Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. основные пути адаптации организма и клеточных систем гидробионтов к гипоксии и аноксии ...11
1.1. Поведение и гипоксия. 12
1. 2. Физиологические адаптации 17
1. 3. Метаболические адаптации. 28
1.4. Реакции клеточных систем гидробионтов на гипоксию .33
2. Материал и методы 41
2.1. Отлов, транспортировка и содержание материала 41
2.2. Отбор проб крови...42
2.3. Приготовление эритроцитарных взвесей .43
2.4. Моделирование гипоксических условий (эксперименты in vitro)...44
2.5. Цитометрический анализ .47
2.6. Морфометрический анализ 49
2.7. Статистический анализ результатов...51
3. Метод прижизненной цитоморфометрии ядерных эритроцитов рыб .52
3.1. Разработка метода прижизненной морфометрии ядерных эритроцитов .53
3.2. Результаты применения метода прижизненной морфометрии клеток 55
3.3. Метод прижизненной цитоморфометрии ядерных эритроцитов рыб (лабораторный регламент) 58
4. Морфометрические характеристики эритроцитов в условиях экспериментальной гипоксии .60
4.1. Характеристика эритроцитарной массы исходных образцов крови...60
4.2. Геометрические характеристики эритроцитов в условиях гипоксии 63
4.3. Геометрические характеристики ядер эритроцитов в условиях гипоксии .78
4.4. Обсуждение результатов исследований 87
5. Цитофлюориметрические показатели суспензий эритроцитов в условиях экспериментальной гипоксии 96
5.1. Родамин 123...96
5.2. Диацетат флуоресцеина 99
5.3. SYBR Green I 103
5.4. Пропидиум йодид (PI) 108
5.5. Обсуждение результатов исследования 110
6. Прямое и боковое рассеяние неокрашенных суспензий эритроцитов 117
6.1. Прямое и боковое рассеяние неокрашенных суспензий эритроцитов 117
6.2. Обсуждение результатов .123
Заключение .127
Выводы 131
Перечень сокращений...133
Список литературы 135
- Реакции клеточных систем гидробионтов на гипоксию
- Цитометрический анализ
- Метод прижизненной цитоморфометрии ядерных эритроцитов рыб (лабораторный регламент)
- Геометрические характеристики ядер эритроцитов в условиях гипоксии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Гипоксические акватории широко представлены в шельфовой зоне Мирового океана (oxygen-minimum zones) (Levin, 2002; Middelburg, Levin, 2009; Gewin, 2010). Основными причинами их формирования являются низкая скорость диффузии кислорода в воде и ограничение процессов водообмена (Duncombe-Rae, 2000; Joyce, 2000). Особый интерес для изучения представляют организмы, образующие здесь устойчивые экосистемы, общим свойством для всех трофических уровней которых является толерантность к экстремальным (концентрация кислорода менее 1 мг л-1) формам гипоксии (Fenchel, Finlay, 1995; Levin, 2002; 2010; Stoeck et al., 2003; El Albani et al., 2010; Danovaro et al., 2010).
Известно, что кислород выполняет функцию акцептора электронов в дыхательной цепи митохондрий клеток и тем самым определяет энергетический статус клеток, тканей и организма в целом. Поэтому основное внимание исследователей при изучении толерантных к гипоксии форм жизни сосредоточено на биоэнергетических процессах. Установлено, что у гидробионтов, обитающих в зонах кислородного экстремума, наблюдается существенная реорганизация метаболических процессов, направленная на оптимизацию энергетических трат организма (Hochachka, Somero, 2002; Gewin, 2010). В тканях повышается содержание аланина и сукцината, как конечных продуктов, что не свойственно аэробному обмену (Waarde, 1988), усиливается продукция NH4+ (Shulman, Love, 1999; Chew, Gan, 2005), растет активность аланин- и аспартатаминотрансфераз (Owen, Hochachka, 1974), активизируются процессы переаминирования аминокислот (глутамата, аланина) (Mommsen et al., 1980). Показано также, что ферментативные системы цикла Кребса могут быть задействованы в анаэробных процессах генерации энергии (Waarde, 1988), а дыхательная цепь митохондрий клеток приобретает нескомпенсированный тип организации (Савина, 1992; Soldatov, Savina, 2008).
Определенные закономерности выявлены и на уровне клеточных систем. Установлено, что эритроциты толерантных к гипоксии рыб в условиях дефицита кислорода способны к сбалансированному угнетению мембранных и метаболических функций (Новицкая и др., 2011), при этом наблюдаются характерные морфологические изменения клеток и повышается их деформируемость (Gilles, Motais, 1989). В большинстве работ констатируется факт роста клеточного объема (swelling) (Cossins, Gibson, 1997; Jensen, 2004; Wells, 2009). Процесс контролируется катехоламинами (преимущественно норадреналином) (Tetens et al., 1988; Perry et al., 1999), взаимодействующими с поверхностными -адренорецепторами эритроцитов (Reid, Perry, 1995; Jahns et al., 1996) и активирующими Na+/H+ и HCO3-/Cl- – антипорты клеток (Wood, Simmons, 1994; Jensen, 2004). Действие катехоламинов опосредуется через cAMP (Gilles, Motais, 1989). Общее назначение процесса – контроль величины внутриклеточной рН и параметров сродства гемоглобина к кислороду. Считается, что эта последовательность реакций имеет адаптивное значение и может быть реализована только на системном уровне. Однако подобные реакции клеточных систем установлены и для организмов-конформеров (Солдатов и др., 2012; Новицкая, Солдатов, 2011). При этом известно, в условиях внешнего экстремума они допускают значительные изменения параметров внутренней среды, но имеют весьма эффективные механизмы автономного контроля клеточного гомеостазиса. Такая стратегия позволяет им выдерживать условия аноксии на протяжении многих месяцев (Vaquer-Sunyer, Duarte, 2008). Сохраняют ли подобные реликтовые механизмы при адаптации к гипоксии и аноксии организмы-регуляторы, не ясно. Проверить это можно только в условиях in vitro, чему и посвящена настоящая работа.
В качестве объекта исследования выбраны ядерные эритроциты толерантного к гипоксии морского вида донной рыбы Scorpaena porcus L., Этот тип клеток используется как модель во многих экспериментальных работах (Phillips et al., 2000). Они обладают развитыми системами переноса органических и неорганических ионов через клеточную мембрану, что позволяет осуществлять адаптивную регуляцию объема клетки (Cossins, Gibson, 1997). У них обнаружены митохондрии, ферменты цикла Кребса (Boutilier, Ferguson, 1989; Phillips et al., 2000), что делает их функционально ближе к клеткам соматических тканей.
Цель и задачи исследования. Цель работы – исследовать влияние гипоксии (в условиях in vitro) на ядерные эритроциты Scorpaena porcus L. при помощи методов функциональной морфологии и проточной цитометрии.
Задачи исследования:
Разработать метод прижизненной морфометрии клеток красной крови для низших позвоночных.
Оценить в условиях in vitro влияние ранжированной гипоксии на морфометрические характеристики эритроцитов Scorpaena porcus L.
Изучить в условиях эксперимента влияние дефицита кислорода на функциональную активность клеточных ядер эритроцитов по интенсивности флуоресценции SYBR Green I.
Исследовать влияние гипоксии на изменение потенциала митохондрий эритроцитов при помощи флуорохрома родамина 123 (R123).
Оценить состояние мембран эритроцитов в условиях экспериментальной гипоксии по включению витальных красителей пропидиум йодида (PI) и диацетата флуоресцеина (FDA).
Объект исследования – ядерные эритроциты Scorpaena porcus L.
Предмет исследования – морфометрические показатели ядерных эритроцитов, функциональное состояние ядер эритроцитов, клеточной мембраны, изменения мембранного потенциала митохондрий.
Методы исследования. Методы световой и люминесцентной микроскопии для проведения микрофотосъемки суспензии ядерных эритроцитов. Гематологические методы. Цитофлюориметрические методы для определения мембранного потенциала митохондрий, функциональной активности ядер эритроцитов, а также состояния клеточной мембраны красных клеток крови. Статистические методы анализа цифровой информации.
Научная новизна результатов. Впервые установлено, что экстремально низкие (менее 1,76 мгО2 л-1) концентрации кислорода повышают степень поляризации внутренней мембраны митохондрий клеток, о чем свидетельствует увеличение интенсивности флуоресценции родамина (R123). Это является следствием ограничения процессов трансмембранного обмена, что отражает задержка полярной флуоресцирующей формы FDA в цитоплазме клетки в условиях гипоксии.
Определена последовательность изменений морфофункциональных характеристик ядерных эритроцитов скорпены при снижении концентрации кислорода в инкубационной среде в диапазоне 0,57-4,03 мгО2 л-1. Вначале наблюдается уменьшение объема, рост удельной поверхности клетки и снижение толщины ее диффузионного слоя. Затем (менее 1,73 мгО2 л-1) процессы приобретают противоположную направленность. Изменение формы эритроцита происходит за счет всех его линейных параметров: толщины, большой и малой осей клетки. При этом в условиях низкой концентрации кислорода преобладает рост малой оси, что придает клетке более округлую форму.
Впервые показано, что экстремальные формы гипоксии (менее 1,76 мгО2 л-1) индуцируют рост функциональной активности ядер эритроцитов. Это нашло отражение в увеличении объема данной структуры и повышении интенсивности свечения красителя SYBR Green I ассоциированного с хроматином (R2 – 0,810).
Установлено, что гипоксия не оказывает влияния на жизнеспособность и целостность мембран ядерных эритроцитов скорпены. Интенсивность флуоресценции FDA эритроцитарных взвесей растет, а пропидиум йодида (PI) – сохраняется на уровне контрольных значений.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведение исследований с применением методов проточной цитометрии, которые широко используются для определения размеров клеток, показало, что изменение значений прямого и бокового рассеяния для неокрашенных взвесей ядерных эритроцитов не позволяют дать адекватную оценку морфологических и функциональных реакций клеток; изменения этих показателей не подтверждаются данными световой микроскопии.
При проведении работы был разработан метод прижизненной морфометрии ядерных эритроцитов низших позвоночных (патент Украины- Андреева А.Ю., Муханов В.С. «Спосіб вимірювання морфометричних показників інтактних ядерних еритроцитів риб» (№ а201309689 от 05.08.2013). Он позволяет ускорить процесс проведения морфометрического анализа клеток, снизить аппаратную погрешность измерений а также регистрировать линейные размеры не только клеток (длину, ширины, толщину), но и их ядер. Последнее достигается применением витальных красителей (SYBR Green I).
Теоретические положения и прикладные аспекты диссертации могут быть использованы при работе в области рыбоводства.
Результаты исследований применимы при подготовке лекционных курсов по клеточной физиологии и биохимии животных для студентов биологических специальностей высших учебных заведений.
Положения, выносимые на защиту
Эритроциты толерантного к гипоксии вида Scorpaena porcus L. сохраняют в условиях in vitro способность к направленной волюмрегуляции и адаптивному изменению удельной поверхности клетки.
Экстремальные формы гипоксии (менее 1,76 мгО2 л-1) индуцируют рост объема и функциональной активности ядерных структур эритроцитов условиях in vitro.
Гипоксия повышает степень поляризации внутренней мембраны митохондрий ядерных эритроцитов, что является следствием ограничения процессов трансмембранного обмена на уровне цитоплазматической мембраны клетки.
Апробация результатов исследования. Результаты исследований, включенные в диссертационную работу, были представлены на следующих научных форумах: 4th International Symposium “Crossroads in biology” (Cologne, Germany, 2012); 10th International congress on the biology of fish, (Madison, USA, 2012); Х Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Шевченковская весна 2012»: биологические науки (Киев, Украина, 2012), VIII Международная научно-техническая конференция «Актуальные вопросы биологической физики и химии БФФХ-2012» (Севастополь, Украина, 2012); Международная конференция «Современные проблемы гидроэкологии. Перспективы, пути и методы исследований» (Херсон, Украина, 2012); V Международная научно-практическая конференция «Сучасні проблеми теоретичної і практичної іхтіології» (Черновцы, Украина, 2012); VIII Всероссийская конференция с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, Россия, 2012), II Международная научная конференция “Актуальні проблеми сучасної біохімії та клітинної бїологїї” (Днепропетровск, Украина, 2013); VIII Международная научно-практическая конференция молодых ученых «Понт Эвксинский», (Севастополь, Украина, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ. Основные результаты изложены в 6 статьях, 1 патенте и 9 материалах отечественных и международных научных конференций. 2 статьи опубликованы в периодических научных изданиях, входящих в профессиональный перечень, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций. Три статьи входят в наукометрическую базу данных Scopus.
В статьях, опубликованных в соавторстве, соискателю принадлежат: проведение экспериментальных исследований, лабораторная обработка проб, статистический анализ полученных результатов, совместная подготовка текстов статьей. Права соавторов публикаций не нарушены.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6-ти разделов, заключения, выводов списка использованных источников. Работа изложена на 162 страницах, содержит 6 таблиц и 53 рисунка. Список литературы включает 263 источника, из них - 248 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю, доктору биологических наук А. А. Солдатову, за всестороннюю помощь в процессе работы над рукописью, искреннюю признательность сотрудникам отдела физиологии животных и биохимии, кандидату биологических наук Л. С. Светличному за помощь в подборе аппаратуры для экспериментальной работы, а также кандидату биологических наук В. С. Муханову за методическую помощь, ценные рекомендации и консультации.
Реакции клеточных систем гидробионтов на гипоксию
До 90 % энергетических потребностей ядерные эритроциты низших позвоночных удовлетворяют за счет процессов аэробного метаболизма (Sephton et al., 1991; Soengas, Moon, 1995; Walsh et al., 1990). В отличие от эритроцитов млекопитающих для клеток красной крови костистых рыб характерно разнообразие путей ресинтеза АТР. В эритроцитах рыб одинаково эффективны ферменты гликолиза, цикла Кребса, фосфатного и аминокислотного обмена (Wanga et al., 1999; Tiihonen, Nikinmaa, 1991; Walsh et al., 1990; Ferguson, Storey, 1991). Высокие активности и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у различных видов костистых рыб (Walsh et al., 1990; Ferguson, Storey, 1991; Tiihonen, Nikinmaa, 1991), свидетельствуют о значительном участии реакций пентозофосфатного шунта в метаболизме ядерных эритроцитах. Наличие цикла пентоз имеет особое значение для красных клеток крови рыб, так как НАДФН2 необходим для восстановления метгемоглобина при участии глутатиона (Ferguson, Storey, 1991).
Хотя пути обмена веществ, присутствующие в ядерных эритроцитах, изучены достаточно полно, определение основного энергетического субстрата представляет определенную трудность (Sephton et al., 1991). Красные клетки крови низших позвоночных для этих целей способны использовать значительно большее число низкомолекулярных соединений (Wanga et al., 1999). Очевидно, что глюкоза является наиболее распространенным у них энергетическим субстратом (Pesquero et al., 1994; Sephton et al., 1991; Wanga et al., 1999; Soengas, Moon, 1995). Однако имеется и ряд отличий. Так, карп (Cyprinus carpio) и желтый окунь (Perca flavescens) используют молочную кислоту в процессах окислительного фосфорилирования (Pesquero et al., 1994; Soengas, Moon, 1995; Tiihonen, Nikinmaa, 1991). Имеются данные, что эритроциты некоторых видов рыб активно утилизируют монокарбоновые кислоты (пируват) и аминокислоты плазмы крови (глутаминовая кислота, изолейцин и др.) в качестве субстратов аэробного обмена (Tiihonen, Nikinmaa, 1991; Wanga et al., 1999; Pesquero et al., 1994). Подобное разнообразие свидетельствует о чрезвычайной пластичности костистых рыб в приспособлении к различным условиям среды.
Общим свойством гемоглобинов позвоночных, в том числе и гемоглобинов рыб, является чувствительность к воздействию органических фосфатов: при связывании с молекулой белка они вызывают уменьшение его сродства к кислороду (Jensen et al., 1998). В течение 20-го столетия было проведено значительное количество исследований по идентификации и содержанию органических фосфатов в красных клетках крови рыб. Оказалось, что для большинства видов рыб доминирующим органическим фосфатом в эритроцитах является АТР. Данное соединение обнаруживается в равной степени, как у древних таксонов, так и у филогенетически более молодых видов рыб (Val et al., 1998; Bartlett, 1982). Достаточно широко распространен и GТР (гуанозинтрифосфат) (Marcon et al., 1999; Johansen et al., 1976; Val, 1994). Гораздо реже встречаются виды, у которых доминирующими органическими фосфатами эритроцитов являются ИПР (инозитолпентафосфат) и 2,3-ДФГ (2,3-дифосфоглицерат) (Val, 1993; Borgese, Nagel, 1978). Степень воздействия органических фосфатов на способность гемоглобина связывать кислород распределяется следующим образом: ИПР GТР АТР 2,3-ДФГ (Gillen, Riggs, 1971; Val, Almeida-Val, 1995). Интересно, что уровни GТР в целом выше, чем АТР у рыб, обитающих в условиях гипоксии. Известно также, что уровень АТР, как правило, превышает концентрацию GТР у морских видов рыб (Filho et al., 1992).
Выброс катехоламинов в кровь при гипоксии приводит не только к изменению сродства гемоглобина к кислороду (Wood et al., 1990; Roig et al., 1997), но и к усилению аэробного обмена в эритроцитах. В то же время, подобной зависимости анаэробного метаболизма от адренергической стимуляции не наблюдается (Orlov, Skryabin, 1993).
Постепенное снижение уровней АТР и GТР в эритроцитах с течением гипоксии приводят к перестройкам метаболизма клеток, что является адаптацией к недостатку кислорода (Wood, Johansen, 1972). При этом концентрация GТР снижается быстрее, в сравнении с АТР (Jensen, Weber, 1985). Еще одним следствием снижения синтеза АТР является внутриклеточный ацидоз и рост концентрации аденозиндифосфата (ADP) и аденозинмонофосфата (AMP) в цитоплазме эритроцитов. Накопление предшественников АТР в клетке является стимулом для активации субстратного фосфорилирования в эритроцитах (Jibb, Richards, 2008) Механизмы, контролирующие изменения в уровнях концентрации органических фосфатов в эритроцитах рыб остаются неясными, однако, вероятно, изменение их содержания происходит вследствие снижения их кислородного синтеза и воздействия катехоламинов (Greaney, Powers, 1978; Dalessio et al., 1991). Для чувствительных к гипоксии видов воздействие недостатка кислорода приводит к неспособности клеток генерировать достаточный уровень АТР, чтобы удовлетворить потребности клеток в синтезе белка, регуляции ионообмена и других процессах. Точный механизм гибели клеток при гипоксии неизвестен. Однако установлено, что смерть клеток при гипоксии и аноксии ассоциирована с катастрофической нехваткой субстратов метаболизма, разбалансировкой обмена веществ и накоплением конечных продуктов обмена (Boutilier, St-Pierre, 2000).
Поддержание градиентов концентрации ионов на клеточном уровне играет ключевую роль в обеспечении выживания организма в условиях дефицита кислорода (Boutilier, 2001). Снижение образования АТР у чувствительных видов рыб приводит к нарушениям тока Na+ и K+ через мембрану, что, в свою очередь, ведет к частичной деполяризации мембраны клеток и накоплению ионов кальция в цитоплазме. Это может привести к активации кальцийзависимых протеаз, участвующих в процессе апоптоза клеток. Устойчивые к гипоксии виды, напротив, способны нейтрализовать вышеописанную последовательность реакций через снижение проницаемости мембран клеток и потребностей их в АТР (так называемый «арест ионных каналов») (Boutilier, 2001; Hochachka et al., 1996).
Цитометрический анализ
Все измерения цитометрических показателей эритроцитов проводились на проточном цитометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США), оборудованном однофазным аргоновым лазером (длина волны 488 нм). После окончания эксперимента отбирали образцы суспензии эритроцитов для анализа на цитофлюориметре. Пробы разбавляли в 100 раз. Конечный объем разбавленной пробы составлял 2 мл, общее время анализа – 20-100 сек в зависимости от числа клеток в суспензии. Каждое измерение выполнялось в трех повторностях. Об изменении характера флуоресценции красителей и рассеяния проб судили по безразмерным двухпараметрическим логарифмическим цитограммам в программе Flowing Software 2.0.
Для определения размеров и степени гранулярности эритроцитов изучали прямое (FS) и боковое рассеяние (SS) неокрашенных проб. Расчет показателей проводили с помощью гейтинга (выделения) популяции клеток на цитограмме.
Долю поврежденных эритроцитов в суспензии при гипоксии анализировали, используя краситель пропидиум йодид (PI) (Molecular Probes, США). Данный флуорохром является маркером нуклеиновых кислот и не способен проникать через клеточную мембрану живых клеток, окрашивая, таким образом, только поврежденные (мертвые) эритроциты (Edidin, 1970). Степень флуоресценции красителя коррелирует с количеством ДНК в клетке, максимумы возбуждения и эмиссии составляют 535 нм и 617 нм соответственно (Wallen et al., 1982; Ormerod et al., 1992). Окрашивание суспензии эритроцитов проводили в течение 20 мин. Конечная концентрация красителя – 10 мкл мл-1. Измерение интенсивности флуоресценции PI осуществляли в канале FL3 (625 нм).
Изменения потенциала митохондрий в эритроцитах контролировали путем измерения интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных красителем родамин 123 (R123) (Molecular Probes, США). R123 является специфическим митохондриальным красителем. Благодаря особенностям своей химической структуры, молекулы R123 накапливаются в митохондриях здоровых клеток. Ингибиторы клеточного дыхания вызывают снижение флуоресценции красителя. Максимум абсорбции красителя наблюдается при 485 нм, максимум эмиссии 530 нм (Johnson et al., 1981). Окраску эритроцитов R123 проводили в течение 10 минут. Концентрация красителя в пробе составляла 2,5 мкл л-1. Определение интенсивности флуоресценции красителя проводили на канале FL1 (525 нм). Для оценки общей метаболической активности и изменений проницаемости клеточной мембраны эритроцитов применяли диацетат флуоресцеина (FDA), максимумы возбуждения и эмиссии соответственно, 494 и 518 нм. Благодаря своей структуре, сходной с R123, данный флуорохром пассивно проходит через цитоплазматическую мембрану клеток. Перевод красителя в светящуюся форму осуществляется неспецифическими эстеразами (Jochem, 1999). Известно также, что FDA позволяет определять целостность мембран (Prosperi et al., 1985). Скорость выведения флуоресцирующего красителя из клеток ниже скорости его поступления, потому уменьшение свечения FDA свидетельствует о мембранных повреждениях (Prosperi et al., 1985). Краситель растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) (конечная концентрация 5 мгмл-1) и хранили при +4С. Окраску суспензии эритроцитов проводили при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин. Для оценки интенсивности флуоресценции FDA использовали канал FL1 цитометра (525 нм).
Оценка изменений состояний ДНК проводилась при помощи витального красителя SYBR Green I (Molecular Probes, США). Данный флуорохром имеет максимумы возбуждения и эмиссии 497 и 521 нм, соответственно. SYBR Green I специфично связывается с двухцепочечной нитью ДНК и характеризуется невысоким сродством к РНК и одноцепочечной нити ДНК. Раствор красителя готовили в разбавлении 10-2 и хранили в замороженном состоянии при -20С. Финальное разбавление красителя в пробе составляло 10-4. Время окрашивания суспензии клеток составляло 20 мин непосредственно перед измерением флуоресценции.
При определении геометрических характеристик эритроцитов целесообразно использовать методы, исключающие их фиксацию и окраску, так как это может существенно искажать результаты измерений. В связи с этим был разработан новый метод прижизненной морфометрии ядерных эритроцитов рыб (см. раздел 3), позволяющий исключить из внимания эти факторы. Принцип метода заключается в предварительном окрашивании нативной суспензии эритроцитов витальным красителем SYBR Green I, вызывающим флуоресценцию ядер, и последующей микрофотосъемке клеток. Протокол окраски клеток красной крови флуорохромом осуществлялся по вышеописанной методике (подраздел 2.3). Фотографирование суспензии эритроцитов проводили на лабораторном инвертированном микроскопе для светлого поля и флуоресценции Nikon Eclipse TS100, оборудованном камерой Ikegami ICD-848P.
Линейные размеры клеток крови определяли по фотографиям в компьютерной программе ImageJ 1.44p (Girish, Vijayalakshmi, 2004). Измеряли следующие характеристики: длина большой и малой оси клетки (С1 и С2 соответственно), длина большой и малой оси ядра (N1 и N2 соответственно) (рис. 2.4).
Метод прижизненной цитоморфометрии ядерных эритроцитов рыб (лабораторный регламент)
Получение образцов цельной крови. У костистых рыб при получении проб крови применяют следующие приемы: пункция сердца (с вскрытием и без вскрытия полости), пункция жаберной или хвостовой артерий, отсечение хвостового стебля (Houston, 1990). Последний способ считается наиболее быстрым и простым. Он позволяет отбирать наибольший объем циркулирующей крови. При этом инструменты, используемые при взятии проб крови (скальпели, пинцеты, микропипетки), следует обрабатывать антикоагулянтами (5 % раствор цитрата натрия), так как слизь, покрывающая кожу рыб, содержит гемостатические соединения. Кровь сцеживается в пластиковую пробирку, куда предварительно вносится небольшая капля гепарина.
Приготовление эритроцитарной взвеси. После получения образцов цельной крови форменные элементы осаждают путем центрифугирования при 1000 g в течение 15 мин. Плазму и верхний слой клеточной массы, обогащенный лейкоцитами и тромбоцитами, удаляют. Затем вносят адекватный объем среды следующего состава: 128 мМ NaCl, 3 мМ KC1, 1,5 мМ CaCl2, 1,5 мМ MgCl2, 15 мМ л Трис, 2,2 мМ D-глюкозы (рН 7,8) (Tiihonen, Nikinmaa, 1991). Образец перемешивают и подвергают повторному центрифугированию при том же режиме. Процедуру повторяют трижды. Подготовленная таким образом эритроцитарная взвесь не содержит следов плазмы, что исключает влияние биологически активных соединений на функциональное состояние клеток.
Окрашивание SYBR Green I (Molecular Probes, США). Перед окрашиванием ядер клеток, полученные ранее образцы эритроцитарных взвесей разводят в 100 раз. Для этого используют ту же питательную среду. Затем в пробирки добавляют SYBR Green I в таком количестве, чтобы финальное разведение флуорохрома составило 10000 раз. Экспозиция – 20 минут. После окрашивания каплю клеточной взвеси наносят на предметное стекло и подвергают микроскопическому исследованию.
Микрофотосъемка. Препарат размещают на предметном столике инвертированного микроскопа. В нашем случае использовался микроскоп для светлого поля и флюоресценции Nikon Eclipse TS100, оборудованный цифровой камерой Ikegami ICD-848P. Съемку проводят после оседания клеток на поверхность предметного стекла. При фотосъемке одного и того же объекта применяли световой и люминесцентный режимы работы. В последнем случае использовали набор светофильтров для возбуждения SYBR Green I в синей области спектра. Необходимо получить два варианта изображений: на освещенном и затемненном полях микроскопа. В первом случае различимы границы эритроцитов, во втором – границы окрашенных ядер.
Редактирование микрофотографий. Для обработки изображений клеток применяется редактор растровой графики, позволяющий накладывать изображения друг на друга. Для этих целей может быть использован Adobe Photoshop или любая другая программа, предназначенная для работы с графическими объектами.
Освещенную и затененную фотографии совмещают путем наложения светлого снимка на темный и установкой прозрачности верхнего слоя (изображения) на уровне 20-40%. В результате на снимках видны клетки с окрашенными ядрами, что позволяет проводить количественную оценку размерных характеристик клеток.
Цитоморфометрия. Измерение линейных параметров клеток, а также, если это необходимо, их количественный учет ведется в ручном и автоматическом режимах в программах анализа изображений. В нашем случае использована компьютерная программа ImageJ 1.44p. Она позволяет проводить калибровку и определять линейные характеристики объектов, а также сводить данные в таблицу для дальнейших расчетов и статистической обработки.
Геометрические характеристики ядер эритроцитов в условиях гипоксии
Важной функциональной характеристикой любой клеточной структуры является ее удельная поверхность. Функционально активный органоид всегда имеет высокую SSn.
Из рисунка 4.23 видно, что умеренные и экстремальные формы экспериментальной гипоксии в основном вызывали снижение значений данного показателя на 2-8 %. В большинстве случаев различия были статистически значимы при p 0,05.
. Изменения площади удельной поверхности ядер эритроцитов (SSn) в условиях экспериментальной гипоксии Сравнение характера изменения геометрических параметров эритроцитов и их ядер в условиях ранжированной гипоксии позволяет говорить об однонаправленности обоих процессов. Это видно из сопоставления объемных характеристик данных структур (Vс и Vn) (рис. 4.24). Связь хорошо описывается уравнением линейной регрессии при сравнительно высоких значениях R2 (0,67).
Об относительной пропорциональности изменений (Vс и Vn) можно судить и по NCR. Значения данной величины представлены в таблице 4.3. Только в одном случае было зарегистрировано достоверное снижение NCR при 1,23 мгО2 л-1 (p 0,05). В остальных случаях различия не были выражены. При этом отмечалась как тенденция роста NCR, так и снижения. Такая однозначность изменений Vс и Vn позволяет искать какие-то общие процессы, лежащие в их основе.
Таким образом, оценка изменения геометрических характеристик ядер эритроцитов скорпены в условиях ранжированной гипоксии позволяет обратить внимание на следующие моменты:
В условиях умеренной гипоксии (1,76-4,03 мгО2 л-1) происходило уменьшение объема (Vn) и площади поверхности (Sn) ядер эритроцитов. Экстремально низкие концентрации кислорода (0,57-1,76 мгО2 л-1) оказывали прямо противоположный эффект и вызывали увеличение значений Vn и Sn. В основе данной реакции лежали пропорциональные изменения линейных характеристик ядра (N1 и N2). Удельная поверхность ядер эритроцитов при дефиците кислорода снижалась. Концентрационная зависимость этого процесса была слабо выражена.
Изменение геометрических характеристик эритроцитов и их ядер в целом было однонаправлено (R2 – 0,67), что позволяет искать общие процессы, лежащие в их основе. Изучение влияния ранжированной гипоксии на зрелые эритроциты скорпены в условиях экспериментов in vitro показало, что данный фактор оказывал существенное влияние на форму, размеры клеток и их ядер. Это требует специального анализа процессов, лежащих в основе данных изменений.
Как было показано, изменение линейных характеристик эритроцита в условиях экстремально низких концентраций кислорода в инкубационной среде (0,57-1,76 мгО2 л-1) происходило непропорционально. Явно преобладал рост малой оси (C2), что придавало эритроциту более округлую форму. Это же нашло отражение и в изменении значений показателя формы клетки (MS).
Известно, что форма и размер эритроцитов рыб варьируют в достаточно широких пределах и зависят от уровня естественной подвижности вида, а также его толерантности к дефициту кислорода (Lay, Baldwin, 1999; Hyde, 1982). Сравнительный анализ размерных характеристик эритроцитов показал, что длина большой оси клеток скорпены (С1) была сопоставима с таковой у карпа (Cyprinus carpio) и золотой рыбки (Carassius auratus) – видов, чрезвычайно устойчивых к недостатку кислорода в окружающей среде (табл. 4.4). Длина и общий размер эритроцитов скорпены значительно превышают величины этих показателей у активных пелагических видов рыб (у Gadus morhua, Mugil cephalus), и соответствуют геометрическим характеристикам красных клеток крови малоподвижных видов рыб, ведущих в основном донный образ жизни (Rambhaskar, Srinivasa Rao, 1987; Glomski et al., 1992).
Следует отметить, что форма эритроцитов – это важный показатель в оценке эффективности усвоения кислорода организмом. Виды, обладающие эллипсоидной формой клеток красной крови, более эффективны в реализации процессов газообмена, чем виды, имеющие эритроциты шаровидной формы (Hartman, Lessler, 1964). Как уже отмечалось, в условиях экстремальной гипоксии (0,57-1,76 мгО2 л-1) эритроциты скорпены приобретали более округлую форму, за счет преимущественного роста C2. Это следует рассматривать как факт снижения их функциональной активности, так как клетки красной крови становятся менее востребованными в процессах газообмена. Критической, по-видимому, является концентрация 1,76 мгО2 л-1, так как именно с нее начинается изменение формы эритроцита.
Как уже отмечали, в условиях экспериментальной гипоксии объем клеток красной крови скорпены претерпевал серию последовательных изменений.
При умеренных формах гипоксии (1,76-4,03 мгО2л-1) наблюдали снижение объема клетки (Vc) и рост ее удельной поверхности (SSс). Эту реакцию можно отнести к процессам компенсаторного порядка, так как она должна способствовать диффузионным процессам и облегчать оксигенацию гемоглобина.
При экстремальных формах гипоксии (0,57-1,73 мгО2л-1) происходили противоположные изменения. Объем эритроцитов повышался, а удельная поверхность клетки понижалась. Данная направленность процессов, напротив, должна затруднять переход гемоглобина в окси-состояние. Эти изменения, по-видимому, отражают функциональную невостребованность эритроцитов, которые не способны осуществить оксигенацию гемоглобина при столь низких концентрациях кислорода в инкубационной среде.
Информация об уменьшении объема клеток красной крови рыб в условиях недостатка кислорода крайне ограничена. Описан случай подобного поведения эритроцитов у скорпены в условиях кратковременной гипоксии (90 минут, эксперимент in vivo) (Солдатов и др., 1994). Вместе с тем, механизмы, которые могут лежать в основе данного поведения клеток, вполне реальны. Известно, что регуляторное уменьшение объема эритроцитов может происходить благодаря деятельности K+/Сl- – котранспорта, а также путем выхода из клетки органических осмолитов (Jensen, 1995). Среди возможных путей активации канала наиболее вероятным представляется незначительное снижение рН внутриклеточной среды (до 7,0), которое может быть следствием активизации анаэробных процессов и ростом внутриклеточной концентрации лактата (Adragna et al., 2004). Известно, что ядерные эритроциты низших позвоночных способны при наступлении неблагоприятных условий переходить на анаэробные режимы функционирования (Walsh et al., 1990). Свеллинг эритроцитов – более распространенная и описанная во многих работах реакция клеток красной крови рыб (Jensen, Weber, 1985). Набухание эритроцитов в условиях гипоксии происходит вследствие входа в клетку ионов Na+ через Na+/H+ – антипорт. Наиболее сильным стимулом к активации транспорта являются катехоламины, которые выбрасываются в кровь при снижении концентрации доступного кислорода и вступают во взаимодействие с -адренорецепторами эритроцитов (Borgese et al., 1987) (рис. 4.25).
