Введение к работе
Актуальность проблемы
Дифференциация и созревание эритроидных клеток в костном мозге млекопитающих и человека протекают в эритробластических островках, представляющих собой ассоциацию клеток двух различных линий - макрофагальной и эритроидной.
Установлено, что в культуре эритробластических островков, стимулированных внесением в неё эритропоэтина, резко активируются процессы пролиферации и созревания эритроидной «короны» островков с отделением от неё в кулыуральную среду ретикулоцитов (Zakharov Y, Prenant М., 1982, 1983). Однако, остаётся невыясненным, как может влиять увеличение числа образующихся в культуре эритроцитов на эритропоэз в эритробластических островках.
Между тем показано, что в регуляции эритропоэзаучаствует и авто-регуляторный механизм, в котором созревающие и зрелые клетки эритро-идного ряда выполняют функцию отрицательной обратной связи, тормозя новообразование эритроцитов эритроидными клетками-предшественницами (Захаров Ю. М., 1970).
В опытах in vivo установлено, что продукты распада или метаболизма эритроцитов разной степени зрелости оказывают различные эффекты на эритропоэз: продукты распада нормальных эритроцитов стимулируют эритропоэз, а ретикулоцитов - его тормозят (Новиков Н.М., 1966; Ужанс-кийЯ.Г, 1968).
Исследований, подобных указанным выше, на культурах эритробластических островков, являющихся основными морфофункциональными единицами эритропоэза, в которых в эритроидную дифференциацию вовлекаются КОЕэ, осуществляются процессы размножения эритробластов и их созревание (Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., 1984; Захаров Ю. М., Рассохин А. Г., 2002), не проводилось.Культивирование эритробластических островков в отличие от экспериментов, выполняющихся in vivo, позволяет выявить дозозависимые эффекты вносимых в культуру эритроцитов на функции центральных макрофагов и развитие эритроидной «короны», а также предоставляет возможность для изучения сочетанного влияния гуморальных факторов и клеточно-клеточных взаимодействий на эритропоэз в эритробластических островках.
Цель исследования
Целью настоящей работы явилось изучение возможного влияния
эритроцитов разной степени зрелости (ретикулоцитов, эритроцитов ин-тактных и полицитемичных крыс) на характер пролиферации и созревания эритроидных клеток «короны» эритробластических островков в культуре.
Задачи исследования
-
По воспроизводству ретикулоцитов в культуре эритробластических островков и функциональному состоянию центральных макрофагов эритробластических островков выбрать дозу эритропоэтина, поддерживающую близкий к физиологическому эритропоэз в культуре эритробластических островков.
-
Изучить влияние эритроцитов разной степени зрелости на качественный и количественный состав культур эритробластических островков.
-
Изучить влияние эритроцитов разной степени зрелости на проли-феративную активность клеток «короны» эритробластических островков в культуре.
Научная новизна исследования
Впервые проведённое нами исследование клеточного состава культивационной среды культур эритробластических островков с использованием системы "CELLPRINT ", позволило изучить продукцию зрелых эритроидных клеток культурой островков.
Установлено, что культура эритробластических островков является системой, в которой осуществляется эффективный эритропоэз с воспроизводством ретикулоцитов в объёме, зависящем от внесённой в культуру дозы эритропоэтина и длительности культивирования.
По воспроизводству ретикулоцитов в культуре ЭО и функциональному состоянию центральных макрофагов эритробластических островков установлено, что доза эритропоэтина в 0,5МЕ/мл, является необходимой и достаточной для поддержания эритропоэза, близкого к физиологическому, в культуре ЭО.
Используя оригинальную модель сокультивирования эритробластических островков и эритроцитов in vitro, нам впервые удалось выявить прямые эффекты эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в ЭО. Так, нами установлено, что компонентом регуляции эритропоэза в культивируемых ЭО является механизм авторегуляции на основе положительной и отрицательной обратных связей, реализующихся в зависимости от количества добавленных в культуру эритроцитов, степени их
зрелости и длительности сокультивирования.
В результате проведённых исследований выявлено, что непродолжительная сокультивация ЭО с малыми дозами эритроцитов интактных крыс и ретикулоцитов стимулирует эритропоэз, активизируя процессы реконструкции ЭО. Длительная сокультивация ЭО с возрастающими дозами эритроцитов интактных и анемизированных крыс характеризуется дозозависимым торможением эритропоэза в ЭО.
Кроме того, наши эксперименты показали, что эритроциты полици-темичных крыс уже в малых дозах ингибируют эритропоэз в ЭО. Добавление этих эритроцитов к культурам эритробластических островков уже на 24-й час вызывает усугубляющееся к 72-му часу опыта торможение как реконструкции эритропоэза в инволюцирующих островках, таки формирования островков de novo.
Обнаружено, что сокультивирование небольшого количества как молодых, так и зрелых эритроцитов с эритробластическими островками костного мозга на протяжении суток, увеличивает число находящихся в митозе эритроидных клеток «короны» эритробластических островков и уменьшает продолжительность их клеточного цикла. Более длительное, до 48 часов, сокультивирование островков с таким же количеством молодых эритроцитов или же большим их числом ингибирует эритропоэз, что проявляется в уменьшении количества делящихся эритробластов «короны» островков и увеличении продолжительности их клеточного1 цикла. Наиболее выраженное торможение митотической активности эритробластов вызывает добавление в культуру эритроцитов, полученных у поли-цитемичных крыс.
Научно-практическая ценность работы и внедрение полученных результатов
Результаты работы найдут применение в экспериментальной гематологии, физиологии и патофизиологии, а также в программах подготовки специалистов медико-биологического профиля.
Полученные результаты внедрены в Проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики ЮУНЦ РАМН, в НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.
Положения, выносимые на защиту
1. Культура эритробластических островков костного мозга крыс обеспечивает эффективный эритропоэз в эритробластических островках, за-
канчивающийся воспроизводством ретикулоцитов в количестве, зависящем от внесённого в культуру эритропоэтина и длительности культивирования.
2. Компонентом регуляции эритропоэза в культивируемых эритроб-ластических островках является его авторегуляция на основе управления с использованием механизма положительной и отрицательной обратных связей, реализуемых в зависимости от количества, степени зрелости эритроцитов и длительности их сокультивирования с эритробластическими островками.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертации доложены на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инжиниринг в медицине» (Челябинск, 2002), научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (Трёхгорный, 2003), III конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), международном научном симпозиуме «Югра-Гемо» (Ханты-Мансийск, 2004), международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), научной сессии «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (Челябинск, 2004), III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляцион-ная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004), межрегиональной научно - практической конференции «Актуальные вопросы патологии» (Уфа, 2004).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, пяти глав результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 183 источника (отечественных - 80, иностранных - 103). Работа иллюстрирована 21 рисунком и 35 таблицами.