Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1. Неупорядоченные белки 8
1.1. История открытия 8
1.2. Свойства неупорядоченных белков 13
1.3. Методы идентификации неупорядоченных белков 15
1.4. Функции неупорядоченных белков 18
2. Амилоидные и амилоидоподобные белки 21
2.1. Природные патогенные амилоидные белки и прионы 21
2.1.1. История изучения амилоидов 21
2.1.2. Методы идентификации и исследования структуры амилоидов...22
2.1.3. Структура амилоидных фибрилл 26
2.1.4. Олигомеризация амилоидных белков и цитотоксическое действие амилоидов 28
2.2. Функциональные амилоиды 32
3. Мультифункциональный белок YB-1 35
3.1. Структурная организация YB-1 35
3.2. Функции YB-1
3.2.1. Функции YB-1 в цитоплазме 40
3.2.2. Функции YB-1 в ядре 42
3.2.3. Транслокация YB-1 из цитоплазмы в ядро 44
3.2.4. Распределение YB-1 в цитоплазме и ядре 45
3.2.5. Секреция YB-1 из клеток 47
3.2.6. Участие YB-1 в эмбриональном развитии 47
3.2.7. Связь YB-1 с онкогенезом 48
3.3. Молекулярные основы многофункциональности YB-1 51
3.3.1. Взаимодействие YB-1 с нуклеиновыми кислотами 51
3.3.2. Взаимодействие YB-1 с белками 54
3.3.3. Посттрансляционные модификации YB-1 56
Материалы и методы 58
1. Генетические конструкции, использованные в работе 58
2. Получение белка YB-1 и его фрагментов 58
3. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS 61
4. Спектроскопия кругового дихроизма 62
5. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия 62
6. Спектроскопия ЯМР 62
7. Малоугловое рентгеновское рассеяние 62
8. Аналитическое ультрацентрифугирование 63
9. Аналитическая гель-фильтрация 63
10. Электронная микроскопия 64
11. Атомно-силовая микроскопия 64
12. Флуоресцентная микроскопия 64
13. Окраска конго красным 65
14. Дифракция рентгеновских лучей на ориентированных препаратах 65
15. Анализ образования амилоидов по флуоресценции тиофлавинаТ 66
16. Диссоциация фибрилл 66
Результаты 67
1. Исследование белка YB-1 в растворе 67
1.1. А/Р-домен и CTD белка YB-1 предсказываются как неупорядоченные67
1.2. Спектры кругового дихроизма указывают на большое содержание клубкообразной формы и структуры поли(Ъ)-пролиновой спирали второго типа 69
1.3. Домен холодового шока белка YB-1 обладает низкой стабильностью и претерпевает денатурационный переход как при нагревании, так и при охлаждении 70
1.4. YB-1 в растворе обладает высокой степенью компактности 73
1.5. Олигомеризация YB-1 74
2. Формирование фибрилл белком YB-1 76
2.1. Белок YB-1 способен образовывать протяженные фибриллы с участием домена холодового шока 76
2.2. Фибриллы YB-1 являются амилоидоподобными 79
2.3. Исследование процесса образования фибрилл YB-1 82
2.4. Влияние различных катионов на рост амилоидоподобных фибрилл YB-1 84
2.5. При понижении ионной силы фибриллы YB-1 распадаются 85
Обсуждение результатов 88
1. Белок YB-1 является нативно неупорядоченным белком 88
2. Возможные причины компактности YB-1 89
3. Роль ионной силы в фибриллообразовании 91
4. Способность YB-1 к амилоидообразованию может быть обусловлена низкой стабильностью домена холодового шока 92
5. Особенности роста фибрилл 93
6. Возможная структура амилоидов YB-1 93
7. Возможное значение способности YB-1 образовывать амилоидоподобные структуры 94
Выводы 97
Список литературы
- Методы идентификации неупорядоченных белков
- Структура амилоидных фибрилл
- Участие YB-1 в эмбриональном развитии
- Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия
Методы идентификации неупорядоченных белков
Для выявления структурной неупорядоченности белков используются в основном те же методы, что были разработаны для анализа структуры «традиционных» упорядоченных белков. При этом, как правило, вывод о неупорядоченности делается из отсутствия признаков упорядоченности (Uversky & Dunker, 2010).
Метод РСА выявляет отсутствие электронной плотности во многих белковых структурах, которое может соответствовать неупорядоченной области/областям. Повышенная подвижность атомов и групп приводит к тому, что в разных молекулах белка эти атомы располагаются по-разному, что нарушает дифракцию рентгеновских лучей (Dunker et al., 2001). Поскольку и структурированные домены могут колебаться относительно друг друга за счет шарнирных участков, не всегда длинные ненаблюдаемые области являются неупорядоченными. Гетероядерный многомерный ЯМР является исключительно мощным методом определения трехмерных структур белков в растворе, а также исследования их динамики. Последние достижения этого метода позволили сделать полное соотнесение пиков спектров магнитного резонанса с соответствующими атомами для нескольких полностью или частично развернутых белков (Eliezer, 2007; Wright & Dyson, 1999).
Спектры КД в ближнем ультрафиолете (250-350 нм) отражают симметричность окружения ароматических аминокислотных остатков, и соответственно, характеризуют третичную структуру белка (Woody, 1995). Отсутствие жесткой третичной структуры проявляется упрощенными спектрами с малой интенсивностью.
Слаборазвитую вторичную структуру можно выявить несколькими методами: КД в дальнем ультрафиолете (Woody, 1995), дисперсией оптического вращения (Chen et al., 2003), инфракрасной спектроскопией с Фурье-преобразованием (Uversky et al., 2000), рамановской оптической активностью и резонансной рамановской спектроскопией (Xu et al., 2005).
Для оценки, компактен белок или развернут, можно использовать гидродинамические параметры, измеренные с помощью гель-фильтрации, вискозиметрии, SAXS, малоуглового нейтронного рассеяния, седиментации, динамического и статического рассеяния света. Известно, что структурированные и развернутые конформации белков имеют свои характерные зависимости гидродинамического радиуса от молекулярной массы. В результате, неупорядоченные белки будут иметь больший гидродинамический радиус, чем упорядоченные белки той же массы, что проявится в увеличении кажущейся молекулярной массы (Uversky & Dunker, 2010).
Другим важным структурным параметром является степень глобулярности, которая отражает присутствие или отсутствие плотно упакованного ядра белковой молекулы. Такую информацию можно получить из анализа данных SAXS в координатах Кратки. Форма кривой рассеяния рентгеновских лучей в координатах Кратки имеет характерный максимум в случае нативных глобулярных белков и расплавленных глобул. Если же белок полностью развернут или имеет конформацию предрасплавленной глобулы, такой максимум отсутствует (Semisotnov et al., 1996).
Дополнительная информация о внутримолекулярной подвижности и компактности белка может быть получена анализом различных характеристик флуоресценции. К таким характеристикам относятся резонансный перенос энергии флуоресценции, форма спектра внутренней флуоресценции, анизотропия и затухание флуоресценции, доступность хромофорных групп для гасителей. Эти параметры дают важную информацию о конформационной динамике полипептида (Uversky & Dunker, 2010).
Косвенным следствием высокой подвижности неупорядоченных белков является их повышенная склонность к протеолитической деградации in vitro (Dunker etal., 2001).
Для выявления неупорядоченности белков можно также использовать иммунохимические методы. Например, антитела, полученные против Fr фрагмента протромбина, насыщенного ионами Са +, не взаимодействуют с апо-формой этого белка (Furie & Furie, 1979).
Внутреннюю неупорядоченность можно детектировать, анализируя конформационную стабильность белка. Например, присутствие или отсутствие кооперативного перехода на кривой калориметрического плавления определенного белка является простым и удобным признаком присутствия или отсутствия жесткой третичной структуры (Ptitsyn, 1995). Кроме того, было показано, что наклон кривой разворачивания под действием мочевины или гуанидингидрохлорида строго зависит от того, имеет ли данный белок жесткую третичную структуру (то есть, нативен), или он уже денатурирован и находится в состоянии расплавленной глобулы (Uversky, 2009). Наконец, следует отметить аномальную электрофоретическую подвижность внутренне неупорядоченных белков. Из-за своего необычного аминокислотного состава неупорядоченные белки связывают меньше додецилсульфата натрия по сравнению с «нормальными» белками. В результате, они обладают меньшей подвижностью при электрофорезе, и их кажущиеся молекулярные массы часто завышены в 1,2-1,8 раз по сравнению с расчетными (Тотра, 2002).
Достижения в развитии метода ЯМР позволяют исследовать неупорядоченные белки in vivo в их естественном окружении. Этот подход основан на том, что можно наблюдать за изотопно меченным белком в окружении немеченых веществ клетки (Serber et al., 2006).
Перспективными является подходы, ориентированные на исследование индивидуальных молекул неупорядоченных белков, такие как одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции (Mukhopadhyay et al., 2007) и одномолекулярная атомно-силовая микроскопия (Sandal et al., 2008).
В заключение следует отметить, что поскольку вывод о существовании внутренней неупорядоченности в данном белке, как правило, делается из отсутствия признаков, характерных для упорядоченных белков, по-прежнему часты случаи ошибочной идентификации неупорядоченных белков. Очевидно, что только с одновременным применением нескольких методов можно с уверенностью отнести белок к классу неупорядоченных.
Структура амилоидных фибрилл
Поскольку было обнаружено, что частично или полностью неупорядоченные белки составляют значительную долю в протеомах различных организмов, ясно, что эти белки выполняют важные биологические функции (Dyson & Wright, 2005). Более того, сайты посттрансляционных модификаций (ацетилирования, гидроксилирования, убиквитинилирования, метилирования, фосфорилирования и др.), а также сайты протеолитического процессинга белков часто связаны с областями внутренней неупорядоченности (Dunker & Obradovic, 2001).
Исследование корреляций между биоинформатическми предсказаниями неупорядоченности белков в базе данных Swiss-Prot и функциями этих белков выявило, что из 710 функций, описываемых ключевыми словами, 310 функций ассоциировано с упорядоченными белками, 238 функций приписано неупорядоченным белкам, остальные функции не имели четкой корреляции с предсказаниями упорядоченности и неупорядоченности (Xie et al., 2007).
Из экспериментальных данных известно, что многие неупорядоченные белки образуют упорядоченную структуру при связывании с физиологическими лигандами, например, протамины, гистоны, цитохром с, остеонектин, хроматогранины А и В, протимозин а и другие. Соответственно, основными функциями таких неструктурированных, внутренне неупорядоченных белков являются связывание с нуклеиновыми кислотами, связывание ионов металлов, связывание гема или взаимодействие с липидными мембранами (Uversky et al., 2000).
Некоторые важные функции неупорядоченных белков не связаны с сопряженными связыванием и сворачиванием, а напротив, зависят от подвижности, гибкости и пластичности полипептидной цепи. Так называемые «энтропийные функции цепи» осуществляются полностью за счет растянутой конформации случайного клубка, которая находится в постоянном движении при работе белка (Dunker et al., 2001). Примерами белков, содержащих такие участки, являются белки ионных каналов (Liebovitch et al., 1992), белки внутриклеточной подвижности (Seeger et al., 2012).
Накапливается все больше данных о важной роли неупорядоченных белков в сетях белок-белковых взаимодействий. Предполагается, что а-синуклеин, р53 и многие другие внутренне неупорядоченные белки, взаимодействующие с большим количеством партнеров, являются хабами (hub), то есть сетевыми узлами (Dunker et al., 2005). Некоторые белки-хабы оказались неупорядочены по всей длине, при этом они способны связывать множество партнеров. Другие содержат и упорядоченные, и неупорядоченные области. Для таких хабов большинство взаимодействий картировано в областях неупорядоченности. Надо отметить, что есть примеры полностью структурированных хабов, при этом их партнеры связываются своими неупорядоченными областями (Radivojac et al., 2006). Таким образом, неупорядоченность используется в белок-белковых взаимодействиях двумя способами: одна неупорядоченная область связывает много партнеров или много неупорядоченных областей связываются с одним партнером.
Среди белков-хабов можно выделить каркасные белки, которые связывают умеренное количество партнеров. Каркасные белки часто являются своеобразным скелетом функциональных комплексов, где они взаимодействуют с большинством своих партнеров одновременно. Каркасные белки играют объединяющую и организующую роль в таких функциональных комплексах, обеспечивая взаимную ориентацию компонентов. Посттрансляционные модификации каркасных белков могут играть важную роль в регуляции состава функциональных комплексов (Liu et al., 2006). Анализ нескольких известных каркасных белков, таких как аксин, супрессор рака молочной железы BRCA1 (Breast cancer gene 1), белок-2, ассоциированный с микротрубочками (МАР2), титин и другие, показал, что большие неупорядоченные области крайне важны для функционирования этих белков (Cortese et al., 2008).
Одной из наиболее важных функций неупорядоченных белков является их участие в передаче сигналов и регуляции (Iakoucheva et al., 2002). Это связано с тем, что неупорядоченные области могут связываться с партнерами одновременно с высокой специфичностью и низкой аффинностью, что делает регуляторные взаимодействия не только специфичными, но и легко обратимыми (Uversky & Dunker, 2010). Гибкость неупорядоченных белков позволяет им связываться с разными партнерами и участвовать во множестве различных регуляторных путей. Хорошим примером такого регуляторного белка является транскрипционный фактор р53, связывающийся с множеством партнеров и являющийся объединяющим звеном многих регуляторных путей.
Амилоидами называют нерастворимые белковые агрегаты, накапливающиеся при некоторых заболеваниях в организме человека и животных. Основным компонентом таких агрегатов являются амилоидные фибриллы, которые обладают рядом характерных свойств: вытянутая, неразветвленная форма, зеленое двойное лучепреломление при окраске специфичным красителем конго красным, связывание флуоресцентного красителя тиофлавина Т, характерная картина дифракции рентгеновских лучей вследствие наличия кросс-3-структуры (Nelson & Eisenberg, 2006; Westermark, 2008).
Участие YB-1 в эмбриональном развитии
Данные об участии белка YB-1 в развитии злокачественных опухолей можно разделить на две группы. Согласно первой группе данных, YB-1 может рассматриваться как онкобелок, который стимулирует клеточную пролиферацию, повышает множественную лекарственную устойчивость и способствует метастазированию. Другие исследования говорят, что в ряде случаев YB-1 может выступать как супрессор опухолей.
Известно, что количество мРНК и белка YB-1 часто бывает повышено в опухолях различного происхождения, в том числе и злокачественных (Bargou et al., 1997; Gimenez-Bonafe et al., 2004; Janz et al., 2002; Rubinstein et al., 2002; Saji et al., 2003; Schittek et al., 2007; Shibahara et al., 2001; Shibao et al., 1999; Xu et al, 2009; Yahata et al., 2002; Yasen et al, 2005). При этом появление YB-1 в ядрах клеток или его повышенное содержание в тканях, прилежащих к опухоли, являются признаками более агрессивных и запущенных опухолей (Gessner et al., 2004; Gimenez-Bonafe et ah, 2004; Janz et ah, 2002; Shibahara et ah, 2001; Xu et ah, 2009; Yasen et ah, 2005). В связи с этим предлагается рассматривать YB-1 как прогностический маркер в отношении агрессивности течения заболевания и устойчивости опухолей к химиотерапии, по крайней мере, в случае рака молочной железы (Bargou et al., 1997; Janz et al., 2002; Вайман и др., 2007). Однако не всегда удается обнаружить корреляцию между экспрессией YB-1 и клинико-патологическими признаками опухоли, такими как ее размер, способность к метастазированию и др. (Huang et al., 2005; Janz et al, 2002; Oda et al., 2003). Данные о роли YB-1 в злокачественных новообразованиях суммированы в обзоре (Елисеева и др., 2011).
Существенное значение в развитии опухолей, а также при поиске способов лечения раковых заболеваний имеет приобретение клетками опухоли устойчивости к лекарственным препаратам. Существуют данные об участии YB-1 в активации синтеза белков, обусловливающих множественную лекарственную устойчивость, таких как Р-гликопротеин (Ohga et al., 1996; Ohga et al„ 1998), белки LRP/MVP (Stein et al., 2005; Tanaka et al., 2000), MRP1 и BCRP (Oda et al., 2003; Stein et al., 2001; Вайман и др., 2006).
Имеющиеся на сегодняшний день многочисленные данные указывают на то, что YB-1 стимулирует пролиферацию клеток. Повышенное содержание YB-1 в клинических образцах или его ядерная локализация коррелируют с экспрессией маркеров пролиферации (Oda et al., 2003; Shibao et al., 1999). Подавление экспрессии YB-1 замедляет клеточное деление (Lu et al., 2005; Matsumoto et al., 2005; Uchiumi et al., 2006), а оверэкспрессия приводит гиперплазии (Bergmann et al., 2005). Раковые клетки многих типов при подавлении экспрессии YB-1 теряют способность к росту без контакта с подложкой и к формированию колоний в мягком агаре (Gao et al., 2009; Lee et al., 2008; Stratford et al, 2007).
Предложено несколько механизмов, согласно которым YB-1 мог бы влиять на пролиферацию клеток. Во-первых, YB-1 может быть вовлечен в активацию транскрипции генов, кодирующих белки, которые прямо задействованы в репликации ДНК: ДНК-топоизомераза Па (Shibao et al., 1999), ДНК-полимераза a (En-Nia et al., 2005). Во-вторых, YB-1 может активировать транскрипцию генов, продукты которых отвечают за прохождение клеточного цикла: циклины А и Bl (Jurchott et al., 2003), CDC6 (Cell division control protein 6) (Basaki et al., 2010).
Кроме стимуляции пролиферации YB-1 может защищать некоторые линии раковых клеток от апоптоза, подавляя функции белка р53 и активируя сигнальный путь PTEN/mTOR/STAT3 или репрессируя транскрипцию гена Fas-рецептора (Lee et al., 2008; Shiota et al., 2011).
В последние годы особое внимание уделяется исследованию роли белка YB-1 в развитии рака молочной железы. Было показано, что оверэкспрессия YB-1 является причиной злокачественного перерождения тканей молочной железы. Повышение количества YB-1 в клетке приводит к аномалиям митоза, связанным с ненормальным состоянием центросом - появлялись клетки с несколькими ядрами и неправильным набором хромосом (Bergmann et al., 2005; Daviesetal., 2011).
YB-1 не только принимает участие в злокачественном перерождении клеток, но и способствует процессу метастазирования (Astanehe et al., 2009; Evdokimova et al., 2009; Gao et al., 2009; Schittek et al., 2007; Гене и др., 2009). При подавлении экспрессии YB-1 в раковых клетках снижается их способность к миграции и инвазии, что может быть связано с его способностью активировать транскрипцию генов металлопротеиназ (Lovett et al., 2010; Mertens et al., 1998). Повышенное содержание YB-1 в цитоплазме эпителиальных клеток молочной железы MCF10AT, в которых активирован Ras-MAPK-сигнальный путь, приводит к тому, что эти клетки претерпевают эпителиально-мезенхимальный переход. Инъекция таких клеток в жировые подушечки молочной железы мыши приводила к образованию мелких опухолей с метастазами в различные органы, в то время как клетки с нормальным уровнем YB-1 формировали более крупные опухоли, но локализованные в месте инъекции (Evdokimova et al., 2009). Таким образом, в некоторых видах рака молочной железы сверхэкспрессия YB-1 стимулирует метастазирование опухоли, но одновременно и подавляет рост опухолей. Наряду с множеством данных, свидетельствующих об онкогенном действии YB-1, есть ряд работ, доказывающих, что в отдельных случаях этот белок, находясь в цитоплазме, может выступать в качестве антионкобелка. Так, при онкогенной трансформации эмбриональных куриных фибробластов, вызванной сверхэкспрессией онкобелков PI3K и Akt, количество YB-1 снижается, а дополнительный синтез YB-1 с плазмиды такой трансформации препятствует (Bader et al., 2003). Механизм заключается в том, что YB-1, фосфорилированный киназой Akt по Serl02, оказывается не способным предотвращать инициацию трансляции слабых матриц, кодирующих пролиферативные факторы (Bader & Vogt, 2008; Evdokimova et al., 2006).
Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия
Белок YB-1 может выполнять в клетке разнообразные функции и взаимодействовать с множеством партнеров. В связи с его большим значением в регуляции клеточных процессов неизбежно возникал вопрос, за счет каких структурных особенностей YB-1 может иметь столь широкий набор активностей. Несмотря на то, что большая часть исследований посвящена функциям YB-1, имеется несколько работ, посвященных его структуре. На основе гомологии аминокислотной последовательности было установлено, что YB-1 содержит высоко консервативный домен CSD. Лишь спустя значительное время была определена трехмерная структура CSD YB-1, которая оказалась близка к структуре бактериальных белков холодового шока. Было известно также, что YB-1 и его гомологи из X. leavis могут образовывать олигомеры за счет С-концевого домена. Однако точные трехмерные структуры N-концевого А/Р-домена и С-концевого домена оставались неопределенными. Было предположено, что эти домены могут не иметь фиксированной структуры. В настоящее время белки, полностью или частично не имеющие строго определенной структуры, выделяют в отдельный класс нативно неупорядоченных белков (Uversky & Dunker, 2010).
Полученные в данной работе биоинформатические и экспериментальные результаты указывают на то, что YB-1 является одним из таких нативно неупорядоченных белков. Данные дифференциальной сканирующей микрокалориметрии подтверждают наличие кооперативной третичной структуры только в CSD, при этом в остальной части белка по результатам биоинформатического анализа и спектроскопии КД регулярная вторичная структура отсутствует.
Одной из важных функций YB-1 является связывание и упаковка мРНК. Можно отметить, что многие РНК-связывающие белки в свободном виде в значительной степени неупорядочены (Тотра & Csermely, 2004). Примерами таких белков являются некоторые рибосомные белки и белки РНК-содержащих вирусов (Tokuriki et al., 2009; Venyaminov & Gogia, 1982). При взаимодействии с РНК в этих белках может происходить переход в упорядоченное состояние. В целом, приобретение неупорядоченными белками фиксированной структуры при связывании специфических лигандов достаточно распространенное явление, причем образуемая структура может зависеть от природы лиганда, как это было продемонстрировано для белка р53 (Uversky & Dunker, 2010). Возможно, что и белок YB-1 может приобретать определенную структуру при связывании с мРНК или одним из его многочисленных белковых партнеров.
С другой стороны, исследование структуры YB-1 методом спектроскопии КД показало, что значительную долю в белке составляет структура полипролиновой спирали второго типа (поли(Рго) II). Известно, что такая структура характерна для нативно неупорядоченных белков и что она принимает участие в межмолекулярном узнавании (Rath et al., 2005). Возможно, что сайты связывания белковых партнеров в молекуле YB-1 имеют конформацию поли(Рго) II. В этом случае при взаимодействии YB-1 с лигандами не потребуется значительного изменения конформации полипептидной цепи.
Таким образом, изучение конформации YB-1 или его фрагментов в комплексе с лигандами может дать интересную информацию о структуре белка и о его конформационных превращениях и позволит открыть новые способы специфической регуляции функций YB-1.
Известно, что компактность глобулярных белков обусловлена преимущественно гидрофобным связыванием неполярных аминокислотных остатков, формирующих гидрофобное ядро белковой глобулы. Нативно неупорядоченные белки характеризуются меньшим содержанием неполярных аминокислотных остатков, вследствие чего не имеют гидрофобного ядра и, как правило, обладают существенно меньшей компактностью по сравнению с глобулярными белками. Мы показали, что YB-1 по ряду признаков, в том числе по большому содержанию заряженных и гидрофильных аминокислотных остатков, можно отнести к нативно неупорядоченным белкам. Однако наши исследования показали высокую компактность YB-1, близкую к компактности глобулярных белков.
Возможно, что в образовании компактной структуры YB-1 значительную роль играет структура поли(Рго) П. Так, экспериментальные данные и расчеты по модели случайной непересекающейся цепи показывают, что наличие в белке участков со структурой поли(Рго) II может приводить к значительной компактизации белковой молекулы при наличии дополнительных взаимодействий между такими участками (Cortajarena et al., 2008). Можно предложить несколько различных типов таких взаимодействий.
Во-первых, давно было замечено, что CTD YB-1 содержит кластеры положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Эти кластеры могут взаимодействовать между собой за счет образования солевых мостиков. Стоит отметить, что среди положительно заряженных аминокислотных остатков преобладают остатки аргинина. Известно, что гуанидиновая группа аргинина способна эффективно образовывать водородные связи с отрицательно заряженными карбоксильными группами остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Таким образом, связи между аминокислотными остатками являются не только электростатическими, но и водородными. Поскольку эти заряженные аминокислотные остатки способны одновременно взаимодействовать более чем с одним партнером, могут образовываться сети ионно-водородных связей (Gowri Shankar et al., 2007). О существенной роли водородных связей, помимо электростатических, в компактизации YB-1 косвенно говорит тот факт, что белок в значительной мере сохраняет компактность при высокой ионной силе. Во-вторых, гуанидиновые группы остатков аргинина могут участвовать в стекинговых взаимодействиях с ароматическими группами (Flocco & Mowbray, 1994) в остатках фенилаланина и тирозина, составляющих более 7% от всех остатков в белке YB-1. Более того, несмотря на одноименный заряд, остатки аргинина могут взаимодействовать между собой, особенно при компенсации заряда путем образования мостиков из низкомолекулярных полианионов или карбоксильных групп остатков глутамата или аспартата (Neves et al., 2012).
В третьих, известно, что в присутствии ионов в растворе даже одноименно заряженные остатки могут образовывать связи. Важную роль при этом играют многозарядные низкомолекулярные ионы, например, ионы металлов или многоосновных кислот (Butler et al., 2003). Очевидно, что в условиях in vivo белок всегда окружен различными ионами, в том числе многозарядными. Не исключено, что такие ионы остаются связанными с YB-1 после процедур очистки и вносят вклад в наблюдаемую нами компактность белка, участвуя в формировании внутримолекулярных взаимодействий.
Похожие диссертации на Структурная характеристика белка YB-1
