Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучению вопросов молекулярной эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов в России долгое время уделялось мало внимания. Не было единого подхода в проведении эпидемиологических исследований, большинство результатов основывалось на данных официальной статистики, полученных без использования принятых в развитых странах и рекомендованных ВОЗ методов, таких как: подтверждающие серологические тесты и ПЦР анализ - в диагностике; филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей - в генотипировании образцов; использование программ EpiInfo и SPSS – для статистически значимой оценки факторов риска инфицирования вирусами гепатитов. Проведённые к 2001 году работы по молекулярной эпидемиологии гепатитов В, С и G были единичными в России и охватывали в основном население европейской части страны, тогда как популяции регионов, расположенных за Уралом, были изучены совершенно недостаточно. Крупномасштабных исследований по генотипированию HBV и HGV до публикации результатов наших работ в 2003 году в Российской Федерации не проводилось. В связи с вышесказанным в 2001г нами был начат цикл комплексных молекулярно-эпидемиологических исследований парентеральных вирусных гепатитов В, С и G на территории трех сибирских регионов России – Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края.
Знание особенностей молекулярной эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов на определенной территории имеет важное социальное значение и способствует разработке продуманной стратегии борьбы с этими инфекциями. Особое место в этой борьбе занимает вакцинопрофилактика. Среди исследованных нами трех парентеральных вирусных гепатитов B, C и G вакцина разработана только в случае HBV инфекции.
Для вакцинации против гепатита В в настоящее время повсеместно используется рекомбинантный поверхностный белок HBV (HBsAg), выделенный из культуры клеток дрожжей. Эффективность вакцинации определяется путем измерения концентрации анти-HBs IgG в сыворотке крови (протективный уровень >10 МЕ/л). Однако в течение 5-7 лет после полного курса прививок от 30 до 50 % лиц утрачивают антитела, что ставит вопрос о необходимости ревакцинации [Акимкин, 2004; Yuen et al., 2004]. Вместе с тем установлено, что вакцинация ведет к индукции эффективной и продолжительной иммунологической памяти, которая обеспечивает защиту от инфекции и после утраты антител [Селиашвили и др., 2006; Yuen et al., 2004], но этот критерий защищенности практически не исследован у вакцинированных против гепатита В. Методом его оценки может стать определение индекса HBsAg-специфической стимуляции лимфоцитов периферической крови в ELISPOT анализе.
Создание вакцины против гепатита С - одна из самых насущных задач мирового здравоохранения. Ее решение сдерживается рядом факторов, в числе которых высокий уровень изменчивости вируса. Наибольшая вариабельность наблюдается в поверхностных белках Е1 и Е2 HCV [Simmonds et al., 2005], однако антитела именно к этим белкам обладают вируснейтрализующей активностью [Yu et al., 2004]. В настоящее время идет накопление данных о том, какие районы поверхностных белков вируса гепатита С индуцируют синтез антител с широким спектром действия, способных нейтрализовать различные генотипы и субтипы вируса. Пептиды, имитирующие структуру таких районов, рассматриваются в качестве перспективных компонентов анти - HCV вакцин.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось проведение комплексного молекулярно-эпидемиологического исследования парентеральных вирусных гепатитов на территории сибирских регионов России, а также оценка протективных свойств поверхностных белков вирусов гепатитов В и С.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
1) Организация и проведение молекулярно-эпидемиологических исследований гепатитов В, С и G в Новосибирской, Иркутской областях и Алтайском крае:
постановка методов молекулярно-эпидемиологического анализа в соответствии с рекомендованными ВОЗ и принятыми в развитых странах стандартами (http://www.who.int/chp/steps);
анализ сывороток крови с обязательным использованием двух типов ИФА – скринингового и подтверждающего;
генотипирование изолятов HBV, HCV и HGV с использованием наиболее репрезентативных районов вирусного генома;
создание баз данных в формате EpiInfo, включающее перенос информации со всех бумажных и инструментальных носителей – результаты анкетирования, ИФА, ПЦР и генотипирования изолятов; данные выписки из истории болезни в случае пациентов стационаров - в структурированный электронный формат;
выявление статистически значимых факторов риска инфицирования HBV, HCV и HGV.
2) Оценка напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета методом ELISPOT через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В:
формирование группы участников исследования из сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», вакцинированных против вирусного гепатита В как группы риска инфицирования;
выявление показателей гуморального и клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса иммунизации вакциной Engerix;
оценка применяемой схемы вакцинации и ревакцинации против гепатита В на основе полученных данных.
3) Сравнительный функциональный анализ антител, индуцированных нативными (у инфицированных людей) и рекомбинантными (у иммунизированных мышей) гликопротеинами Е1 и Е2 вируса гепатита С:
пептидное сканирование антигенного профиля нативных поверхностных белков Е1 и Е2 HCV и выявление межгенотиповых различий;
получение рекомбинантных белков Е1 и Е2 HCV в клетках млекопитающих с помощью двух экспрессирующих систем – вирусов Синдбис и осповакцины, сравнение их иммунохимических свойств и антигенного профиля;
картирование вируснейтрализующих линейных эпитопов рекомбинантных белков Е1 и Е2 HCV и оценка их перекрестной активности.
Научная новизна. В данной работе в соответствии с международными стандартами впервые проведено крупномасштабное молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов В, С и G на территории Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края.
Созданы три уникальные электронные базы данных в формате EpiInfo, содержащие эпиданамнез и результаты иммуно- и генодиагностики гепатитов В, С и G среди 5605 представителей разных групп населения Сибирского региона России. В исследование были вовлечены пациенты инфекционных больниц и наркологической клиники; медицинские работники ряда крупных городских и сельских больниц; группы, сформированные по принципу места проживания или места работы.
Впервые получены данные по встречаемости маркеров HBV, HCV и HGV среди представителей разных групп населения трех регионов Сибири. Оценена роль HBV и HCV в этиологии острых и хронических гепатитов на обследованной территории.
С использованием созданных электронных баз данных и статистических мощностей программы EpiInfo-2007 впервые проведена количественная оценка факторов риска инфицирования гепатитами В, С и G в период с 2001 по 2003 гг. Силу статистической связи между каждым фактором риска и статусом по инфекции выражали с помощью отношения шансов (OR, odds ratio).
Впервые проведен анализ генотипического разнообразия сибирских изолятов HBV и HGV, а в случае HCV показано, что встречаемость генотипов существенно различается в разных возрастных и популяционных группах.
Получены новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В. Показано, что клеточное звено вносит существенный вклад в развитие поствакцинального иммунного ответа.
С использованием панели из 76-ти перекрывающихся синтетических пептидов впервые проведен сравнительный полноразмерный анализ антигенного профиля поверхностных белков сибирских изолятов вируса гепатита C трех генотипов 1b, 2a/2c и 3а. Показано, что общие для всех генотипов HCV высокоиммуногенные пептидные эпитопы белков Е1 и Е2 расположены в позициях аминокислот 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400, 430-440 и 680-690 (Е2 белок). Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. В районе 280-290 а.о. белка Е1 выявлена новая антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с генотипа HCV.
С использованием высоковирулентного клона HCV J6/JFH1 и культуры клеток гепатомы человека Huh-7.5 выявлены два новых вируснейтрализующих эпитопа в позициях а.о. 264-318 (Е1 белок) и 496-515 (Е2 белок), первый из которых является генотип-специфическим, а второй – консервативным.
В рамках работы по созданию белковых вакцин против гепатита C был проведен сравнительный анализ двух эукариотических систем экспрессии генов поверхностных гликопротеинов HCV с целью получения белков, наиболее адекватных природным аналогам. Впервые показано, что в одних и тех же клетках млекопитающих (BHK-F) рекомбинантные белки Е1 и Е2 HCV, полученные в системе экспрессии вируса осповакцины (VV), существенно отличаются от аналогичных белков, полученных в системе вируса Синдбис (SIN). Хотя оба препарата белков индуцируют синтез антител к поверхностным гликопротеинам HCV, иммунный ответ к VV-экспрессированным белкам был выше и обладал большей универсальностью в отношении разных генотипов HCV, чем иммунный ответ к SIN-экспрессированным белкам.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенного крупномасштабного молекулярно-эпидемиологического исследования получены статистически значимые количественные оценки дифференцированной встречаемости маркёров парентеральных вирусных гепатитов в различных популяционных группах, заболеваемости острыми и хроническими формами гепатитов, факторов риска и параметров интенсивности циркуляции генотипов HBV, HCV и HGV в период 2001-2003 гг на территории Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края. Результаты исследований были доведены до сведения региональных медицинских служб и главных врачей крупных инфекционных больниц и использовались ими для разработки стратегии борьбы с распространением вирусных гепатитов в регионах Сибири.
В связи с тем, что общим и наиболее значимым фактором риска парентеральных гепатитов В, С и G, а также смешанных инфекций В+С и С+G в Сибири является внутривенное употребление наркотиков, оценки путей заражения и распространения разных типов психотропных препаратов оказались полезны при проведении адресных превентивных программ в сфере контроля за оборотом наркотиков.
Созданные электронные базы данных представляют отдельную как научную, так и практическую ценность. Они могут использоваться для комплексной динамической оценки ситуации по вирусным гепатитам в исследованных регионах России в любом временном периоде.
Показана важность проведения ПЦР-анализа для диагностики наиболее распространенных вирусных гепатитов в случаях наличия клинических проявлений гепатита и отрицательных результатах ИФА на известные вирусные маркеры.
Полученные новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В позволили предложить ряд рекомендаций по проведению ревакцинации в гетерогенных по возрасту, состоянию здоровья, привычкам и степени опасности группах риска инфицирования HBV.
Проведенный сравнительный функциональный анализ рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV показал, что иммунохимические свойства этих белков могут существенно зависеть от системы экспрессии. Причем эффективность продукции, на которую, обычно, исследователи обращают внимание в первую очередь, может быть одинаковой, а свойства белков разные. Данный факт необходимо учитывать при планировании экспериментальных работ с аналогичными мембран-связанными гликозилированными белками.
Картирование позиций высокоиммуногенных линейных эпитопов поверхностных белков Е1 и Е2 сибирских изолятов HCV может быть использовано для совершенствования региональной диагностики гепатита С.
Пептиды, соответствующие новым вируснейтрализующим линейным эпитопам, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов анти-HCV вакцин.
Положения, выносимые на защиту:
1. Внутривенное употребление наркотиков является основной причиной заболеваемости парентеральным вирусным гепатитом С (OR=27.3) и смешанной инфекцией HCV и HBV (OR=10.0) на территории сибирских регионов России в период 2001-2002 гг. Вторым по значимости фактором риска являются инвазивные медицинские процедуры, наибольшую опасность из которых представляет переливание крови (OR=3.8–11.3). Половой путь передачи HBV, HGV и, что особенно важно, HCV является статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах (OR=1.66-2.88).
2. При наличии клинических проявлений гепатита и отрицательных результатах ИФА на известные вирусные маркеры необходимо проведение ПЦР-анализа для выявления геномов наиболее распространенных вирусных гепатитов. Такой подход позволяет дополнительно диагностировать 32.7% случаев острого гепатита и 78.9% случаев хронического гепатита в группах «безмаркерных» пациентов.
3. С увеличением возраста респондентов, инфицированных HCV, растет доля генотипа 1 и снижается доля генотипа 3. Этот сдвиг обусловлен миграцией генотипа 3 HCV из районов производства наркотиков. Около 90% лиц, употребляющих наркотики, попадает в возрастную группу до 35 лет.
4. Генотипирование изолятов HCV (n=818) по двум противоположным районам генома 5’-UTR и NS5В выявило четыре рекомбинантных изолята с генотипами 2k/1b (2) и 2a-2c/1b (2), что ранее являлось крайне редким явлением вследствие генотипирования только по одному району генома – 5’-UTR.
5. Через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В в группе, где концентрация защитных антител была ниже протективного уровня (<10МЕ\л), положительный индекс HBsAg стимуляции лимфоцитов определялся в 72.2% случаев, что достоверно выше (p < 0.05), чем в группе с протективным уровнем анти-HBs IgG (48.1%). Это свидетельствует о важности оценки клеточной составляющей иммунитета при разработке стратегии вакцинации и ревакцинации.
6. Полноразмерное пептидное сканирование антигенного профиля поверхностных белков Е1 и Е2 выявило существенные различия, характерные для сибирских изолятов 1b, 2a/2c и 3a генотипов HCV. Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. Этот факт необходимо учитывать при разработке вакцин против гепатита С.
7. Иммуногенные свойства рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV существенно зависят от эукариотической системы экспрессии, в которой эти белки продуцируются. Рекомбинантные белки, полученные в системе экспрессии вируса осповакцины, обладают большей иммуноадекватностью природным белкам, чем гликопротеины, полученные в системе экспрессии вируса Синдбис.
8. Пептиды, соответствующие новым вируснейтрализующим линейным эпитопам в позициях а.о. 264-318 рекомбинантного белка Е1 и a.о. 496-515 рекомбинантного белка Е2 HCV, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов вакцин против гепатита С.
Апробация результатов диссертации и публикации. Работа представлялась в докладах и постерах на 8 международных и 9 российских конференциях, конгрессах и симпозиумах: на IV конференции по вирусным гепатитам В, С и Д (Москва, 2001); 2-й научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); XIIth International Congress of Virology (Paris, France, 2002); V Российской научно-практической конференции «Гепатит B, C и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2003); 6-м ежегодном съезде Европейского Общества Клинической Вирусологии и 8-ой Конференции по Современной ситуации в области хронических вирусных гепатитов (Лион, Франция, 2003); Международном междисциплинарном конгрессе «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Судак, Крым, Украина, 2004); Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Сосновка, Новосибирская обл., 2004); на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004); на 1-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004); на Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Сосновка, Новосибирская обл., 2005); на Всероссийской конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2005); III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» (Алматы, Казахстан, 2006); Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, Белоруссия, 2007); Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); XIV International Congress of Virology (Istanbul, Turkey, 2008); 16th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses (Nice, France, 2009); American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) annual meeting (Boston, USA, 2010).
По материалам диссертации опубликовано 45 работ, включая 26 тезисов в сборниках конференций и 19 статей, из которых 15 опубликованы в журналах списка, рекомендованного ВАК, 2 статьи опубликованы в международных журналах Antiviral Therapy и Journal of Medical Virology.
Работа выполнена в 1998-2010 гг. в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в рамках научных тем организации, по гранту Американского Фонда Гражданских Исследований и Развития (CRDF) №RB0-893 «Совместный эпидемиологический проект по изучению вирусного гепатита С», по грантам Международного научно-технического центра (МНТЦ) № 1637p «Изучение частоты встречаемости, распределения генотипов и молекулярной вариабельности изолятов вируса гепатита С в сибирских регионах России» и № 3255р «Исследование иммунологических и структурных свойств рекомбинантных белков Е1 и Е2 ВГС экспрессированных в клетках млекопитающих».
Результаты, представленные в диссертации, получены лично автором, под ее руководством и в соавторстве с к.х.н. Г.Ф. Сиволобовой (раздел 3.1-3.2 и 5.2), к.б.н. А.А. Гражданцевой (раздел 3.1-3.2; 4.2 и 5.3-5.4), к.б.н. А.В. Качко (раздел 3.3.4; 3.5.3; 5.5), к.ф.-м.н. А.Н. Шваловым (раздел 3.5 и 5.1), Т.А. Лупан (раздел 5.2.1), к.б.н. А.В. Шустовым (раздел 3.3.2), к.м.н. И.В. Плясуновой (раздел 3.3.2-3.3.3), к.б.н. Р.Б. Баяндиным (раздел 3.3.1), Е.В. Чуб (раздел 3.3.2), А.В. Ивановой (раздел 5.2.2), к.б.н. В.А. Терновым (раздел 3.2.5), А.Е. Нестеровым (раздел 4.3-4.4), к.б.н. О.В. Носаревой (раздел 4.3-4.4), Л.А. Акинфеевой (раздел 3.2). Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за сотрудничество.
Автор искренне признателен врачам, оказавшим помощь в выполнении данной работы: к.м.н. В.М. Гранитову, Н.Г. Клиновенко, к.м.н. О.И. Матрос, к.м.н. И.А. Хорошиловой (г. Барнаул); Л.И. Губановой, А.П. Четверикову, Ю.А. Данилову, В.В. Леоненко (г. Иркутск); В.Г. Орловскому, М.В. Алешиной, В.И. Кузубову, Л.И. Локтевой, Р.П. Алейникову (р.п. Кольцово); Е.Г. Сахаровой, Н.Я. Черноусовой, И.В. Красильниковой, Д.И. Козлову, Т.Г. Бурмистровой, Т.Г. Томиленко, Я.С. Ульяновой, Е.А. Фихман, О.В. Мельниковой, Т.А. Масленниковой, А.Г. Лебедеву (г. Новосибирск).
За сотрудничество в работе автор признателен и благодарен своим американским коллегам Dr. Stephen M. Feinstone (зав. лабораторией вирусов гепатитов, FDA, USA) и Dr. Marian E. Major (ведущий специалист лаборатории вирусов гепатитов, FDA, USA).
Автор искренне благодарит своих консультантов д.б.н., профессора, члена-корреспондента РАН С.В. Нетесова и д.б.н., профессора В.Б. Локтева за научное руководство и помощь в организации работ, представленных в диссертации.
Структура и объем работы. Диссертация построена по монографическому типу и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 347 страницах, включая 43 рисунка, 31 таблицу, 449 библиографических ссылок. Нумерация рисунков и таблиц приводится отдельно для каждой главы.
