конформационные изменения. Для характеристики кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат связывающими центрами транскетолазы предложено использовать графики зависимости нормированной степени конформационных изменений (ZHOpM) от степени насыщения белка лигандом (Y). Получены строгие математические выражения, описывающие кривые спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом, и проанализирован характер кооперативных взаимодействий между активными центрами в димерной молекуле фермента. Следует подчеркнуть, что в настоящей работе графики зависимости нормированной степени конформационных изменений от степени насыщения белка лигандом впервые систематически использованы для количественной характеристики кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами в олигомерной молекуле фермента. Использование разработанных нами моделей для обработки экспериментальных данных позволило подтвердить известный ранее факт отрицательной кооперативности активных центров транскетолазы по связыванию ТДФ в присутствии Са , дать количественную характеристику отрицательной кооперативности, а также однозначно решить вопрос о существовании отрицательной кооперативности в присутствии Mg . Об этом свидетельствовало характерное положение кривой зависимости нормированной доли конформационно измененного фермента от доли фермента, связанного с лигандом (рис. 28), аналогично тому, как это было в экспериментах с ионами кальция (рис. 336). На это же указывали и значения констант скорости для индивидуальных стадий процесса взаимодействия транскетолазы с коферментом: более низкое значение константы скорости прямого конформационного перехода во втором активном центре (к+2 на схеме 6) по сравнению с первым (к+і) и обратное соотношение значений констант скорости для обратного конформационного перехода (к.2 и к_ь соответственно). В результате этого значение константы изомеризации для второго активного центра (К2) увеличивается, по сравнению с первым (Ki), примерно на порядок (Табл. 2).
На первой стадии взаимодействие ТДФ с транскетолазой (схема 3), когда образуется легко диссоциирующий промежуточный комплекс ТК—ТДФ, значение константы его диссоциации (K j) определяется типом катиона, используемого в качестве кофактора: в присутствии Mg оно равно 1600 мкМ, а в присутствии Са - 340 мкМ (табл. 2).
Субстрат-донор не влияет на первичное связывание ТДФ, приводящее к образованию комплекса ТК—ТДФ, но оказывает, в присутствии Mg2+, влияние на значение константы скорости как прямого, так и обратного конформационного перехода во втором активном центре (соответственно, к+2 и к.2 на схеме 6). Однако, так как влияние субстрата-донора выражено, примерно, в равной степени, значение константы изомеризации (К2) при этом, по существу, не меняется. В то же время, константа изомеризации в первом активном центре (Ki) изменяется в присутствии субстрата - ее значение снижается, как минимум, в шесть раз (табл. 2). При использовании ионов кальция в качестве кофактора, субстрат-донор так же, как и в опытах, поставленных в присутствии ионов магния, оказывает влияние на скорость как прямого, так и обратного конформационного перехода во втором активном центре, однако в разной степени, в результате чего происходит снижение значения константы изомеризации, К2 (табл. 2).
Определение равновесных и кинетических констант
Проанализируем график функции ZmpM(Y) для экспериментальных данных спектрофотометрического титрования (рис. 26). На рис. 28 представлен результат математической обработки в координатах ZHOpM(Y) для этих данных. Видно, что график функции находится выше пунктирной линии, проходящей под углом 45. Это означает, что при связывании ТДФ с апоТК в присутствии ионов Mg имеет место отрицательная кооперативность.
Кривая титрования апоТК тиаминдифосфатом в присутствии субстрата-донора, гидроксипирувата, изображена на рис. 26 (кривая 2). Из рисунка видно, что значительная часть начального участка кривой представлена прямой линией, что указывает на очень высокое сродство ТДФ к первому активному центру: весь добавляемый кофермент полностью связывается с апобелком - эквимолярное связывание. По этой причине мы не смогли определить значение К\ (а также значение к.\) и во всех последующих расчетах принимали, что константа К\ имеет достаточно низкое значение и равна 1-Ю"4. На основании данных, представленных на рис. 26 (кривая 2), используя уравнения (22), (25), (42), (43) и принимая константу , равной 1-Ю"4, а константу Kd, равной величине Kd в отсутствие субстрата (1,6 мМ), мы получили следующие значения є и К2: є = 0,00269 ± 0,00002 MKIVTW1 и К2 = 0,008 ±0,001. Заметим, что те же значения параметров є и Кг были получены и в том случае, если при расчетах мы использовали для константы К\ значения более низкие, чем 1-Ю"4.
При обработке экспериментальных данных (один из примеров которых представлен на вставке рисунка 27) с помощью уравнений (41)-(50) получены следующие значения кинетических констант скорости конформационных переходов во втором активном центре: к+2 = 0,037 ± 0,005 с 1 и к.г = 0,00030 ± 0,00004 с"1. апотранскетолазой при использовании в качестве кофактора Са проводили так же, как и анализ результатов экспериментов, в которых в качестве кофактора использовали ионы Mg (раздел 2.2). Как и в экспериментах с Mg2+ в присутствии субстрата (рис. 26 кривая 2), 9+ сродство тиаминдифосфата к ТК в присутствии ионов Са (даже в отсутствие субстрата) столь велико, что первые порции добавляемого кофермента полностью связываются с первым активным центром фермента и начальный участок кривой выражается прямой линией в координатах изменения оптической плотности от свободной концентрации ТДФ (кривая 1 на рис. 29). Поэтому, как и в случае с Mg присутствии субстрата (раздел 2.2.5.), определить значение равновесной константы для первого активного центра К\ (а также значение к.\) не представлялось возможным и мы приняли значение константы К\ равным 1-Ю 4. Для определения значений Кй и Vo,npwi мы построили касательные к кинетическим кривым реконструкции холоТК (рис. 30), что позволило получить зависимость начальной скорости взаимодействия ТДФ с апоТК от концентрации ТДФ (рис. 31). Анализировали эту зависимость с помощью уравнения (42) и получили следующие значения параметров К& и Уо)ПреД: - = 0,34 ± 0,08 мМ, vo,npwi = 0,027 ± 0,002 АА320/сек. Описание зависимости Л320 от [ТДФ]0бЩ (кривая 1 на рис. 29) с помощью уравнения (40) дало следующие значения констант є и К2: є = 0,00375 ± 0,00002 (мкМУ с"1, К2 = 0,0013 ± 0,0001. Используя уравнение (39), мы рассчитали значение константы к+\ для данных, представленных на рис. 31: к+\ = 0,8 ±0,1 с". Затем, с помощью уравнений (44)-(53) для данных кинетики реконструкции холоТК из апоТК и кофермента (рис. 32), определили значения констант к+2 и к.2\ к+2 = 0,23 ± 0,05 с"1, к.2 = 0,00029 ± 0,00006 с"1. конформационных изменений (ZHOpM) от степени насыщения белка лигандом (Y) для экспериментальных данных На рис. 33 приведен график функции ZHOpJX) для экспериментальных данных спектрофотометрического титрования, представленных на рис. 29 (кривая 1). Так как в присутствии ионов Ca + в первом активном центре происходит эквимолярное связывание ТДФ (раздел 2.3.1), то это приводит к линейной зависимости в координатах Z(Y) от 0 до значения 0,5 (рис. 33а). В случае нормирования получается график, изображенный на рис. 336.
