Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. цитоплазматическая вакуолизация, вызванная ксенобиотиками и патогенами 8
2.1 Введение 8
2.2. Сопровождаемая вакуолизацией клеточная гибель под действием ксенобиотиков 9
2.2.1. Метуоз 9
2.2.2. Параптоз 11
2.2.3. Клеточное старение, некроптоз и онкоз 16
2.3. Вакуолизация при бактериальных инфекциях 17
2.3.1. Токсины структурного семейства АВ(5) 18
2.3.1.1. Токсины Stx2 и SubAB 18
2.3.1.2. Токсин CARDS 20
2.3.2. Пороформирующие токсины 21
2.4. Вакуолизация при вирусных инфекциях 25
2.4.1. Вирус лейкемии мышей 26
2.4.2. Вирус гепатита В человека 27
2.4.3. Вирус гепатита С человека и другие флавивирусы 28
2.4.4. Вирус обезьян SV40 29
2.4.5. Вирус папилломы человека 30
2.5. Заключение 31
3. Материалы и методы исследования 33
3.1. Реактивы и материалы 33
3.2. Клеточные линии, бактериальные штаммы, плазмиды и праймеры 33
3.3. Общие методы
3.3.1. Культивирование микроорганизмов и эукариотических клеток 33
3.3.2. Манипуляции с ДНК 3 5
3.3.3. Микроскопия 36
3.4. Определение экспрессии генов пробелокконвертаз, матриксных металлопротеаз и катепсинов В и D на уровне мРНК в опухолевых тканях лёгкого человека 37
3.5. Оценка цитотоксического действия генов исследуемых протеаз 40
3.5.1. Конструирование экспрессионных векторов
3.5.2. Получение моноклональных клеточных линий Tet-Off и Tet-Off Advanced 42
3.5.3. Оценка цитотоксического действия генов исследуемых протеаз на клетки линии НЕК293 Tet-Off 42
3.5.4. Характеристика цитотоксического действия гена ЗСрго на клетки линий А549 и Calu-1 Tet-Off Advanced 43
4. Результаты и обсуждение 46
4.1. Анализ экспрессии генов протеаз в тканях опухолей лёгкого человека 46
4.1.1. Экспрессия гена катепсина D снижена в опухолевых тканях лёгкого человека 46
4.1.2. Изменение экспрессии генов пробелокконвертаз при раке лёгкого человека происходит по ограниченному числу сценариев 50
4.2. Характеристика цитотоксических эффектов генов протеаз 57
4.2.1. Оценка цитотоксических эффектов при транзиентной экспрессии генов протеаз в клетках линии НЕК293 57
4.2.2. Характеристика цитотоксического действия протеазы ЗС вируса гепатита А человека 64
4.2.2.1. Экспрессия генов ЗСрго и ее каталитически неактивного варианта в раковых клетках 65
4.2.2.2. ЗСрго индуцирует каспазонезависимую гибель клеток 68
4.2.2.3. Вызываемые ЗСрго вакуоли формируются из компонентов эндосомалъно-лизосомалъного компартмента 71
4.2.2.4. Вызываемая ЗСрго вакуолизация не зависит от функционирования ГТФаз Rab5 и Rab7 76
4.2.2.5. Аутофагия не существенна для индуцированной ЗСрго вакуолизации и клеточной гибели 77
4.2.2.6. Индуцированные ЗСрго вакуоли не обладают характеристиками деградирующих органелл и не связаны с гиперактивацией макропиноцитоза 77
4.2.2.7. Роль ЗСрго в развитии цитопатического эффекта вируса гепатита А человека 80
4.2.2.8. Заключение 81
5. Выводы 82
6. Благодарности 83
7. Список сокращений 84
8. Список литературы
- Сопровождаемая вакуолизацией клеточная гибель под действием ксенобиотиков
- Вирус гепатита С человека и другие флавивирусы
- Культивирование микроорганизмов и эукариотических клеток
- Оценка цитотоксических эффектов при транзиентной экспрессии генов протеаз в клетках линии НЕК293
Сопровождаемая вакуолизацией клеточная гибель под действием ксенобиотиков
Открытию каспазонезависимой гибели клеток по пути метуоза предшествовало наблюдение о том, что в клетках глиобластом и опухолей желудка чрезвычайно редко встречаются мутации онкогена HRAS [53]. Этот онкоген кодирует ГТФазу H-Ras, участвующую в сигнальных путях регуляции клеточного роста, выживания и дифференцировки. Избыточная активность H-Ras, в сочетании с активностью других онкобелков, способствует злокачественному перерождению клеток. Мутации, приводящие к экспрессии конститутивно активного варианта H-Rasvl2, обнаруживаются приблизительно в 30% раковых опухолей человека. При этом оверэкспрессия H-Rasvl2 в клетках глиобластом и желудочных опухолей вызывает цитоплазматическую вакуолизацию и клеточную гибель [53]. Аналогичное действие на клетки глиобластом оказывает конститутивно активный продукт онкогена KRAS2 - ГТФаза K-RasV12 [54]. Цитотоксические эффекты H-RasV12 и K-RasV12 не зависят от активации сигнального пути Ras-Raf-MEK-ERKl/2 и таких эффекторов H-Ras, как киназа PI3K класса I, ГТФ-связывающий белок RalA [54], ГТФазы RhoA и CDC42. В то же время интенсивность вакуолизации коррелирует с активностью регулирующей макропиноцитоз ГТФазы Racl и зависит от ее взаимодействия с АДФ-рибозилирующим фактором Arf6, которое происходит при участии адапторного белка GIT1 [55].
Белки K-RasV12 и H-RasV12 локализованы в мембранах формирующихся при метуозе цитоплазматических вакуолей [54]. Кроме этого, с мембранами вакуолей ассоциированы мембранный гликопротеин LAMP-1 и ГТФаза Rab7, характерные для лизосом и поздних эндосом. При этом, в отличие от внутренней среды эндосом и лизосом, среда внутри вакуолей не закислена и не содержит активных лизосомальных гидролаз. В то же время вакуоли способны за короткое время накапливать значительное количество внеклеточной жидкости, и их формирование блокируется действием ингибитора макропиноцитоза филипина [56]. Таким образом, совокупность имеющихся данных указывает на происхождение вакуолей из слившихся друг с другом макропиносом, которые приобретают белковые маркеры поздних эндосом и лизосом, но при этом сохраняют незакисленную внутреннюю среду.
К настоящему времени метуоз описан для некоторых типов раковых клеток, и случаи гибели немалигнизированных клеток по этому пути не известны. Возможно, сенсибилизация раковых клеток к метуозу связана с нарушениями регуляции процессов пиноцитоза и эндосомального трафика, сопровождающими процесс малигнизации.
На сегодняшний день способность вызывать метуоз показана только для одного класса ксенобиотиков - производных 1,3-дифенил-2-пропен-1-она, по своей структуре схожих с предшественниками природных флавоноидов [56; 57]. Эти вещества рассматриваются как перспективные противораковые терапевтические средства. При этом молекулярный механизм, по которому эти соединения индуцируют метуоз, не ясен.
Со времени открытия метуоза считалось, что клетка гибнет в результате неконтролируемого накопления макропиносом, которые достигают таких размеров, что физически разрушают клетку. Таким образом, предполагалось, что именно вакуолизация является причиной гибели клеток. Однако в недавнем исследовании цитотоксического действия ряда производных 1,3-дифенил-2-пропен-1-она были обнаружены соединения, вызывающие вакуолизацию макропиносом без цитотоксического действия на клетку [58]. Эти данные свидетельствует об отсутствии прямой связи между вакуолизацией и клеточной гибелью. Таким образом, современные представления о причинах гибели клетки по пути метуоза неверны и должны быть пересмотрены.
Параптоз - клеточная гибель, сопровождаемая увеличением объема клетки, «разбуханием» митохондрий и компонентов эндоплазматического ретикулума. Впервые этот тип гибели был обнаружен при оверэкспрессии рецептора IGF1R в опухолевых и нормальных клетках [59]. Вызываемый IGF1R параптоз опосредован активностью каспазы-9 (но не связан с активацией других каспаз) и требует функционирования систем транскрипции и трансляции [60]. Медиаторами вызываемого IGF1R параптоза являются мультифункциональный белок прохибитин, а также киназы сигнальных путей MAPK/ERK и JNK/SAPK [61]. Блокаторами параптоза являются мультифункциональный адапторный белок AIPl/Alix и фосфатидилэтаноламин-связывающий белок РЕВР-1. Белок AIPl/Alix ингибирует фосфорилирование IGF1R, что предотвращает активацию сигнальных путей киназ MAPK/ERK и JNK/SAPK и блокирует развитие параптоза [60-63]. Белок РЕВР-1 является ингибитором сигнальных путей киназ MAPK/ERK и JNK/SAPK [64; 65]. При параптозе РЕВР-1 ингибирует только сигнальный путь JNK/SAPK и не влияет на каскад MAPK/ERK. Так как РЕВР-1 блокирует сигнальный путь MAPK/ERK за счет взаимодействия с киназой Raf-І, можно предположить, что активация пути MAPK/ERK при параптозе происходит ниже Raf-1 [61].
В последнее время показано, что гибель клетки с характерной для параптоза морфологией может развиваться под действием целого ряда индукторов. Среди них - оверэкспрессия рецепторов TAJ/TROY [66], воздействие эпидермального фактора роста EGF [67; 68], глюкокортикоидов [69] и ряда разнообразных ксенобиотиков [38; 39; 43; 70; 71]. При этом механизмы гибели клеток под действием различных индукторов могут существенно отличаться от параптоза, вызываемого IGF1R. Так, индуцированный IGF1R параптоз не сопровождается фрагментацией хроматина, тогда как параптоз клеток гипофиза крысы линии GH4C1 под действием EGF и клеток D. discoideum при окислительном стрессе идет с расщеплением геномной ДНК, которую осуществляют эндонуклеаза L-ДНКаза-ІІ и фактор индукции апоптоза AIF [67, 68, 72]. Известны случаи, когда морфологически сходная с параптозом гибель не зависит от синтеза белка de novo [73], активации сигнальных путей MAPK/ERK [70] и JNK/SAPK [73; 74]. Морфологически сходная с параптозом гибель может быть опосредована киназой р38 МАРК [45; 71; 75], которая не активируется при параптозе, вызыванном IGF1R. В свете этих данных считается, что к приобретению характерной для параптоза морфологии могут приводить несколько путей клеточной гибели. Так как к настоящему времени эти механизмы полностью не охарактеризованы, для их общего обозначения в литературе закрепилось название «paraptosis-like cell death» - параптозоподобная гибель клеток (ППГ).
Многие ксенобиотики-индукторы ППГ нарушают функционирование системы убиквитин-протеасомной деградации белков (УПД). Среди таких ксенобиотиков наиболее известен куркумин - вещество полифенолового ряда из Curcuma longa. Куркумин оказывает селективное антипролиферативное и цитотоксическое действие на клетки агрессивных злокачественных опухолей молочной железы, пищевода и желудочно-кишечного тракта [76-79]. На основе куркумина создан ряд противораковых препаратов [80; 81].
Куркумин индуцирует активацию киназы JNK, рост концентрации митохондриального Са2+ и образование в митохондриях больших количеств активных форм кислорода (АФК), которые активируют киназу ERK2. Кроме этого, куркумин вызывает снижение уровня экспрессии ингибитора параптоза Alix/AIPl. Активация JNK и ERK2 приводит к дисфункции УПД, что является причиной вакуолизации компонентов ЭПР [82]. Кроме этого, ингибируя УПД, куркумин предотвращает активацию транскрипционного фактора NF-KB [83], который обеспечивает резистентность опухолевых клеток к индукторам клеточной гибели [84]. Примечательно, что вакуолизация ЭПР зависит от активности и ERK2, и JNK, тогда как разбухание митохондрий связано только с активностью ERK2.
Вирус гепатита С человека и другие флавивирусы
Выращивание эукариотических клеток проводили в 24-х и 96-луночных планшетах, 25 см2 и 75 см2 культуральных флаконах (Corning, США) или РОС-ячейках (РеСоп, Германия) с использованием ростовой среды на основе DMEM/F12 (с добавлением 10% ЭТС и 0,3 мг/мл глутамина) при 37С в атмосфере с 5% содержанием СОг. Выращивание культур моноклональных клеточных линий Tet-Off и Tet-Off Advanced проводили с добавлением в ростовую среду антибиотика G418 (0,4 мг/мл на стадии селекции и 0,2 мг/мл при пассировании линий). Замену ростовой среды на свежую проводили каждые 48 ч.
Электрофорез ДНК проводили в 0,8-2% горизонтальном агарозном геле при напряженности электрического поля 5-10 В/см, используя 89 мМ Tris-боратный буфер, содержащий 2 мМ ЭДТА, рН 7,6. Для визуализации ДНК гель после электрофореза выдерживали 5-20 мин в растворе флуоресцентного красителя бромистого этидия с концентрацией 1 мг/мл.
Секвестрование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 и автоматического секвенатора ДНК ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems, США) в Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН..
Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit согласно рекомендациям производителя (MBI Fermentas, Литва).
Введение плазмидной ДНК в клетки Escherichia coli осуществляли методом электропорации с использованием электропоратора MicroPulser 165-2100 (Bio-Rad, США) согласно рекомендациям производителя.
Трансфекцию эукариотических клеток плазмидной ДНК проводили с использованием реагента LipofectaMHH 2000. Клетки культивировали в 24-х и 96-луночных планшетах (Corning, США) или в РОС-ячейках в течение 18-24 ч до достижения 80-90% монослоя. За 3 ч до проведения трансфекции питательнкую среду заменяли на свежую. Комплексы плазмидной ДНК с реагентом Lipofectamin 2000 готовили в бессывороточной ростовой среде OptiMEM согласно протоколу производителя. Клеточные культуры инкубировали с комплексами ДНК-LipofectaMHH 2000 в течение 18-20 ч, после чего питательную среду заменяли на свежую. При проведении котрансфекции плазмиды pBI-EGFP и pBI-EGFP/ЗС брали в соотношении 1:1 к плазмиде pER-RFP и 10:1 к другим плазмидам.
Конфокальную микроскопию проводили с использованием лазерного сканирующего микроскопа Axiovert 100 LSM510 МЕТА (Carl Zeiss, Германия) в центре коллективного пользования Института молекулярной генетики РАН. Наблюдение за культурами клеток и получение изображений проводили при 37С в атмосфере с 5% содержанием СОг. Замедленную киносъемку культур клеток (частота 1 кадр/5 мин) проводили в РОС-ячейках, помещенных в термальный блок Heating Insert Р (РеСоп, Германия). Для наблюдений за общей морфологией клетки культивировали в плоскодонных 24-луночных планшетах. Изображения получали с использованием объектива ЕС Plan-Neofluar 10х/0.30 М27 (Carl Zeiss, Германия). Для анализа клеточных компартментов клетки культивировали в РОС-ячейках. Изображения получали с использованием объективов ЕС Plan-Neofluar 40х/1.30 Oil DIC М27 и ЕС Plan-ApoChromat 63х/0.75 Oil Korr (Carl Zeiss, Германия).
При использовании флуоресцентных белков и красителей применяли следующие конфигурации «длина волны возбуждения/диапазон эмиссии»: 488 нм/510-530 нм для EGFP; 543 нм/615 нм для RFP, mRFP, mKate2, иодида пропидия, нейтрального красного и реагента MR-(RR) из Magic Red Cathepsin В Detection Kit; 514 нм/515-570 нм для YFP и eYFP; 458 нм/ 470-500 нм для CFP; 405 нм/420-480 нм для Хёхст 33258; 405 нм/420-480 нм для ERracker Blue-White DPX; 543 нм/5 80-680 нм для Annexin V СуЗ Assay Kit и реагента FLIC А из Image-IT LIVE Red Caspase Detection Kit; 405 нм/510 нм для красителя люцифер жёлтый.
Ультраструктурний анализ клеток проводили с помощью метода электронной микроскопии совместно с сотрудниками группы электронной микроскопии Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН. Образцы клеток для анализа готовили по стандартной методике. Через 48 ч после трансфекции векторами pBI-EGFP или pBI-EGFP/3C клетки обрабатывали трипсином, осаждали, 3 раза промывали холодным ФСБ и ресуспендировали в фиксирующем растворе (0,2 М какодилатный буфер, 2% глутаровый альдегид, рН 7,5). Для приготовления срезов использовали ультратом LKB III (LKB, Швеция), исследование проводили при ускоряющем напряжении 80 кВ в электронном микроскопе JEM-100CX(JEOL, Япония).
Работа по определению экспрессии генов протеаз в нормальных и опухолевых тканях человека была проведена совместно с сотрудниками Российского онкологического центра им. Н. Н. Блохина РАМН (сбор, гистологическое исследование, заморозка образцов тканей), ИБХ РАН (выделение тотальной мРНК из образцов тканей) и ИМГ РАН (проведение ПНР в реальном времени, анализ данных). Сбор образцов тканей. Образцы опухолевых тканей и прилегающих к ним тканей без гистологических признаков патологии (далее обозначаны как «нормальные ткани») были взяты у 30 пациентов с диагнозом «мелкоклеточная карцинома лёгкого» и «немелкоклеточная карцинома лёгкого» (стадии I-III) во время хирургических операций. Образец ткани без гистологических патологий брали за краем резекции (дистанция между опухолью и зоной отбора нормальной ткани составляла не менее 20 мм). Наблюдение всех пациентов проводилось в Российском онкологическом научном центр им. Н.Н. Блохина РАМН в период с мая 2004 г. по ноябрь 2005 г. На момент проведения хирургических вмешательств пациенты не получали лучевой и химиотерапии. Все пациенты дали письменное информированное согласие на предоставление биологического материала. Исследовательский проект был одобрен этическим комитетом при Российском онкологическом научном центр им. Н.Н. Блохина РАМН.
Каждый образец нормальной и опухолевой ткани разделяли на две части. Одну часть замораживали в жидком азоте для выделения мРНК. Вторую часть отправляли на гистологическое исследование, которое проводилось после прокрашивания парафиновых срезов гемотоксилином и эозином. Образцы опухолевых тканей содержали более 70% малигнизированных клеток. В образцах нормальных тканей малигнизированные клетки не были обнаружены.
Выделение и очистка РНК. Для выделения тотальной РНК образцы тканей измельчали, лизировали с использованем гуанидинизоцианата и подвергали кислофенольной экстракции и удалению полисахаридных примесей [290]. После этого препараты РНК дополнительно очищали с использованием Rnaeasy Minikit (Qiagen, США) и обрабатывали ДНКазой I (Promega, США) согласно рекомендациям производителя. Полученные препараты РНК характеризовали электрофоретически в 1% агарозном геле. Концентрацию РНК определяли спектрофотометр ически.
Культивирование микроорганизмов и эукариотических клеток
В данной работе с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и детекцией продуктов в реальном времени (rtPCR) был проведен анализ экспрессии генов CTSB и CTSD на уровне мРНК в 30 парных образцах опухолевых тканей лёгкого человека и окружающей ткани без гистологических патологий. Все имеющиеся к настоящему времени данные об уровнях экспрессии CTSB и CTSD в опухолях лёгкого получены на уровне белка, в то время как сведения об экспрессии на уровне мРНК отсутствуют. Опубликованные данные свидетельствуют, что содержание CathB в опухолевых тканях лёгкого увеличено [19; 323-328], в ряде случаев коррелирует со стадией опухоли и ее агрессивностью, а также влияет на пост-операционную выживаемость пациентов [323; 326; 329; 330; 331], однако обнаружить такие корреляции удается не во всех случаях [332; 325]. Сведения об уровне CathD в опухолевых тканях лёгкого и корреляциях с характеристиками опухоли также противоречивы [19; 322; 333-335].
В проанализированных нами образцах уровень мРНК CTSB в опухолях по сравнению с окружающей нормальной тканью значительно варьирует (табл. 4.1, рис. 4.1) и не коррелирует с клиническими характеристиками опухоли. В то же время согласно литературным данным, уровень экспрессии CTSB на уровне белка в опухолевых тканях повышен [19; 323; 328; 324-326; 328; 332] и в ряде случаев коррелирует с характеристиками опухоли [325; 332]. Можно предположить, что несоответствие между содержанием мРНК и белкового продукта CTSB объясняются пост-транскрипционной и пост-трансляционной регуляцией экспрессии этого гена. Так, в опухолевых клетках различного происхождения обнаружены альтернативные транскрипты CTSB, для которых характерна повышенная частота инициации трансляции [336]. Кроме этого, секретированный CathB способен связываться с плазматической мембраной опухолевых клеток и за счет этого приобретать повышенную устойчивость к деградации [337].
Уровень мРНК CTSD в опухолях легкого значительно снижен по сравнению с окружающей опухоли нормальной тканью (р 0,01) (табл. 4.1, рис. 4.1). Этот данные не согласуются с результатами большинства опубликованных работ, в которых сообщается о повышенной экспрессии CTSD на уровне белка в опухолях легкого [19; 322; 333; 334; 338; 339]. В то же время с нашими данными согласуются результаты работы Ruibal et al, согласно которой содержание CathD в опухолях легкого снижено [335]. Статистически значимых корреляций между содержанием мРНК CTSD и характеристиками опухолей обнаружено не было, что согласуется с частью опубликованных данных об экспрессии CTSD на уровне белка [322; 333; 335]. Полученные нами данные позволяют предположить, что в клетках опухолей лёгкого экспрессия CTSD, так же как и экспрессия CTSB, регулируется на пост-транскрипционном уровне.
В проведенных ранее исследованиях с помощью измерения протеолитической активности показано, что уровень экспрессии CathD превосходит уровень экспрессии CathB в опухолевых тканях лёгкого [327]. Однако на уровне мРНК мы обнаружили обратную ситуацию. Сопоставление этих данных также позволяет предположить пост-транскрипционную регуляцию экспрессии CTSD и CTSB.
Таким образом, сравнение наших результатов с опубликованными ранее данными демонстрирует значительное различие между экспрессией генов CTSB и CTSD на уровне мРНК и белкового продукта в опухолевых тканях лёгкого человека. Эти различия могут свидетельствовать о регуляции экспрессии генов CTSB и CTSD на пост-транскрипционном уровне. В то же время мы обнаружили, что уровень мРНК CTSD значительно снижен в опухолевых тканях лёгкого. Эти результаты позволяют рассматривать мРНК CTSD в качестве маркера злокачественных тканей легкого человека. 4.1.2. Изменение экспрессии генов пробелокконвертаз при раке лёгкого человека происходит по ограниченному числу сценариев
Пробелокконвертазы (ПК) - семейство белков, объединяющее девять высокоспецифичных субтилизинподобных сериновых эндопептидаз млекопитающих [340]. Ключевой функцией этих ферментов является процессинг и/или активация многочисленных белков и пептидов. Среди эндогенных субстратов ПК - нейропептиды, пептидные гормоны, факторы роста и дифференцировки, адгезивные молекулы, белки внеклеточного матрикса, рецепторы, ферменты, факторы коагуляции крови и плазматические белки. Кроме того, вирусные и бактериальные патогены могут использовать ПК клетки-хозяина для «включения» собственных белков, таких как белки вирусных оболочек или бактериальные токсины. Поскольку активация пробелков в нужном месте и в нужное время, очевидно, является принципиальной для поддержания гомеостаза, то ПК участвуют в контроле разнообразных физиологических процессов как в норме, так и при патологии. При этом ПК как процессирующую систему характеризует сочетание специфичности и избыточности [341]: каждый белок группы обладает уникальными структурно-функциональными особенностями, но в то же время свойства ПК перекрываются. Специфичность и избыточность проявляются не только на уровне субстратной специфичности и клеточной локализации ферментов, но также характерны для временных/тканевых профилей и, вероятно, механизмов регуляции экспрессии генов ПК. Таким образом, определение физиологических свойств ферментов группы и идентификация их природных партнеров являются сложными задачами, которые, по-видимому, могут быть адекватно решены, только если рассматривать ПК как целостную систему.
Многие субстраты ПК ассоциированы с онкологическими заболеваниями. Непосредственное участие в прогрессии опухолей и метастазировании продемонстрировано, например, для инсулинподобного фактора роста 1 (IGF-1) и его рецептора (IGF-1R), трансформирующего фактора роста Р (TGF-P), вазикулярно-эндотелиального фактора роста С (VEGF-C), а также матриксных металлопротеаз (ММП) (для обзора см. [342]). Осуществляя активацию ключевых ассоциированных с раком белков, ПК влияют на пролиферацию, мобильность, адгезивную способность клеток и инвазивность опухоли. Эти данные позволяют рассматривать ПК в качестве перспективных терапевтических мишеней [343].
Впервые данные об ассоциации ПК с раком были опубликованы в 1987 году [344]. С тех пор с применением различных экспериментальных подходов был осуществлен целый ряд исследований, посвященных изучению экспрессии ПК в злокачественных опухолях и поиску корреляций экспрессии ПК с характеристиками опухолей [344-360]. Эти работы показали, в целом, что уровень экспрессии ПК при раке изменен. При этом обнаружены корреляции экспрессии ПК с агрессивностью опухолей [348; 351; 355], выживаемостью [357], а также с нейроэндокринным фенотипом раковых клеток [345; 346; 352]. Это позволяет предложить экспрессионный статус системы ПК в качестве возможного маркера для классификации опухолей и прогноза течения онкологических заболеваний.
Рак лёгкого является наиболее распространенным онкологическим заболеванием, уносящим 1,4 миллиона человеческих жизней ежегодно [361]. Неудивительно поэтому, что именно для этого вида рака были получены первые данные по экспрессии ПК [344-346]. Эти работы, в сочетании с более поздними [347; 350-352], продемонстрировали, что при раке лёгкого изменена экспрессия генов FURIN, PCSK1, PCSK2 и PCSK6. (Здесь и далее обозначения использованных генов даны согласно рекомендациям HUGO Gene Nomenclature Committee, www.genenames.org. Соответствие обозначений распространенным обозначениям белков приведены в таблице 3.3) При этом обнаружено, что уровень экспрессии FUPJN повышен в немелкоклеточных карциномах лёгкого (НМКЛ) по сравнению с мелкоклеточными карциномами лёгкого (МКЛ) [344; 347] и коррелирует с агрессивностью линей клеток рака лёгкого [351]. Экспрессия PCSK1 и PCSK2 преимущественно детектируется в опухолях с нейроэндокринными признаками, в частности в МКЛ [345-347; 350; 352], а экспрессия PCSK6 обнаруживается не во всех опухолях, но при этом в НМКЛ чаще, чем в МКЛ [347]. Таким образом, отклик системы ПК отличается при различных типах рака лёгкого. При этом исследования экспрессии генов с применением микрочипового анализа (включая полногеномные) демонстрируют значительную неоднородность образцов опухолей лёгких [352; 362-365], которая коррелирует с выживаемостью пациентов [362; 363; 365]. Все это позволяет использовать рак лёгких в качестве тестовой системы для оценки информативности подхода, основанного на профилировании экспрессии генов системы ПК.
С этой целью в представленной работе впервые одновременно изучена экспрессия всех генов ПК на уровне мРНК при раке лёгкого с использованием rtPCR. Кроме того, нами исследована экспрессия генов двух матриксных металлопротеаз {ММР2 и ММР14), являющихся субстратами ПК [366-368] и играющих ключевую роль в инвазии и метастазировании опухолей [366].
Оценка цитотоксических эффектов при транзиентной экспрессии генов протеаз в клетках линии НЕК293
Клеточная гибель и цитоплазматическая вакуолизация могут развиваться вследствие нарушения процесса аутофагии [501-504]. Для оценки участия аутофагосом в формировании индуцированных ЗСрго вакуолей был использован специфический для этих органелл белок LC3, слитый с mRFP. Было обнаружено, что слитой белок не накапливается в мембранах, но диффузно распределяется в просвете вакуолей (рис. 4.13 I). Это указывает на участие аутофагосом в образовании вакуолей. Формирование вакуолей с участием аутофагосом наблюдаются при использовании ряда агентов, вызывающих нарушения процесса аутофагии. Для некоторых случаев установлено, что эти нарушения происходят вследствие конститутивной активации сигнального пути киназ ERK1/2. Однако инкубация экспрессирующих ЗСрго клеток с ингибиторами киназ этого сигнального пути (PD98059 и Sc-353669) не предотвращала вакуолизацию и не оказывала заметного влияния на выживаемость клеток. Использование 3-метиладенина - ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы класса 3, предотвращающего образование аутофагосом [505; 506] - также не оказывало заметного эффекта. В то же время инкубация клеток с ингибитором вакуолярной АТФазы бафиломицином А1, часто используемым в качестве блокатора аутофагии [507], полностью предотвращала вакуолизацию, но при этом не оказывала влияния на гибель клеток. Поскольку бафиломицин А1 блокирует не только формирование аутолизосом, но и слияние органелл пути эндоцитоза [508; 509], этот результат, на фоне отсутствия эффекта 3-метиладенина, вновь указывает на формирование вакуолей вследствие слияния органелл эндосомально-лизомального компартмента. Таким образом, полученные данные демонстрируют, что вызываемая ЗСрго вакуолизация и гибель клеток не зависят от аутофагии. Эффект бафиломицина А1 позволяет сделать еще одно важное заключение: вакуолизация не является событием, необходимым для гибели клеток под действием ЗСрго.
Осуществляющие деградацию вне- и внутриклеточного материала лизосомы, поздние эндосомы и аутолизосомы, участвующие в формировании вакуолей, характеризуются кислой внутренней средой и содержат активные гидролазы [510]. Таким образом, можно предположить, что вакуоли также обладают свойствами деградирующих органелл. Для проверки этого предположения был использован флуоресцентный субстрат катепсина В Magic Red и рН-чувствительный краситель нейтральный красный.
Активность катепсина В и локализация кислых органелл в вакуолизированных клетках. Клетки А549/ЗСрго и Calu-1/ЗСрго (72 ч п/т) после инкубации с флуоресцентным субстратом катепсина В Magic Red (M-Red) (А) и рН-чувствительным флуоресцентным красителем нейтральным красным (NR) (В).
Во всех вакуолизированных клетках флуоресцентный продукт гидролиза Magic Red локализовался в отдельных везикулах, большинство из которых находились в движении внутри вакуолей (рис. 4.14 А). В просвете вакуолей и цитоплазме вакуолизированных клеток продукт не детектировался. Это свидетельствует, что характерного для некоторых типов каспазонезависимой клеточной гибели выхода активных лизосомальных протеаз в цитоплазму, по-видимому, не происходит. Обработка клеток нейтральным красным показала, что просвет вакуолей не закислен. В то же время внутри вакуолей наблюдались движущиеся закисленные везикулы (рис. 4.14 В). По-видимому, эти же везикулы содержали активный катепсин В. Интересно отметить, что везикулы, накапливающие субстрат Magic Red и имеющие закисленную внутреннюю среду, наблюдались в основном в вакуолях меньшего размера и практически всегда отсутствовали в больших вакуолях. В то же время в клетках с множеством больших вакуолей такие везикулы либо не обнаруживались, либо были единичными. Считая, что вакуоли большего размера существуют более длительный промежуток времени, можно предположить, что находящиеся внутри вакуолей везикулы постепенно теряют свои деградирующие свойства.
Образование вакуолей, лишенных признаков деградирующих органелл и накапливающих в мембранах Lamp-1 и Rab7, наблюдается при гибели клеток вследствие гиперактивации макропиноцитоза. Этот путь клеточной гибели получил название «метуоз» [511].
Для оценки активности процесса макропиноцитоза в клетках А549/ЗСрго и Calu-1/ЗСрго был использован не способный проникать через клеточную мембрану флуоресцентный краситель люцифер желтый (LY). Инкубация с LY в течение 1-2 часов, проведенная через 48 или 72 ч п/т, приводила к накоплению детектируемого количества красителя лишь в отдельных вакуолях единичных вакуолизированных клеток. Инкубация в течение 12 ч приводила к
Необходимым условием происходящей при метуозе гиперактивации макропиноцитоза является конститутивная активация ГТФазы Racl [55]. Ингибирование Racl или оверэкспрессия доминантно-негативного варианта Racl(N17) предотвращает гиперактивацию макропиноцитоза и метуоз [55]. Однако в нашем случае совместная экспрессия химерного белка YFP-Racl(N17) и ЗСрго не предотвращала вакуолизацию даже в клетках с наибольшим содержанием белка YFP-Racl(N17) (рис. 4.15 В). Аналогично, инкубация клеток с филипином, который за счет связывания мембранного холестерина препятствует формированию макропиносом [512], не влияла на размер и количество вакуолей в клетках А549/ЗСрго и Calu-1/ЗСрго (данные не показаны). Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод о том, что индуцированное протеазой ЗС вируса гепатита А человека формирование вакуолей не является следствием гиперактивации макропиноцитоза, и, таким образом, гибель клеток не происходит по пути метуоза.
Поскольку индуцированные ЗСрго вакуоли имеют не описанные ранее характеристики, то вызываемую ЗСрго гибель клеток не удается отнести ни к одному из известных в настоящее время типов сопровождаемой вакуолизацией каспазонезависимой клеточной смерти. 4.2.2.7. Роль ЗСрго в развитии цитопатического эффекта вируса гепатита А человека
Наиболее важным, на наш взгляд, является вопрос о том, наблюдаются ли обнаруженные нами эффекты ЗСрго при инфекции клеток вирусом гепатита А человека. В изученных случаях для цитопатогенных вариантов вируса гепатита А человека продемонстрирована апоптотическая гибель инфицированных клеток [513-515]. По-видимому, в этих случаях ЗСрго не является основным фактором цитотоксичности этого вируса. При этом ряд вирусов способен вызывать как апоптотическую, так и каспазонезависимую гибель клеток в зависимости от условий инфекции. Переключение на каспазонезависимую гибель происходит, например, при абортивной инфекции полиовирусом [516; 517] или при высоких инфекционных дозах вируса Западного Нила [217]. Таким образом, не исключено, что при определенных условиях инфекции ЗСрго может стать главным цитотоксическим агентом .
Известно, что многие вирусы вызывают цитопатический эффект, который предшествует ее гибели и выражается в характерных изменениях компартментов клетки, [204; 205]. Для морфологии клеток, инфицированных цитопатогенными штаммами вируса гепатита А и других пикорнавирусов, характерны раздувание цистерн ЭПР, формирование многослойных мембранных образований, везикулярных структур и цитоплазматических вакуолей [518-521]. Некоторые из цитопатических эффектов вируса гепатита А вызваны действием вирусных белков 2В, 2С и 2ВС [209; 522; 523]. В то же время данных о причинах возникновения цитоплазматических вакуолей в настоящее время нет. Результаты, полученные в данной работе, позволяют предположить, что ЗСрго участвует в развитии цитопатической морфологии клетки и ответственна за формирование вакуолей при инфекции вирусом гепатита А. О роли ЗС протеаз пикорнавирусов в развитии цитопатической вакуолизации ранее не сообщалось.
В то же время целый ряд белков других вирусов способен вызывать вакуолизацию. Большинство из них, например, большой поверхностный белок вируса гепатита В [227; 524], белок Env вирусов мышиной лейкемии [240-242], белок капсида VP1 вируса SV40 [274], белки Е5 и Е6 вирусов папилломы человека [279; 280; 230] и A38L вируса вакцинии [525], не обладают ферментативной активностью. В то же время вакуолизирующее действие описано для NS3 протеаз некоторых флавивирусов. (Флавивирусы, как и пикорнавирусы, принадлежат к семейству одноцепочечных (+)РНК вирусов, a NS3 протеазы, как и ЗСрго, относятся к структурному семейству химотрипсина [526; 527]). Цитоплазматическая вакуолизация, характерная для инфекции клеток такими флавивирусами, как вирусы гепатита С [212], Западного Нила [217] и лихорадки Денге [216], также наблюдается при индивидуальной экспрессии их NS3 протеаз [528-530].
Похожие диссертации на Протеазы как цитотоксические агенты и маркеры злокачественных опухолей лёгкого
