Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Краткая характеристика кадмия 10
1.2. Современные представления о влиянии кадмия на некоторые физиологические системы организма 11
1.3. Механизмы токсичности кадмия 18
1.4. Влияние кадмия на систему крови 23
1.4.1. Морфофункциональная характеристика эритроцитов 23
1.4.2. Воздействие кадмия на морфофункциональные характеристики эритроцитов 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Характеристика исследуемого материала 38
2.2. Методика проведения эксперимента в условиях in vitro 38
2.3. Методика проведения эксперимента в условиях in vivo 38
2.4. Методы оценки морфологии эритроцитов 40
2.5. Методы оценки функциональных свойств эритроцитов 43
2.6. Метод определения кадмия в крови 45
2.7. Методы статистической обработки результатов 46
Глава 3. Разработка новых методических подходов оценки морфо-функционального состояния эритроцитов периферической крови методом прижизненной компьютерной фазометрии 47
3.1. Оптимизация метода компьютерной фазовой морфометрии 48
3.2. Характеристика прижизненных фазово-интерференционных портретов эритроцитов периферической крови человека и животных 51
Глава 4. Изучение влияния ионов кадмия на морфофункциональные характеристики эритроцитов периферической крови в условиях in vitro 57
4.1. Характеристика изменения морфофункциональных показателей эритроцитов периферической крови крыс под влиянием различных концентраций ионов кадмия 57
4.2. Характеристика изменения морфофункциональных показателей эритроцитов периферической крови практически здоровых доноров под влиянием различных концентраций ионов кадмия 62
Глава 5. Изучение влияния ионов кадмия на морфофункциональные характеристики эритроцитов периферической крови крыс в условиях in vivo 66
Глава 6. Изучение влияния ионов кадмия на морфофункциональные характеристики эритроцитов периферической крови человека в условиях in vivo 82
6.1. Характеристика изменений морфофункциональных показателей эритроцитов периферической крови человека в условиях хронической экзогенной интоксикации ионами кадмия 83
6.2. Характеристика изменений морфофункциональных показателей эритроцитов периферической крови человека в условиях хронической эндогенной интоксикации 88
Заключение 94
Выводы 112
Список литературы 114
- Современные представления о влиянии кадмия на некоторые физиологические системы организма
- Методы оценки морфологии эритроцитов
- Характеристика прижизненных фазово-интерференционных портретов эритроцитов периферической крови человека и животных
- Характеристика изменения морфофункциональных показателей эритроцитов периферической крови крыс под влиянием различных концентраций ионов кадмия
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
В настоящее время одним из наиболее грозных факторов нарушения экологического равновесия является постоянное повышение содержания тяжелых металлов в биосфере. Они поступают в окружающую среду при сжигании горючих ископаемых (угля и нефти), в составе выхлопных газов автотранспорта, в результате деятельности металлургических производств, а также из-за широкого применения ядохимикатов и удобрений [9, 17, 21, 30, 52]. Токсическое действие различных соединений тяжелых металлов преимущественно обусловлено взаимодействием с белками организма, поэтому их часто называют белковыми ядами [21, 31]. Одним из таких металлов является кадмий.
Металлический кадмий и его соединения широко применяются для производства пигментов, нанесения защитных покрытий, в качестве стабилизатора пластмасс (особенно ПВХ), при изготовлении аккумуляторов и сплавов [9, 21, 52]. В то же время он обладает чрезвычайно высокими токсичными свойствами, вызывая поражения различных органов и физиологических систем. Сегодня известно его повреждающее действие на костную (заболевание "итай-итай"), легочную, эндокринную, репродуктивную, сердечно-сосудистую системы и на кровь [9, 11, 19, 21, 36, 47]. Кроме того, установлено, что кадмий обладает онкогенными и мутагенными свойствами [8, 9, 82, 112] . Однако эти сведения весьма противоречивы. Не до конца изучен механизм действия кадмия; нет критериев, позволяющих оценивать степень его токсичности; не установлен минимальный порог чувствительности к Cd2+.
Особого внимания заслуживают исследования влияния ионов кадмия на форменные элементы крови, из которых наибольший интерес представляют эритроциты [28, 39, 45, 47, 76, 98, 116].
Эритроциты являются самой многочисленной популяцией клеток в системе крови, определяющих структуру кровотока. Их морфофункциональные изменения сопровождаются нарушением текучести крови, что сказывается на кровоснабжении различных органов и тканей [40, 42]. В этой связи проблема влияния кадмия на кровь приобретает весьма актуальное значение.
Эритроцит — универсальная модель для изучения процессов, происходящих на клеточной мембране под действием самых различных агентов. Детальное исследование изменений морфофункциональных показателей эритроцитов под влиянием различных химических раздражителей, с которыми человек сталкивается в процессе естественных взаимоотношений с природой, позволяет полнее установить возможные последствия и определить наиболее эффективные пути их коррекции в условиях действия эколого-химических факторов окружающей среды. Поэтому исследование влияния кадмия на морфофункциональные свойства эритроцитов представляет особый интерес.
Анализ современных тенденций развития науки показывает, что на первый план выходят новейшие компьютерные технологии, которые обладают высокой точностью, чувствительностью, оперативностью и информативностью, позволяют объективизировать получаемую научную информацию, выявлять и оценивать новые аспекты влияния различных факторов на морфофункциональные показатели изучаемых цитообъектов [2, 26].
Достаточно перспективной в этом отношении является компьютерная фазовая морфометрия, основанная на комплексном оптико-геометрическом подходе к прижизненному анализу морфофункциональных характеристик форменных элементов периферической крови [1,5].
Все вышеизложенное определило направление выбранного исследования и методические подходы к реализации поставленных научных задач.
Целью настоящей работы явились изучение прижизненного морфофункционального состояния эритроцитов при кадмиевой интоксикации и разработка комплекса критериев для оценки токсического влияния ионов кадмия на красные клетки периферической крови человека и животных.
«
Задачи исследования.
Для выполнения поставленной цели нами были поставлены следующие задачи:
1. Оценить особенности прижизненного морфофункционального состояния
эритроцитов периферической крови человека и животных (крыс) методом
# компьютерной фазовой морфометрии;
Изучить влияние различных концентраций ионов кадмия на морфофункциональные показатели эритроцитов крови крыс и человека в исследованиях in vitro;
Выявить особенности изменений морфофункциональных показателей эритроцитов крови крыс под действием различных концентраций кадмия в исследованиях in vivo;
Провести сравнительный анализ изменений морфофункциональных показателей эритроцитов в условиях развития токсической анемии различного генеза (на моделях кадмиевой и уремической интоксикации);
Выявить наиболее информативные критерии для объективной оценки морфофункциональных нарушений эритроцитов в условиях кадмиевой интоксикации с использованием метода прижизненной компьютерной фазометриии.
Научная новизна работы.
* Впервые исследовано влияние ионов кадмия на морфофункциональные
показатели эритроцитов методом прижизненной компьютерной фазометрии.
Приведено научное обоснование некоторых аспектов воздействия ионов кадмия на клетки периферической крови.
Предложен комплекс информативных критериев для оценки токсического влияния ионов кадмия на морфофункциональные показатели эритроцитов периферической крови человека и животных.
Выделены и охарактеризованы три периода ответной реакции организма крыс в условиях длительной хронической интоксикации препаратом хлорида кадмия: «период накопления», «латентный период» и «период адаптации».
Полученные результаты расширяют существующие представления об общих механизмах действия кадмия с учетом клеточного и субклеточного уровней реализации токсических эффектов, позволяют оценить роль компенсаторно-приспособительных возможностей живого организма в условиях прогрессирующей интоксикации.
Практическое значение работы.
Проведена оптимизация метода прижизненной фазовой морфометрии клеток периферической крови и апробация его на практике для проведения цитодиагностики развития токсических состояний, а также при оценке эффективности и адекватности проводимых лечебных мероприятий.
Результаты исследования вошли в учебное пособие «Применение эпрекса (эпоэтин-альфа) при анемии у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности».
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях семинара академгруппы при академике В.Н.Шабалине (совместно с кафедрой биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова) «Фазометрия клеток переферической крови» (1999 — 2002), XVIII и XX научно-практических конференциях «Морфометрия в диагностике болезней» (Москва, Россия, 2000, 2002), IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, Россия, 2002), всероссийской конференции «Нефрология и диализ» (Санкт-Петербург, Россия, 2003).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ и 2 статьи находятся в печати.
Объем и структура диссертации.
Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 рисунками и 14 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, четырех глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждения, общего заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 54 отечественных и 134 зарубежных источника.
Современные представления о влиянии кадмия на некоторые физиологические системы организма
В организме человека среднего возраста содержится около 50 мг кадмия, 1/3 - в почках, остальное количество в печени, лёгких и поджелудочной железе. Содержание кадмия в организме человека зависит от его возраста. В организме новорожденых кадмий отсутствует и появляется к 10 месяцам жизни. В возрасте от 10 до 30 лет оно равно 30 мг, в 30 - 50 лет -45 мг, от 50 до 60 лет - свыше 55 мг [9, 19].
Кадмий не является необходимым элементом для млекопитающих. Этот металл обладает онкогенными и мутагенными свойствами [8, 82, 112]. Большие дозы кадмия могут оказывать эмбриотоксическое [32, 70], гонадотоксическое действие, а также влиять на репродуктивную функцию [25, 31]. Обладая кумулятивными свойствами, кадмий способен при накоплении в значительном количестве давать отдаленный эффект [36, 136]. В организм человека из внешней среды Cd2+ попадает в основном через желудочно-кишечный тракт и органы дыхания. Желудочно-кишечная абсорбция кадмия низка: для человека она составляет 3 - 8%. На неё влияют уровень потребления цинка и растворимость солей кадмия [19]. Большинство промышленных отравлений рабочих обусловлены поступлением соединений кадмия из лёгких в кровь. После вдыхания металлической пыли или аэрозоля кадмий быстро и полностью абсорбируется лёгкими. Соли кадмия в зависимости от растворимости абсорбируются из легких на 10 - 40%. Малорастворимые соли, такие как CdS, остаются в лёгких и вызывают местные воспаления и язвы [9,52]. Поглощение кадмия через кожу незначительно [19]. При попадании в кровь кадмий оседает большей частью в эритроцитах, содержание его в плазме незначительно [3]. Присоединяясь к плазменным ЧН белкам, особенно а-глобулинам, Cd2+ легко попадает в другие ткани. Из крови кадмий переносится в основном в печень и почки [21, 75]. Путь поступления кадмия в организм играет существенную роль при его распределении в органах и выведении из организма. При внутривенных инъекциях наибольшая кумуляция Cd2+ отмечается в печени. При пероральном - в желудочно-кишечном тракте (прежде всего в двенадцатиперстной кишке) [3]. Распределение кадмия в печени, почках, селезёнке и других органах через час мало отличается от распределения через 28 дней [36, 137]. Независимо от способа введения кадмий проникает через плаценту беременных крыс и хомяков. Это подтверждается большим количеством его в печени новорожденных по сравнению с материнскими особями (в 2,5 раза) [70, 174]. Задержка кадмия наблюдается во всех тканях у животных, в наибольшем количестве - в почках, печени, органах размножения и лёгких. Основным путем выведения кадмия из организма является желудочно-кишечный тракт. Процесс очищения организма от кадмия характеризуется низкой скоростью с эффективным периодом полувыведения 140±20 суток [3]. У млекопитающих экскреция кадмия осуществляется медленно, в основном с фекалиями, но отмечают и незначительное его выделение почками. Выделение кадмия заметно возрастает при обработке различными хелатирующими агентами. Хелатотерапия при отравлениях кадмием не даёт заметных улучшений в тех случаях, если не применяется сразу же (т 2 часов) после экспозиции [9, 19, 74]. При концентрациях ниже токсичной кадмий накапливается в тканях организмов. Постоянное накопление кадмия объясняется непрерывным образованием кадмиевых металлотионинов - белковых тиопроизводных кадмия, причем интенсивность накопления зависит от дозы воздействия этого металла. Этот белок почти отсутствует у животных, не подвергавшихся воздействию кадмия, а его концентрация растет по мере увеличения времени воздействия. Связывание кадмия с белком объясняет также и довольно высокую сопротивляемость хроническому воздействию кадмия по сравнению с острой токсичностью [21, 36, 155, 161]. Наиболее чувствительным и поражаемым органом при действии кадмия являются почки. При концентрации кадмия в почках, превышающей 200 млн 1, отсутствует достаточное количество металлотионинов для его связывания. Избыточный кадмий вступает в конкуренцию с цинком, тормозя действие цинкосодержащих ферментов, и нарушает нормальное функционирование почек. В результате возникает протеинурия (или альбуминурия) - повышенное выделение белка с мочой [9, 36, 71]. В печени кадмий блокирует ферментные системы, содержащие сульфгидрильные группы. Однако тяжелые поражения печени редко наблюдаются при хроническом воздействии дозы кадмия. В то же время в экспериментах с животными показано, что действие кадмия приводит к гепатиту и циррозу печени [56, 137, 111, 155]. Постоянное вдыхание кадмия приводит к эмфиземе лёгких. Вследствие расширения лёгких и возникающем при этом давлении на правую сторону сердца эмфизема лёгких имеет тяжелые последствия [9,19].
Эксперименты с животными указывают на то, что имеется связь между пероральным проникновением кадмия и появлением кардиоваскулярных болезней (нарушений малого круга кровообращения) [11, 31]. У крыс после употребления в течение 5-20 месяцев воды с концентрацией кадмия 10 — 20 млн-1 повышается кровяное давление и одновременно снижается частота сердечных сокращений, причём интенсивность этих явлений зависит от дозы кадмия [11].
Проявления острой интоксикации кадмием и его соединениями сходны и характеризуются снижением двигательной активности животных, нарушением терморегуляции, уменьшением массы тела. У погибших животных отмечалось вздутие желудка и кишечника, полнокровие сосудов внутренних органов. При гистологическом исследовании во внутренних органах наблюдались нарушения кровообращения (полнокровие сосудов), дистрофические изменения в печени, почках, сердце, десквамация эпителия, местами некрозы слизистой оболочки желудка и кишечника, дистрофические и некротические изменения в яичке [9, 21, 36, 155, 174].
Кадмий и его соединения обладают выраженными кумулятивными свойствами и относятся к ядам, воздействующим на многие системы организма. К основным симптомам хронической интоксикации кадмием можно отнести: кайму на зубах, аносмию, гипохромную анемию, ускоренную СОЭ, нарушение обмена кальция и изменения содержания SH-групп. При выраженных формах интоксикации развиваются явления пневмосклероза, изменения в структуре костной ткани, заболевания печени и почек, неврастенический синдром [9, 19, 36, 137, 174].
Методы оценки морфологии эритроцитов
Современный уровень развития науки подразумевает создание и использование новых технологий, призванных объективизировать получаемые результаты, повысить точность измерений и обеспечить комплексный подход к решению поставленных задач. При этом последовательное изучение одних и тех же биологических объектов с помощью разнообразных методов исследования дает возможность получать и сопоставлять качественно различную информацию о состоянии биообъектов, позволяет выявить не только наличие возможных структурных нарушений, но и изменение их функциональной активности.
Технический прогресс, связанный с совершенствованием компьютерной техники, явился основой для создания автоматизированных клеточных анализаторов, гарантирующих новый уровень экспериментальных и клинических исследований [1, 26]. Однако, основными объектами изучения, по-прежнему, остаются фиксированные и окрашенные цитологические материалы. Более прогрессивным в этом отношении можно считать метод фазового интерференционного контраста, позволяющий оперативно проводить прижизненный многопараметрический анализ различных цитообъектов [5, 49, 50].
В связи с этим, по-нашему мнению, применение прижизненной компьютерной фазометрии (КФМ) наряду с традиционными биологически обоснованными методами исследования может иметь важное значение в плане получения новой объективной научной информации и выявления универсальных критериев оценки особенностей клеточного реагирования на действие повреждающих токсических факторов.
На первом этапе нашего исследования для анализа морфофункционального состояния эритроцитов был использован алгоритм компьютерной фазометрии клеток, предложенный авторами метода [5]. Данный алгоритм предполагает автоматическое определение комплекса заданных параметров и статистическую обработку данных (Рис.3.1.).
Однако решение поставленных научных задач потребовало разработки качественно новых подходов к подготовке исследуемых образцов, выбору специальных критериев оценки цитообъектов и интерпретации полученных данных.
Поскольку работа проводилась на живых функционирующих эритроцитах, немаловажным условием успешного проведения экспериментов было обеспечение оптимальной среды для достаточно длительного сохранения формы клеток. Результатом предварительных исследований явилось создание нового рабочего раствора, представляющего собой смесь 6% гидроксиэтилированного крахмала (HES 200/0.5, Serum-Werk Bernburg AG, Германия) с плазмой крови в соотношении 20 : 1. Кроме того, в пакет оригинальных программ для анализа морфофункционального статуса клеток также были внесены существенные коррективы.
Визуализация четкого оконтуривания границ эритроцита позволила получить более точную оценку оптико-геометрических показателей каждой клетки: фазовых диаметра, периметра, высоты, площади и объема. Введение в комплекс анализируемых параметров величины площади просветленной части (пэллора) эритроцита позволило нам получить новую информацию о стереоструктурных особенностях этого типа клеток (Рис.3.2).
На уровне популяционного анализа эритроцитов нами реализована возможность количественной оценки клеточных групп, различных по величине их максимального диаметра.
Поскольку известно, что зрелые эритроциты, циркулирующие в кровеносном русле, относятся к группе «нормоцитов», молодые клеточные формы обладают большим диаметром, а старые - меньшим, полученные данные позволяют косвенно судить о возрастной структуре популяции и в определенной степени оценивать состояние эритропоэза.
Таким образом, итогом проведенной нами работы явилась оптимизация метода прижизненной компьютерной фазометрии, повышающая эффективность анализа результатов исследования и на качественно новом уровне характеризующая морфофункциональные показатели как интактных клеток, так и подвергшихся воздействию токсических агентов.
Характеристика прижизненных фазово-интерференционных портретов эритроцитов периферической крови человека и животных.
Ретроспективный анализ данных литературы показал, что сведения о результатах исследований эритроцитов крови человека и лабораторных животных автоматизированными методами с помощью фазовой лазерной интерференции носят неоднозначный характер [42, 72, 123]. В связи с этим следующий этап настоящей работы был посвящен накоплению оптимального объема выборок клеточных образцов и количественному описанию морфофункциональных особенностей живых функционирующих эритроцитов периферической крови человека и крыс.
На основе полученной базы данных было показано, что фазово-интерференционный образ подавляющего большинства интактных клеток имеет классическую форму двояковогнутого диска (Рис. 3.3.). Топограмма эритроцита в псевдоцвете, его трехмерное изображение и оптический профиль, взаимно дополняя друг друга, помогают воссоздать точное компьютерное представление о рельефе и объемных характеристиках клетки.
Характеристика прижизненных фазово-интерференционных портретов эритроцитов периферической крови человека и животных
В таблице 5.2. суммированы данные анализа морфофункциональных показателей эритроцитов периферической крови в экспериментальных группах животных. Не смотря на то, что все животные содержались в одинаковых условиях на стандартном рационе вивария в контрольных группах 1, 2 и 3 месяцев с течением времени заметно снижается диаметр, периметр и площадь клеток, увеличивается их высота и объем. Если принять за 100% показатели эритроцитов 1-го месяца, то средние значения диаметра эритроцитов в контроле 2-го и 3-го месяцев составляют 92,5 и 88,1%, соответственно; периметра 96,3 и 92,6%; высоты 127,9 и 137,3%; площади 88,5 и 78,7%; объема 109,1 и 116,9%. Индекс сферичности клеток в контроле ко второму месяцу снизился на 18,7%, а к третьему на 32,6%. По-видимому, это может быть связано с возрастными изменениями, происходящими в организме животных за время проведения эксперимента. Установлено, что после 1 месяца затравки наблюдалось дозозависимое увеличение фазовой высоты клеток по сравнению с контролем на 22, 40,7 и 43,2%. Специфичный характер ответа эритроцитов на минимальную концентрацию CdCb проявился в увеличении диаметра, периметра, площади и объема клеток на 9,1, 9,3, 17,5, 47,5%, соответственно. В то время как кадмий в дозах 10 и 100 мкг/кг вызывал приблизительно одинаковую ответную реакцию: уменьшение показателей диаметра, периметра и площади в пределах 5 — 18%. Во всех группах наблюдения зарегистрировано снижение величины ИС. Можно предположить, что особенности морфо-функционального состояния эритроцитов крыс, получавших Cd2+ в дозе 1 мкг/кг, обусловлены некоторым стимулирующим эритропоэз эффектом минимальной концентрации этого металла. Выраженные изменения большинства оптико-геометрических показателей во всех анализируемых группах позволяют считать 1-ый месяц эксперимента - «периодом накопления». После двух месяцев регулярного введения кадмия достовернозначимые изменения морфометрических показателей эритроцитов наблюдались только в группе крыс получавших минимальную дозу препарата.
Эритроциты крыс, получавших кадмий в концентрации 1 мкг/кг, отличались сниженными величинами диаметра, периметра и площади на 5, 5,6, 10,5%, при достоверном увеличении их высоты и объема (картина, повторяющая изменения, наблюдаемые после 1 месяца введения кадмия в максимальной и средней концентрации). У экспериментальных животных, получавших CdCb в дозах 10 и 100 мкг/кг, не выявлено достоверно значимых отклонений оптико-геометрических показателей клеток относительно контроля. ИС, по-прежнему, оставался ниже контрольных значений. Не исключено, что отсутствие явных изменений морфофункционального статуса эритроцитов может соответствовать «латентному периоду» токсического действия кадмия на эритропоэз.
К концу третьего месяца наблюдения выявлено увеличение диаметра и площади эритроцитов во всех экспериментальных группах. Высота клеток повышалась на 10% только при действии максимальной концентрации. Показатели периметра и объема соответствовали величинам контрольных значений. Зарегистрировано увеличение индекса сферичности клеток на 3,8, 16,2, и 8,5% по отношению к контролю 3 месяца при действии минимальной, средней и максимальной концентрации, соответственно. В целом, изменения клеточных параметров, наблюдаемые в этом месяце, были ниже аналогичных показателей эритроцитов в «период накопления» ионов кадмия. По-видимому, отсутствие значимых изменений некоторых исследуемых показателей свидетельствует о формировании «периода адаптации» организма к воздействию кадмия.
Таким образом, наиболее чувствительными и лабильными оптико-геометрическими показателями эритроцитов в условиях кадмиевой интоксикации являются диаметр, высота и площадь клеток. На рисунке 5.1. представлены диаграммы распределения популяций эритроцитов крови крыс, получавших CdCl2 в различных концентрациях, в течении трех месяцев эксперимента, по величине их диаметра. Установлено, что после 1 месяца затравки («период накопления») эффект стимуляции эритропоэза минимальной концентрацией кадмия проявился в увеличении числа макроцитов, т.е. молодых эритроцитов, практически на 34%. Токсическое действие средней и максимальной концентраций CdCb нашло отражение в снижении содержания макроцитов (11 и 32%, соответственно) и увеличении субпопуляции микроцитов до 6 - 9%. В «латентный период» число микро-, нормо- и макроцитов в популяции клеток при воздействии Cd2+ в дозе 1 мкг/кг составляло 7, 72, 21%, соответственно, что аналогично состоянию эритропоэза организма в ответ на получение средней и максимальной концентрации кадмия в течение 1-го месяца. При увеличении дозы препарата снижалось лишь содержание микроцитов. Для «периода адаптации» характерно незначительное снижение количества макроцитов и увеличение числа нормоцитов во всех группах наблюдения по сравнению с контролем.
Характеристика изменения морфофункциональных показателей эритроцитов периферической крови крыс под влиянием различных концентраций ионов кадмия
В последние годы в связи с активной техногенной деятельностью человека зарегистрировано повышение содержания кадмия и его соединений в окружающей среде. Этот факт вызывает обоснованное беспокойство со стороны специалистов, поскольку ионы кадмия, обладая кумулятивными свойствами [19, 30], могут оказывать токсическое действие на различные физиологические системы организма человека и животных. Значительное число современных научных исследований посвящено изучению влияния кадмия на легочную, сердечно-сосудистую, выделительную, опорно-двигательную системы [9, 21, 36, 174]. Предпринимались попытки установить патологическое действие кадмия и на систему крови, в частности, на эритроциты [23, 28, 39, 60, 88, 98, 109, 118]. Это самая многочисленная популяция клеток в кровотоке, оказывающая непосредственное влияние на физиологию различных органов и тканей. В связи с этим, изучение токсического действия кадмия на морфофункциональные свойства эритроцитов представляет особый интерес.
Известно, что морфометрические показатели различных цитообъектов являются высокоинформативными и объективными критериями оценки их функционального состояния [1, 26]. В связи с этим, исследование изменений структурно-объемных параметров клеток крови с применением современных автоматизированных методов, обладающих высокой точностью, чувствительностью и оперативностью, может иметь значение в плане получения новой объективной научной информации, касающейся особенностей клеточного реагирования на действие повреждающих токсических факторов.
Данное исследование посвящено изучению прижизненных показателей морфофункционального состояния эритроцитов и разработке на их основе критериев оценки токсического действия кадмия на красные клетки периферической крови человека и животных.
Для выявления специфического действия кадмия на эритроциты были использованы два методических подхода:
Первый - исследование морфометрических показателей клеток с помощью новейшей методики компьютерной лазерной фазово-интерференционной микроскопии, позволяющей анализировать живые клетки крови, и электронной микроскопии для детального изучения формы, структуры и поверхностной архитектоники эритроцитов;
Второй - анализ функциональных параметров клеток: определение кислотной резистентности эритроцитов, как показателя их устойчивости к гемолизу, методом кислотных эритрограмм и выявление уровня активизации перекисного окисления липидов мембран эритроцитов с помощью хемилюминесценции. На первом этапе нашего исследования была проведена оптимизация метода прижизненной компьютерной фазометрии, повышающая его эффективность как в плане проведения методики измерений, так и учета полученных результатов на качественно новом уровне: — разработана оптимальная среда, обеспечивающая достаточно длительное сохранение формы эритроцитов. Новый рабочий раствор представляет собой смесь 6% гидроксиэтилированного крахмала (HES 200/0.5, Serum-Werk Bernburg AG, Германия) с плазмой крови в соотношении 20:1; — в пакет программ для анализа морфофункционального статуса клеток внесены существенные коррективы: визуализация четкого оконтуривания границ эритроцита и возможность количественной оценки клеточных групп, различных по величине их максимального диаметра. На основе полученной базы данных проведен многофакторный анализ результатов измерений и охарактеризованы фазово-интерференционные портреты живых эритроцитов периферической крови человека и животных. Важно подчеркнуть, что размерные параметры фазово-интерференционного портрета содержат информацию не только о пространственно-объемных характеристиках клетки, но и ее оптических свойствах, в частности, о внутриклеточной анизотропии. А поскольку величина показателя преломления, измеряемая в каждой точке цитообъекта, непосредственно зависит от концентрации, химического состава, агрегатного состояния внутриклеточного вещества, наличия или отсутствия органелл и включений, изменение любого из указанных условий находит отражение в локальных трансформациях фазового изображения клетки и, соответственно, ее размерных параметров [5]. Установлено, что эритроциты практически здоровых людей по сравнению с красными клетками крови крыс обладают большими диаметром, периметром, высотой, площадью и объёмом (на 20, 19, 18, 35 и 50%, соответственно). При этом величина отношения площади поверхности эритроцита к его объёму (S/V) - «индекс сферичности», позволяющая косвенно оценить степень деформируемости клеток, у эритроцитов крыс практически на 20% превышает аналогичный показатель эритроцитов человека (1,57 и 1,26, соответственно).
Анализ размерных показателей эритроцитов периферической крови крыс показал, что их популяция представлена, преимущественно, нормоцитами — зрелые клетки с диаметром 6 — 8 мкм - 62% от общего числа. Микроциты — клетки с диаметром менее 6 мкм составляют около 10%, а количество макроцитов - физиологически более молодых клеток с диаметром более 8 мкм - 28%.
![Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробластических островков [Электронный ресурс]](/i/i/4230/210590.png "Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробластических островков [Электронный ресурс] Шевяков Сергей Александрович")
