Введение к работе
Актуальность проблемы. Многофункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) позвоночных принимает участие во многих клеточных процессах, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия (Скабкин и др., 2004). Нокаут гена YB-1 приводит к нарушениям эмбрионального развития и пренатальной или ранней постнатальной гибели животных (Lu et al., 2005; Uchiumi et al., 2006). YB-1 участвует в адаптации клеток к росту при пониженной температуре (Matsumoto et al., 2006), увеличивает их устойчивость к ионизирующей радиации и обработке ксенобиотиками (Ohga et al., 1996). В настоящее время в литературе широко обсуждается роль YB-1 в раковой трансформации (Matsumoto et al., 2005) и воспалительных заболеваниях (Frye et al., 2009; Rauen et al., 2009). Количество YB-1 существенно повышено в некоторых опухолях, поэтому в ряде случаев он рассматривается в качестве одного из ярких маркеров злокачественных новообразований (Bargou et al. 1997; Matsumoto et al., 2005). Переходя из цитоплазмы в клеточное ядро, YB-1 может вовлекаться в репарацию ДНК и активировать транскрипцию генов ряда защитных белков, в том числе и белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость раковых клеток (Kohno et. at, 2003). Поэтому ядерная локализация белка YB-1 является одним из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости (Bargou et al. 1997, Kuwano et al., 2004). Кроме того, известно, что YB-1 принимает участие в метастазировании опухолей. Повышенная экспрессия YB-1 в раковых клетках может приводить к изменению клеточного фенотипа с эпителиального на мезенхимальный и, как следствие, к увеличению подвижности клеток (Evdokimova et al., 2009). Однако в других случаях повышенное содержание YB-1 может предотвращать онкогенную трансформацию клеток по PI3K/Akt сигнальному пути (Bader et al., 2003).
Участие YB-1 в широком спектре внутри- и внеклеточных процессов
объясняется, прежде всего, его уникальной способностью взаимодействовать как
с ДНК и РНК, так и с большим количеством разных белков (Kohno et. at, 2003).
Связываясь с определенными нуклеотидными последовательностями в
промоторах генов, YB-1 позитивно или негативно регулирует транскрипцию
генов, продукты которых участвуют в делении клеток, апоптозе, иммунном
ответе, развитии множественной лекарственной устойчивости и др. (Kohno et. at,
2003). Взаимодействуя с поврежденной ДНК, YB-1 вызывает локальное
плавление двойных спиралей (Izumi et al., 2001; Gaudreault et al., 2004), а также
может стимулировать ферментативную активность ДНК-гликозилаз hNthl, NEIL1 и NEIL2 (Das et al., 2007; Guay et al., 2008; Pestryakov et al., 2012). Все это способствует эффективной репарации. Кроме того, YB-1 ускоряет обмен комплементарных цепей ДНК, и, как предполагается, может участвовать в рекомбинации ДНК (Skabkin et al., 2001).
YB-1 взаимодействует с мРНК на всех этапах ее существования. В ядре он участвует в регуляции альтернативного сплайсинга пре-мРНК (Chansky et al., 2001). В цитоплазме упаковывает мРНК, а также может регулировать ее трансляционную активность, стабильность и локализацию на актиновом и тубулиновом цитоскелетах (Davydova et al., 1997; Evdokimova et al., 2001; Ruzanov et al., 1999; Chernov et al., 2008). Считается, что YB-1 может регулировать функциональную активность мРНК как напрямую, связываясь со специфическими нуклеотидными последовательностями (Skabkina et al., 2005; Giorgini et al., 2001), так и опосредованно. Во втором случае YB-1 за счет своей РНК-шаперонной активности помогает мРНК образовать правильную вторичную структуру, необходимую для узнавания регуляторными белками (Skabkin et al., 2001).
Характер воздействия YB-1 на внутриклеточные процессы зависит от его содержания и локализации. Как правило, основная доля YB-1 находится в цитоплазме, однако в некоторых случаях YB-1 переходит в ядро. Такой переход наблюдается на границе G1/S фаз (Jurchott et al., 2003), при окислительном стрессе, под действием ДНК-повреждающих агентов или при облучении УФ (Stein et al., 2005; Das et al., 2007; Koike at al., 1997), при аденовирусной инфекции (Holm et al., 2002) и в результате взаимодействия YB-1 с некоторыми белками (Raffetseder et al., 2003; Zhang et al., 2003). YB-1 может переходить в ядро после отщепления 20S протеасомой С-концевой последовательности с сигналом цитоплазматического удержания (Sorokin at al., 2005).
Принимая во внимание, что YB-1 участвует в регуляции многих клеточных процессов, следует ожидать, что его количество строго регулируется. Такая регуляция осуществляется как на уровне транскрипции (Shiota et al., 2008; Yokoyama et al., 2003) и трансляции (Fukuda et al., 2004; Hsieh et al., 2012; Kato et al., 2010; Skabkina et al., 2003, 2005; Thoreen et al., 2012), так и за счет изменения стабильности белка (Lutz et al., 2006; Chibi et al., 2008; Sorokin at al., 2005).
Ранее в нашей лаборатории было показано, что специфическая регуляция синтеза YB-1 может происходить под действием двух мажорных белков мРНП: YB-1 и поли(А)-связывающего белка PABP. YB-1 избирательно ингибирует
трансляцию неполиаденилированной (А(-)) мРНК YB-1 (авторегуляция) при сравнительно низких концентрациях этого белка, оптимальных для трансляции большинства других клеточных мРНК. РАВР, наоборот, стимулирует трансляцию этой мРНК. Как ингибирование под действием YB-1, так и стимуляция под действием РАВР наблюдаются на стадии инициации трансляции, на этапе присоединения к мРНК YB-1 43Б-преинициаторного комплекса или на предыдущем этапе взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции (Skabkina et al., 2005; Skabkina et al., 2003). С другой стороны, в 3' нетранслируемой области (НТО) мРНК YB-1 была обнаружена нуклеотидная последовательность с повышенным сродством к YB-1 и РАВР. Было показано, что сайты связывания двух белков на этой последовательности перекрываются, а белки YB-1 и РАВР конкурируют за связывание с ней. Кроме того, было обнаружено, что фрагмент мРНК YB-1 с этой последовательностью ингибирует трансляцию мРНК YB-1, а также других мРНК на стадии инициации. Эта нуклеотидная последовательность была названа регуляторным элементом.
Несмотря на перечисленные данные, механизмы регуляции трансляции мРНК YB-1 изучены недостаточно. Принимая во внимание важную роль YB-1 в клетке, исследование механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1 является актуальной задачей для молекулярной и клеточной биологии.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение молекулярного механизма регуляции трансляции мРНК YB-1. Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи: выяснить (1) действительно ли регуляторный элемент (1127-1204 нт) в 3' НТО А(-) мРНК YB-1 строго необходим для регуляции трансляции под действием YB-1 и PABP; (2) оказывает ли YB-1 прямое негативное действие на трансляцию А(-) мРНК YB-1; (3) оказывает ли PABP прямое позитивное действие на трансляцию А(-) мРНК YB-1; (4) изучить как влияют YB-1 и PABP на трансляцию полиаденилированной (А(+)) мРНК YB-1; (5) проверить, взаимодействует ли регуляторный элемент в 3'НТО мРНК YB-1 с поли(А)-фрагментом; (6) выяснить, как зависит влияние PABP на трансляцию А(+) мРНК YB-1 от длины и нуклеотидной последовательности участка РНК между регуляторным элементом и поли(А)-хвостом (1329-1503 нт).
Научная новизна работы и практическая значимость работы. Данными исследованиями на А(-) мРНК YB-1 установлено, что регуляторный элемент (1127-1204 нт) в 3' НТО строго необходим для специфической регуляции трансляции под действием YB-1 и PABP. Показано, что YB-1 обладает прямым
негативным действием на трансляцию мРНК YB-1. Выяснено, что позитивное действие PABP обусловлено вытеснением YB-1 с регуляторного элемента. Установлено, что PABP не стимулирует трансляцию А(+) мРНК YB-1. Однако трансляция А(+) мРНК YB-1 с удаленным фрагментом (1329-1503 нт) из 3' НТО между регуляторным элементом и поли(А)-хвостом стимулируется PABP, в то время как мРНК с заменой этого участка на неспецифическую последовательность ведет себя как исходная мРНК, т.е. не стимулируется PABP в бесклеточной системе трансляции. Обнаружено, что регуляторный элемент 3' НТО мРНК YB-1 взаимодействует с поли(А)-фрагментом в присутствии белков лизата ретикулоцитов кролика. Предложена модель регуляции трансляции А(+) мРНК YB-1 за счет образования 3' концевой циклической структуры, препятствующей позитивному действию PABP на трансляцию этой мРНК. Обнаруженные молекулярные механизмы регуляции трансляции мРНК YB-1 могут помочь в поиске подходов к лечению онкологических, вирусных и воспалительных заболеваний.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Translational Control» Meeting (Cold Spring Harbor, New York, USA, 2010), III International meeting «Early events in Human Pathologies» (Barbizon, France, 2010), «Protein Synthesis and Translational Control» (EMBL Heidelberg, Germany, 2009), «Protein Synthesis and Translational Control» (EMBL Heidelberg, Germany, 2007), «Translational Control» Meeting (Cold Spring Harbor, New York, USA, 2006), 8th International Engelhardt Conference on RNA - Protein Interactions (Sergiev Pasad, Russia, 2006); на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2009), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино, 2007, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах и 1 статья в периодическом сборнике из списка ВАК.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Список сокращений», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа содержит 147 страниц, 32 рисунка и 4 таблицы.
Похожие диссертации на Действие белков YB-1 и РАВР на трансляцию полиа(-) и полиа(+)мРНК YB-1
