Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Действие 1,2-пропандиола на организм и пути его утилизации Ch vivo 9
2. Эритроцит как метаболическая система. Критерии структурно-функциональной полноценности 18
3. Гипотермическое хранение эритроцитов после размораживания. Способы увеличения сроков хранения клеток при 4С . 27
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 39
4. Материалы и методы 39
5. Действие криоконсервации (-196С) и гипотермического хранения на биохимические показатели эритроцитов 49
6. Состояние транспорта одновалентных катионов в эритроцитах после низкотемпературной консервации подзащитой 1,2-пропандиола и глицерина 68
6.1. Влияние замораживания-отогрева на скорость транспорта /Va и /U в эритроцитах 68
6.2. Особенности транспорта катионов в эритроцитах после криоконсервации и гипотермического хранения 73
7. Состояние мембраны эритроцитов после криоконсервации и гипотермического хранения 80
8. Изучение возможности длительного гипотермического хранения клеток после криоконсервации под защитой 1,2-пропандиола и глицерина 95
8.1. Содержание органических фосфатов в эритроцитах при гипотермическом хранении клеток в криопротекторных средах 95
8.2. Изменение формы клеток после криоконсервации и в процессе гипотермического хранения . 102
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 129
ВЫВОДЫ 135
ЛИТЕРАТУРА 137
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 159
- Действие 1,2-пропандиола на организм и пути его утилизации Ch vivo
- Эритроцит как метаболическая система. Критерии структурно-функциональной полноценности
- Действие криоконсервации (-196С) и гипотермического хранения на биохимические показатели эритроцитов
Введение к работе
Длительное хранение тканей и клеток при низких и сверхнизких (-19бС) температурах стало возможным благодаря открытию криопротекторов - веществ различной природы и происхождения, позволяющих предотвращать гибель клеток от низкотемпературной деструкции [ЗДІЗ]. В настоящее время в практике длительного хранения клеток крови при сверхнизких температурах в нашей стране и за рубежом чаще всего используют.защитные среды, содержащие глицерин [2,178] . Однако, его применение в более широких масштабах ограничено в связи с необходимостью удаления этого криопротектора из деконсервированных клеток, что ведет к дополнительным их повреждениям [2,178] . Эти обстоятельства предопределили интерес к свойствам 1,2-пропандиолау гликоля, молекула которого содержит на одну гидроксильную группу меньше, чем глицерин. Криопротекторные свойства 1,2-пропандиола (1,2-ПД) в отношении эритроцитов были испытаны [из], однако, это соединение не получило распространения на практике из-за недостаточной изученности особенностей взаимодействия криопротектора с клетками Г22]. Дальнейшие испытания эффективности 1,2-лропандиола для целей криобиологии показали, что данный криопротектор может быть с успехом использован для криоконсервации клеток крови [22, 69,70]. Исследования, посвященные выяснению взаимосвязи между строением криопротекторов и их криозащитным и физиологическим действием, разрозненны и малочисленны [ 7І. Поэтому сравнитель- ное изучение двух близких проникающих веществ - 1,2-пропандиола и глицерина (пропантриола) [ИЗ J может приблизить нас к пониманию механизмов криоповреждения и криозащиты клеток.
Необходимо отметить, что несмотря на большое количество работ, посвященных криозащитной эффективности различных соединений в отношении эритроцитов, имеется очень ограниченное число сообщений об их влиянии на метаболизм красных клеток крови [72, 135]. Тем не менее очевидно, что именно метаболическое состояние деконсервированных клеток определяет их физиологическую полноценность в случае клинического использования [2,178]. Удобным методическим приемом для изучения структурно-функциональных свойств эритроцитов, подвергнутых низкотемпературной консервации под защитой криопротекторов, является их анализ в гипотермичес-ких условиях (0 - (+4С)) после отогрева и удаления криопротекторов. Этот подход можно считать целесообразным, т.к. он моделирует практические процедуры, при которых размороженные клетки переливают в разные сроки после их деконсервации [l,I6,I80] . Хранение при 4С позволяет также провести анализ реализации латентных повреждений мембраны [148], возникающих в процессе криоконсервации, и вскрыть некоторые закономерности влияния криопротекторов и факторов среды на биохимические показатели клеток.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось изучение структурно-функциональных свойств эритроцитов, замороженных под защитой 1,2-пропандиола и глицерина.
В конкретные задачи исследования входило:
I. Изучить влияние замораживания-отогрева под.защитой 1,2-ПД и глицерина на внутриклеточное содержание АТФ,2,3-ДФГ, катионов Л/а+ и К + в эритроцитах человека на протяжении 120 - б - часов гипотермического хранения в ресуспендирующих средах различного состава.
Разработать способ количественного определения 1,2-ПД в эритроцитарной взвеси и определить возможности длительного хранения размороженных клеток в гипотершческих условиях.
Выяснить состояние транспорта одновалентных катионов ( /Уя+» К + ) в эритроцитах после низкотемпературной консервации под защитой 1,2-ПД и глицерина и последующего гипотермического хранения.
Оценить барьерные и структурные свойства мембран эритроцитов в присутствии криопротекторов после низкотемпературного воздействия. изучить взаимосвязь между динамикой биохимических показателей эритроцитов и формой клеток после низкотемпературной консервации под защитой 1,2-ПД и глицерина в процессе гипотермического хранения.
Проведенный комплекс биохимических исследований позволил оценить структурно-функциональное состояние эритроцитов, замороженных под защитой 1,2-ПД и глицерина. На основании анализа динамики содержания катионов и фосфорорганических соединений в эритроцитах после низкотемпературной консервации под защитой изученных криопротекторов установлено, что метод криоконсерва-ции эритроцитов под защитой 1,2-ПД можно рассматривать как альтернативный традиционному - под защитой глицерина.
На основании разработанного наш способа количественного определения 1,2-пропандиола в эритровзвесм определены концентрации 1,2-ПД, остающиеся после удаления криопротектора.
С помощью метода флуоресцентного зондирования впервые показано, что применение 1,2-ПД и глицерина позволяет практически полностью избежать регистрируемых структурных перестроек мембранных белков, индуцируемых низкими температурами. Установлено, что осмотические факторы на этапе удаления криопротекторов являются определяющими в процессе повреждения мембранных структур, что ведет к снижению микровязкости фосфолипидного бислоя эритроцитарных мембран и дезагрегации их белковых комплексов.
Впервые показано, что длительная экспозиция эритроцитов в составе изученных криопротекторных сред при 4С после низкотемпературной консервации приводит для обоих криопротекторов к различным структурно-функциональным сдвигам. Отмечено, что хранение клеток в среде 1,2-ПД, по сравнению с глицерином, сопровождается сохранением более высокого уровня АТФ и 2,3-ДФГ в клетках, более выраженным повышением проницаемости мембран эритроцитов для катионов и активацией No., К - насоса при 37С после удаления криопротекторов. 1,2-ПД индуцирует образование стоматоцитов и книзоцитов, глицерин-эхиноцитов и акантоцитов.
Впервые установлено, что пребывание размороженных клеток в составе криопротекторных сред позволяет значительно, с 1-2 до 10-14 суток, увеличить сроки хранения деконсервированных эритроцитов в гипотермических условиях.
Установлено, что в основе консервирующего действия криопротекторных сред при 4С лежат механизмы ингибирования метаболических процессов в эритроцитах, как показано для гексокиназы.
Практическая ценность работы заключается в том, что проведенные исследования впервые дают биохимическое обоснование целесообразности применения метода криоконсервации эритроцитов под защитой 1,2-пропандиола. На основнии полученных результатов выявлены преимущества использования в качестве ресуспенди- рующей среды для клеток, замороженных-отогретых под защитой 1,2-ПД и глицерина, сахарозосодержащую среду ЦОЛИПК 8в.
Выявленная взаимосвязь между формой клеток при гипотермичес-ком хранении, состоянием их транспортных систем, динамикой биохимических показателей и видом криопротектора имеет прогностическое значение при возможной оценке и выборе проникающих защитных агентов.
Установленный факт возможности значительного увеличения продолжительности хранения деконсервированных клеток при 4-С в присутствии 1,2-ПД и глицерина открывает дополнительные перспективы для. оптимального использования замороженной крови в клинических условиях.
Данные диссертации включены в материалы, направленные в Фармкоштет МЗ СССР с целью разрешения клинического изучения криопротектора 1,2-пропандиола.
Результаты исследований, касающиеся увеличения сроков хранения размороженных эритроцитов при 4С используются в работе ЦНИИГПК МЗ СССР.
На защиту выносятся следующие положения:
Использование 1,2-пропандиола в качестве криопротектора позволяет эффективно криоконсервировать эритроциты и длительно хранить их в гипотермических условиях после отогрева.
Проникающие криопротекторы глицерин и 1,2-ПД, применяемые в практике низкотемпературной консервации, модифицируют структурно-функциональное состояние размороженных эритроцитов путем ингибирования процессов обмена и изменения структурных и барьерных свойств их мембраны.
Действие 1,2-пропандиола на организм и пути его утилизации Ch vivo
В настоящее время глицерин, в отличие от 1,2-пропандиола, считается хорошо изученным соединением как с точки зрения его метаболизма 1ь vivo [зі,33], так и в качестве криопротектора [3,45].
Использование 1,2-пропандиола для целей криозащиты клеток диктует необходимость детального анализа особенностей утилизации этого гликоля в организме, а также изучения его влияния на функциональное состояние организма в целом. В отношении 1,2-ПД известно, что это соединение рассматривается как нечужеродное для организма животных [4-2], поскольку гликоль обнаружен в печени [153,155] , мозгу крупного рогатого скота и яйцах морского ежа [lI2], в мышцах кролика [ібі] . Окисление 1,2-ПД до лактага осуществляется, в основном, двумя путями и зависит от того, в свободной или фосфорилированной форме находится локализованный в клетке гликоль [154].
Хотя реализация указанных выше путей метаболизма І,2 ПД в настоящее время доказана, однако не исключена возможность утилизации 1,2-ПД в пропиональдегид, одно- и двухуглеродные соединения или их производные [152]. Уровень 1,2-пропандиолфосфата в печени крыс, определенный изотопным разведением, составляет 1-2$ общего кислоторастворимого фосфора печени [153].
1,2-ПД или его фосфорилированные производные являются возможными промежуточными соединениями в метаболизме ацетона [154]. Конечными продуктами окисления 1,2-ПД может быть формиат, ацетат или 3-х углеродный предшественник (пируват, лактат) цикла трикарбоновых кислот. Участие 1,2-ПД в метаболизме ацетона было доказано с помощью радиоизотопного метода на клетках печени. В частности выяснилось, что радиоактивная метка С-метильных групп ацетона инкорпорировалась в р -углерод-серина, метильные группы холина и метионина [154]. Более того, оказалось, что экстрагированная из гликогена печени крыс глюкоза интенсивно метилась в положении 3 и 4-го атомов углерода, а часть С-аце-тона при этом превращалась в лактат.
Эритроцит как метаболическая система. Критерии структурно-функциональной полноценности
Общепринятыми критериями структурно-функциональной полноценности эритроцитов LtivUzo является содержание АТФ и 2,3-ди-фосфоглицерата (2,3-ДФГ) - промежуточных продуктов и основных фосфорорганических соединений в метаболизме красных клеток [2, 16,106,178]. Поскольку процесс низкотемпературной консервации и последующего гипотермического хранения так или иначе модифицирует метаболическое состояние эритроцитов [3,16,178], задачу по удлинению срока хранения деконсервированных клеток в функционально полноценном состоянии можно рассматривать как коррекцию метаболизма эритроцитов таким образом, чтобы уровень АТФ и 2,3-ДФГ оставался высоким на протяжении более длительного времени [18,180] .
Известно [71,136,139], что зрелый эритроцит представляет собой клетку, лишенную ядра и, поэтому, не способную к синтезу белка и восстановлению утраченных структур. Отсутствие систем окислительного фосфорилирования и синтеза длинноцепочечных жирных кислот позволяет рассматривать эритроцит как узкоспециализированную клетку, главная функция которой состоит в транспорте газов [71,106,178] .
Основным энергетическим процессом в эритроцитах является процесс гликолиза (рис.1), на долю которого приходится 89$ мета-болизируемой глюкозы и около 75/ энергии, аккумулированной в ви - 19 де АТФ [7І,ІЗб]. Несмотря на то, что пентозофосфатный (гексозо-моннофосфатный) путь занимает малую часть метаболизма глюкозы (рисі), он играет большую роль в предохранении клетки от окислительного стресса: в частности, индуцирование его нарушений внешними воздействиями вызывает снижение выживаемости и устойчивости к гемолитическим факторам [71]. Две основные функции лентозо-фосфатного шунта в эритроцитах состоят в восстановлении НАДФ в НАДФН и в образовании ограниченных количеств 5-фосфорибозилпиро-фосфата [85]. НАДФН используется глутатионредукшазой для поддержания глутатиона в восстановленном состоянии (рис.1), кроме этого НАДФН необходим для нормального функционирования каталазы [85] . ФРПФ является предшественником для синтеза адениновых нуклеотидов в эритроцитах [170]. Существует и третья функция пентозофосфатного пути - снабжение гликолиза субстратами [85]. Эта функция эксплуатируется исследователями наиболее часто для восстановления пула 2,3-ДФГ в эритроцитах, истощенного при гипо-тершческом хранении [ 139,170].
Действие криоконсервации (-196С) и гипотермического хранения на биохимические показатели эритроцитов
В настоящее время принято считать, что потеря клетками и поступление в них Мь после низкотемпературной консервации является одним из существенных критериев наличия скрытых повреждений плазматической мембраны [l9l]. Как видно из рисунка 2,. сразу же после размораживания и удаления криопротекторов выход К+ из эритроцитов, суспендированных в среде 8в, существенно меньше, чем при суспендировании их в среде 86. Эта закономерность сохраняется и при дальнейших наблюдениях, т.е. через 36 и 120 ч хранение при 4С. В случае применения среды 86 можно отметить, что сразу после деконсервации клеток внутриклеточное содержание К+ при замораживании под защитой 1,2-ПД достоверно выше (Р 0,05), чем при замораживании с глицерином. К 36 ч хранения эта разница становится недостоверной (Р? 0,05), а к 120 ч хранения несколько лучший результат получен при анализе образцов крови, криоконсервированных под защитой глицерина, хотя наблюдаемая разница носит характер тенденции.
Подобную картину наблюдали и при изучении поступления ЛЛ + в клетки. Из рис.3 видно, что проницаемость эритроцитов, замороженных с глицерином, для #А+ в те же сроки хранения была гораздо выше в том случае, когда деконсервированные клетки суспендировали в среде 86. При перенесении клеток в среду 8в содержание /УА+ В клетках, консервированных с глицерином и 1,2-ПД, было
