Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 19
1.1. Гепатит В 19
1.1.1. Эпидемиология гепатита В 19
1.1.2. Вирус гепатита В 23
1.1.3. Диагностика гепатита В 31
1.1.4. Скрытая ВГВ-инфекция 33
1.1.5. Профилактика гепатита В 38
1.1.6. Терапия гепатита В 43
1.2. Гепатит дельта 47
1.2.1. Клинические особенности, диагностика и терапия гепатита дельта 47
1.2.2. Вирус гепатита дельта 50
1.2.3. Эпидемиология гепатита дельта 52
1.3. Гепатит С 56
1.3.1. Эпидемиология гепатита С 56
1.3.2. Вирус гепатита С 60
1.3.3. Диагностика гепатита С 65
1.3.4. Моделирование ВГС-инфекции 68
1.4. Гепатит А 71
1.4.1. Эпидемиология гепатита А 71
1.4.2. Вирус гепатита А 78
1.4.3. Профилактика инфицирования ВГА 85
1.4.4. Надзор за циркуляцией вируса гепатита А с помощью методов молекулярно-биологического анализа 87
1.5. Гепатит Е 93
1.5.1. Клинические особенности и диагностика гепатита Е з
1.5.2. Вирус гепатита Е 95
1.5.3. Эпидемиология гепатита Е 100
Глава 2. Материалы и методы 106
2.1. Обследованные группы лиц 106
2.1.1. Пациенты с хроническим гепатитом В 106
2.1.2. Лица, относящиеся к группам повышенного риска инфицирования ВГВ 109
2.1.3. Пациенты с хроническим гепатитом дельта 111
2.1.4. Пациенты с хроническим гепатитом С 112
2.1.5. Пациенты с гепатитом А 113
2.1.6. Пациенты с гепатитом Е 114
2.1.7. Лица, относящиеся к условно-здоровому населению РФ 116
2.2. Образцы, полученные от животных 119
2.2.1. Образцы сывороток крови домашний уток 119
2.2.2. Образцы фекалий свиней 119
2.2.3. Образцы воды 120
2.3. Методы исследований 121
2.3.1. Сбор и преаналитическая обработка образцов 121
2.3.1.1. Образцы сыворотки крови 121
2.3.1.2. Образцы биопсии печени 121
2.3.1.3. Образцы фекалий 122
2.3.1.4. Хранение образцов и данных
2.3.2. Серологические маркеры вирусных гепатитов 122
2.3.3. Выделение нуклеиновых кислот
2.3.3.1. Выделение нуклеиновых кислот из образцов сыворотки крови 123
2.3.3.2. Выделение нуклеиновых кислот из образцов фекальных экстрактов 124
2.3.3.3. Выделение нуклеиновых кислот из образцов биопсии печени 124
2.3.3.4. Выделение нуклеиновых кислот из образцов воды 124
2.3.4. Молекулярные маркеры вирусных гепатитов 125 2.3.4Л. Выявление РНК ВГА 125
2.3.4.2. Выявление ДНК ВГВ 126
2.3.4.3. Выявление ДНК ВГВ уток 128
2.3.4.4. Выявление РНК ВП 129
2.3.4.5. Выявление РНК ВГС 130
2.3.4.6. Определение генотипа ВГС 131
2.3.4.7. Выявление РНК GBV-B 133
2.3.4.8. Выявление РНК ВГЕ
2.3.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 135
2.3.6. Анализ нуклеотидных последовательностей 136
2.3.7. Создание химерных вирусоподобных частиц HBc/GBV-Bcore 144
2.3.8. Моделирование инфекции GBV-C на игрунковых обезьянах 146
2.3.9. Моделирование инфекции ВГВУ 147
2.3.10. Методы статистического анализа 148
Результаты исследований 149
Глава 3. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита В 149
3.1. Выявление ВГВ-инфекции 149
3.1.1. Распространенность скрытой ВГВ-инфекции 149
3.1.2. Контроль чувствительности тест-систем для выявления HBsAg 174
3.2. Терапия гепатита В 178
3.2.1. Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ 179
3.3. Контроль эффективности противовирусных препаратов, направленных против ВГВ 191
3.3.1. Разработка системы оценки вируцидной активности дезинфицирующих средств с помощью модели in vivo инфекции вируса гепатита В уток 191
3.3.2. Оценка эффективности вирусной инактивации в препаратах плазмы крови донорской крови с помощью модели in vivo инфекции вируса гепатита В уток 197
Глава 4. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита дельта 203
4.1. Распространенность маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения Российской Федерации 203
4.2. Анализ случаев хронического гепатита дельта в Республике Тыва 207
Глава 5. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита С
5.1. Определение генотипа ВГС 210
5.2. Межгенотипическая рекомбинация ВГС 222
5.3. Разработка суррогатной модели ВГС-инфекции и оценка возможностей ее применения 226
Глава 6. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита А 235
Глава 7. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита Е 240
7.1. Частота выявления антител к вирусу гепатита Е среди условно здорового населения 240
7.2. Циркуляция вируса гепатита Е среди свиней в РФ 247
7.3. Случаи спорадической и групповой заболеваемости ГЕ в РФ 257
Обсуждение результатов исследований 264
Выводы 309
Список цитированной литературы
- Клинические особенности, диагностика и терапия гепатита дельта
- Лица, относящиеся к группам повышенного риска инфицирования ВГВ
- Контроль чувствительности тест-систем для выявления HBsAg
- Разработка суррогатной модели ВГС-инфекции и оценка возможностей ее применения
Введение к работе
Актуальность проблемы
Генетическое разнообразие является одним из важнейших факторов, определяющим особенности циркуляции вирусов, в том числе гепатотропных. Инфекции, вызываемые вирусами гепатита А, гепатита В и гепатита С, являются социально-значимыми в силу их широкого распространения и тяжести ассоциированного заболевания. Значимость инфекций, вызываемых вирусами гепатита дельта и вируса гепатита Е, возросла в последние годы с накоплением данных об их распространенности за пределами гиперэндемичных регионов и увеличении доли этих инфекций в структуре вирусных гепатитов. Само понятие «вирусные гепатиты» сегодня еще более сложное, чем 10 - 15 лет назад. Накапливаются сведения о влиянии гетерогенности популяций возбудителей вирусных гепатитов на развитие инфекционного и эпидемического процессов заболеваний, которые они вызывают. Применение методологического и аналитического арсенала молекулярной биологии и эпидемиологии способствует развитию понимания закономерностей циркуляции вирусов, вызывающих гепатит, и позволяет оптимизировать систему контроля этих инфекций.
Новые данные о циркуляции и генетическом разнообразии гепатотропных вирусов, полученные с помощью молекулярно-биологических методов и приемов молекулярной эпидемиологии, значительно расширяют возможности контроля вирусных гепатитов и переводят его из разряда эмпирических действий в систему, базирующуюся на знании биологических закономерностей. Так, в случае гепатита В (ГВ) на данных молекулярной диагностики базируется изучение скрытой HBsAg-негативной формы инфекции и лекарственной устойчивости вируса гепатита В (ВГВ), генотипического разнообразия и рекомбинантных форм вируса гепатита С (ВГС). Понимание заложенных в геноме вируса способов избегать негативного влияния, и, как следствие, сохранения возбудителя как биологического вида, является основой диагностики и персонифицированной терапии вирусных гепатитов.
Другим важным аспектом контроля вирусных гепатитов является надзор за инфекциями и их регистрация. Две инфекции - гепатит дельта (ГБ) и гепатит Е (ГЕ) не регистрируются в Российской Федерации (РФ) как самостоятельные нозологические формы. Сведения о циркуляции вирусов TD и ГЕ и их генетическом разнообразии на
территории РФ представляют ценность как для теоретической вирусологии, поскольку расширяют современные представления об эпидемиологии данных инфекций, так и для практического здравоохранения, так как помогают выявить группы риска и потенциальные источники инфицирования, а также указывают на необходимость внедрения и расширения диагностики TD и ГЕ.
Полноценный эпидемиологический анализ, направленный на выявление источников и путей передачи инфекции, не возможен без анализа нуклеотидных последовательностей возбудителя. В РФ в силу большего числа случаев заболевания, географической удаленности и небольшого числа центров, способных проводить подобный анализ, оперативное применение методов молекулярной эпидемиологии при расследовании случаев гепатита А (ГА) является скорее исключением, чем правилом. Очевидно, что успешный контроль данной инфекции возможен только при создании обширной базы данных последовательностей вируса гепатита А (ВГА), циркулирующих на территории РФ, и включении молекулярных методов в систему эпидемиологического анализа случаев ГА.
Изучение многих аспектов вирусных гепатитов человека - оценки эффективности вакцинных и терапевтических препаратов, дезинфектантов, инфекционных свойств агентов, - невозможно без моделирования инфекции на животных. Альтернативой недоступной в настоящее время модели ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных является применение суррогатных моделей животных, например, инфекции игрунковых обезьян (тамаринов и мармозет), вызываемой вирусом GBV-B. Для ГВ удобной суррогатной моделью является инфекция, вызываемая вирусом гепатита В уток (ВГВУ). Молекулярно-биологические методы позволяют детально охарактеризовать модельные инфекции и оценить возможности их применения в системе контроля вирусных гепатитов.
Цель и задачи исследования
Цель работы - разработка комплекса мер по оптимизации системы контроля вирусных гепатитов, основанного на молекулярной диагностике и эпидемиологии данных инфекций.
Для достижения выбранной цели были поставлены и решены следующие задачи: 1. Определить распространенность скрытой ВГВ-инфекции в Российской Федерации, оценить ее значимость с точки зрения диагностики гепатита В и изучить
роль мутаций, связанных с «иммунологическим бегством», в развитии скрытой ВГВ-инфекции.
-
Провести сравнительные испытания различных тест-систем для детекции HBsAg и оценить их чувствительность при выявлении мутантных вариантов вируса гепатита В.
-
Изучить распространенность первичной лекарственной устойчивости вируса гепатита В на основании анализа частоты выявления и спектра связанных с лекарственной резистентностью мутаций в гене полимеразы вируса гепатита В у пациентов, не получавших терапию аналогами нуклеоз(т)идов.
-
Разработать систему оценки эффективности вирусной инактивации и дезинфекции с помощью модели in vivo инфекции вируса гепатита В уток.
-
Определить распространенность маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения Российской Федерации и проанализировать случаи хронического гепатита дельта в гиперэндемичном по гепатиту В регионе Российской Федерации (на примере Республики Тыва):
Определить частоту выявления анти-ВГБ и РНК BID среди HBsAg-
положительных лиц, выявленных при обследовании условно-здорового населения шести регионов Российской Федерации с различной интенсивностью циркуляции ВГВ (Московской, Свердловской, Ростовской областей, Республики Саха (Якутия), Республики Тыва, Хабаровского края);
Изучить генотипическое разнообразие вируса гепатита дельта, циркулирующего в
Республике Тыва, определить частоту коинфекции ВГВ/ВГБ и клинические исходы данной коинфекции в динамическом наблюдении.
-
Изучить структуру генотипов вируса гепатита С, циркулирующего на территории Российской Федерации, и ее изменения на протяжении последних пяти лет (2007-2011гг.).
-
Выявить и охарактеризовать случаи межгенотипической рекомбинации вируса гепатита С.
-
Разработать суррогатную модель ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных, основанную на экспериментальном заражении игрунковых обезьян (мармозета обыкновенная, Callithrix jacchus) вирусом GBV-B, и оценить возможности применения данной модели для оценки эффективности подходов к созданию прототипной вакцины против гепатита С:
Воспроизвести экспериментальную инфекцию GBV-B на мелких приматах (мармозета обыкновенная, Callithrix jacchus) и определить основные характеристики модельной инфекции у данного вида животных (продолжительность виремии, клинические проявления, эволюция возбудителя на протяжении инфекции);
Создать прототипный вакцинный препарат против GBV-B-инфекции на основе химерных вирусоподобных частиц, несущих В- и Т-клеточные эпитопы капсидного белка GBV-B, встроенные в носитель (капсидный белок вируса гепатита В);
Оценить иммуногенные и протективные свойства полученного препарата в эксперименте in vivo на игрунковых обезьянах.
-
Усовершенствовать алгоритм расшифровки вспышек гепатита А с применением молекулярно-эпидемиологического анализа, включающего выявление РНК вируса гепатита А в объектах внешней среды и сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вирусов, выделенных от заболевших и из потенциальных факторов инфицирования (объектов среды).
-
Изучить интенсивность циркуляции вируса гепатита Е на территории Российской Федерации:
Определить частоту выявления антител к вирусу гепатита Е среди условно здорового населения шести географически удаленных регионов Российской Федерации (Московской, Свердловской, Ростовской областей, Республики Саха (Якутия), Республики Тыва, Хабаровского края);
Выявить и охарактеризовать случаи спорадической и групповой заболеваемости ГЕ в РФ;
Определить распространенность вируса гепатита Е среди свиней в РФ и проанализировать генетические варианты вируса, выделенные от людей и животных.
Научная новизна
На основании новых данных по молекулярной биологии и эпидемиологии вирусных гепатитов разработан комплекс мер по усовершенствованию диагностики, профилактики и надзора за этими инфекциями.
Впервые проведен анализ распространенности скрытой HBsAg-негативной ВГВ-инфекции среди различных когорт, относящихся к условно-здоровому населению и к группам риска инфицирования ВГВ. Впервые установлено, что частота обнаружения скрытой ВГВ-инфекции определяется чувствительностью тестов, применяемых для выявления HBsAg. С помощью серологических и молекулярных тестов доказано, что применение даже самых чувствительных на сегодня методов детекции HBsAg не позволяет выявлять все случаи ВГВ-инфекции. Впервые проведен анализ нуклеотидных последовательностей генома ВГВ, выделенных от случаев скрытой инфекции на территории РФ. Полученные результаты продемонстрировали, что основной причиной развития скрытой формы ВГВ-инфекции является не наличие мутаций в а-детерминанте HBsAg, а низкий уровень вирусной репликации и продукции HBsAg.
Впервые получены данные о распространенности мутаций в геноме ВГВ, связанных с первичной лекарственной устойчивостью вируса. Показано, что доля случаев первичной лекарственной резистентности достигает 6,2% среди пациентов с ВГВ-моноинфекцией и 10,0% - среди пациентов с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией. Проведенный впервые анализ распространенности лекарственной резистентности ВГВ в разных регионах РФ указывает на вероятность потенциального увеличения доли резистентных штаммов ВГВ в общей популяции в результате длительного применения антивирусных агентов прямого действия.
Впервые получены данные о распространенности на территории РФ инфекции ВГВ уток (ВГВУ). Описан первый отечественный штамм ВГВУ, депонированный под названием «Уфа-04» во Всероссийском государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ ВГНКИ). Проведенные исследования позволили воспроизвести и внедрить в систему оценки вирусной инактивации лабораторную модель ВГВУ-инфекции, являющейся суррогатной моделью инфекции ВГВ человека.
Впервые получены данные о распространенности маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения регионов РФ, различающихся по заболеваемости гепатитом В. Данные по частоте выявления анти-ВГБ среди детей в возрасте до 10 лет являются первым документированным свидетельством защиты с помощью вакцинации против гепатита В от инфицирования ВГБ.
На основании результатов пятилетнего наблюдения за структурой генотипов ВГС впервые показано увеличение доли генотипа 1а в общей структуре генотипов. Получены новые данные о циркуляции рекомбинантного варианта ВГС RF_2k/lb; установлено, что все известные в настоящее время изоляты ВГС 2k/lb, по-видимому, являются потомками одного события рекомбинации.
Впервые воспроизведена инфекция GBV-B на обыкновенных мармозетах (Callifrix jacchus) и определены основные характеристики модельной инфекции GBV-B у данного вида животных - продолжительность виремии, клинические проявления, эволюция возбудителя на протяжении инфекции. Впервые разработана прототипная вакцина против модельной инфекции GBV-B, основанная на вирусоподобных частицах ВГВ, несущих В- и Т-клеточные эпитопы GBV-B, для оценки возможности применения данного подхода к созданию вакцины против гепатита С. Несмотря на недостаточные протективные свойства созданного вакцинного препарата, результаты эксперимента впервые продемонстрировали, что GBV-B-инфекция является ценной моделью для оценки перспективности различных подходов к созданию вакцины против гепатита С.
Впервые определена возрастная иммуноструктура вируса гепатита Е (ВГЕ) на территории Российской Федерации, выявлены возрастные группы и регионы, в которых анти-ВГЕ встречаются наиболее часто. Данные о выявлении анти-ВГЕ IgM среди условно-здорового населения являются первым прямым свидетельством о преимущественно бессимптомном протекании ВГЕ-инфекции в неэндемичных регионах. Получены новые данные о циркуляции ВГЕ среди свиней - установлено, что на большинстве обследованных свиноферм в РФ присутствует ВГЕ-инфекция, которая выявляется преимущественно у животных в возрасте 2-4 месяцев. Впервые получены данные о генотипическом разнообразии ВГЕ в регионе, установлено, что выделенные на территории РФ от людей и животных изоляты вируса принадлежат генотипу 3. Впервые продемонстрировано существование специфичных для каждого региона РФ вариантов ВГЕ.
Выявленные случаи спорадической и групповой заболеваемости гепатитом Е на неэндемичных по данной инфекции территориях, данные об интенсивной циркуляции ВГЕ среди свиней и о широкой распространенности пост-инфекционных антител к ВГЕ среди населения РФ позволяют пересмотреть существующие взгляды на эпидемиологию гепатита Е на неэндемичных территориях.
Практическая значимость
Применение молекулярно-биологического подхода позволило расшифровать крупную вспышку гепатита А в Москве и Московской области, произошедшую в 2010г. Продемонстрировано преимущество методов преданалитической подготовки образцов воды с высоким фактором концентрирования для проведения поиска ВГА в образцах воды и смывах с объектов внешней среды при расшифровке вспышек гепатита А.
Установлено, что именно чувствительность ИФА-тестов для выявления HBsAg, а также включение в список мишеней этих тестов мутантных форм является ключевым моментом при диагностике ВГВ-инфекции. Тем не менее, продемонстрировано существование случаев скрытой инфекции, несмотря на применение для определения HBsAg высокочувствительных тестов, позволяющих выявлять основные мутации, связанные с «иммунным бегством». Эти данные указывают на важность скрининга донорской крови не только на HBsAg, но и на ДНК ВГВ для максимального снижения риска посттрансфузионного гепатита В.
Доказана необходимость проведения аттестации диагностикумов для определения HBsAg с помощью панелей нативных образцов, поскольку применение рекомбинантных антигенов для этой цели менее информативно.
Полученные данные об относительно широком распространении первичной лекарственной устойчивости ВГВ позволяют рекомендовать проведение анализа на наличие лекарственной резистентности для пациентов с ХГВ до начала проведения терапии. Такой анализ обеспечит адекватный подбор препарата ПОТ и позволит избежать применения заведомо неактивного противовирусного препарата.
Разработана система оценки эффективности вирус-инактивирующих препаратов, направленных против ВГВ, основанная на моделировании in vivo инфекции вируса гепатита В уток. Данная система валидирована для проведения испытаний дезинфицирующих препаратов, а также агентов для вирусной инактивации в службе крови, и включена в Методические указания по изучению и оценке вирулициднои активности дезинфицирующих средств 3.5.2431-08.
Продемонстрирована необходимость обязательного скрининга на антитела к ВГБ всех лиц, положительных по HBsAg, а также регистрации гепатита дельта как отдельной нозологической формы в системе Государственного статистического наблюдения.
Установлено, что для рутинного генотипирования ВГС оптимальными с точки зрения чувствительности и специфичности являются системы генотипирования, мишенью которых является область core генома ВГС.
Разработана и успешно апробирована экспериментальная GBV-B инфекция у обыкновенных мармозет (Callifrix jaccus). Опыт применения данной суррогатной модели ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных продемонстрировал, что она является удобным инструментом для оценки перспективности различных подходов к созданию вакцины против ГС.
Установлена необходимость включения диагностики гепатита Е в систему дифференциальной лабораторной диагностики гепатитов на территории Российской Федерации. Создана рабочая коллекция изолятов ВГЕ, выделенных на территории Российской Федерации. Собранная коллекция изолятов ВГЕ может применяться для проведения эпидемиологического анализа случаев гепатита Е и при разработке вакцины против этой инфекции.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Разработан комплекс мер по оптимизации системы контроля вирусных гепатитов, основанный на применении новых технологий диагностики, изучения генетической изменчивости вирусов и разработки биологических моделей этих инфекций.
-
Существование случаев скрытой HBsAg-негативной инфекции, распространенность которой достигает 2% даже при применении тестов для определения HBsAg с чувствительностью 0,01 нг/мл, указывает на необходимость внедрения одновременного определения ДНК ВГВ и HBsAg для диагностики гепатита В. Основной причиной развития скрытой формы ВГВ-инфекции является не наличие мутаций в а-детерминанте HBsAg, а низкий уровень вирусной репликации и продукции HBsAg.
3. Первичная лекарственная устойчивость ВГВ - относительно широко
распространенное явление, в связи с этим представляется целесообразным проведение
скрининга на лекарственную устойчивость ВГВ до начала противовирусной терапии для
выбора адекватного препарата. Анализ первичной лекарственной устойчивости в
регионах РФ позволяет прогнозировать увеличение доли резистентных штаммов.
4. Экспериментальная инфекция ВГВ уток (ВГВУ) in vivo, являющаяся суррогатной
моделью ВГВ-инфекции человека, является оптимальным инструментом для оценки
эффективности противовирусных препаратов разных классов, направленных на инактивацию ВГВ.
-
Необходимо введение официальной регистрации гепатита дельта как самостоятельной нозологической формы и обязательного тестирования всех позитивных по HBsAg лиц на маркеры ВГБ (анти-ВГБ, РНК ВГБ) для максимально ранней диагностики этой прогностически неблагоприятной инфекции. Вакцинации новорожденных против гепатита В обеспечивает эффективную защиту от инфицирования ВГБ.
-
В Московском регионе наблюдается тенденция к увеличению доли генотипа 1а в структуре генотипов ВГС, при этом соотношение других генотипов вируса остается стабильным.
-
Рекомбинантная формы ВГС RF_2k/lb возникла в результате одного события рекомбинации и является устойчивой конкурентоспособной формой, циркулирующей среди инъекционных наркоманов.
-
Суррогатная модель ВГС-инфекции, основанная на экспериментальном заражении игрунковых обезьян (мармозет обыкновенных, Callithrix jaccus) вирусом GBV-B, является удобным инструментом для оценки перспективности подходов к созданию вакцины против гепатита С.
-
Выявление вирусного генетического материала в объектах внешней среды и филогенетический анализ геномных последовательностей ВГА, выделенных от заболевших и из объектов среды, должны быть включены в систему надзора за гепатитом А.
-
Значительная доля населения страны сталкивается на протяжении жизни с ВГЕ, при этом зачастую инфекция протекает бессимптомно, однако на негиперэндемичных по ГЕ территориях возможны автохтонные случаи как спорадической, так и групповой заболеваемости. Все автохтонные случаи ГЕ вызваны 3 генотипом ВГЕ.
-
ВГЕ распространен среди домашних свиней в РФ повсеместно, преимущественно инфицированы животные в возрасте 2-4 месяца, не достигшие возраста забоя. Для каждого региона РФ существуют, в рамках 3 генотипа вируса, специфичные варианты ВГЕ.
Апробация работы
Основные положения и фрагменты диссертации представлялись на 6 международных и 11 российских конференциях, конгрессах и симпозиумах: V
Российская научно-практическая конференция «Гепатит В, С и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2003); 1 Iі International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses (Heidelberg, Germany, 2004); VI научно-практический симпозиум «Клиническая лабораторная диагностика» (Москва, 2005); 12 International Viral Symposium on Viral Hepatitis and Liver Diseases (Paris, 2006); VII Российская научно-практическая конференция «Гепатит В, С и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2007); 15і International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses (San Antonio, USA, 2008); 13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (Washington, USA, 2009); 16-ая Российская гастроэнтерологическая неделя (Москва, 2010г.); EASL Monothematic Conference: Delta Hepatitis (Istanbul, Turkey, 2010); 16-й Конгресс «Гепатология сегодня» (Москва, 2011); Вторая международная конференция «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской приматологии» (Сочи-Адлер, 2011); 17-ая Российская гастроэнтерологическая неделя (Москва, 2011г.); IX Российская научно-практическая конференция «Гепатит В, С и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2011); 13-ый Международный Славяно-Балтийский научный форум «Санкт-Петербург - Гастро-2011» (Санкт-Петербург, 2011); 17-й Конгресс «Гепатология сегодня» (Москва, 2012); Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012); 14і International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (Shanghai, China, 2012).
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 27 работ, из них в журналах, рекомендованных ВАК - 12.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов, иллюстрирована 63 таблицами и 46 рисунками. Библиография включает 439 источников.
Клинические особенности, диагностика и терапия гепатита дельта
Очевидно, что наблюдаемая в настоящее время благоприятная тенденция к снижению заболеваемости ОГВ, приведшая к более чем 10-кратному уменьшению числа регистрируемых случаев ОГВ в 2010г. по сравнению с годом пиковой заболеваемости (1999г.) обусловлена действием как внешних факторов, так и внутренней эпидемиологической закономерности. Внешними факторами, приведшими к снижению заболеваемости ОГВ, являются внедрение скрининга донорской крови на HBsAg и начало массовой вакцинации - вакцина против ГВ была включена в Национальный календарь профилактических прививок в декабре 1997г. специальным приказом Минздрава РФ №375, что в дальнейшем (в сентябре 1998г.) было закреплено в Федеральном законе «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней». Эпидемиологическим фактором, повлиявшим на снижение заболеваемости ОГВ в РФ, является насыщение восприимчивой популяции. Дело в том, что рост заболеваемости ОГВ, отмечавшийся в конце 1990-х гг., был связан с ростом в стране внутривенной наркомании. Доля наркозависимых лиц среди инфицированных ВГВ в 1999 и 2000 гг. составляла 34% и 35%, соответственно, а в некоторых регионах РФ, например, в Уральском ФО, достигала в 2000 г. 54%. Однако меры, принятые по борьбе с наркоманией, а также быстрое распространение ВГВ-инфекции в популяции вовлеченных в наркоманию лиц привело к снижению доли наркозависимых лиц среди больных ОГВ, начиная с 2002 г. [5]. В настоящее время в РФ отмечается преобладание в структуре путей передачи ВГВ полового пути при сохраняющемся значении инфицирования посредством внутривенного введения психоактивных препаратов [5].
Снижение заболеваемости ОГВ, наблюдаемое в настоящее время в РФ, не является поводом для оптимистического взгляда на проблему ГВ, поскольку заболеваемость хроническим ГВ (ХГВ) не снижается, и даже имеет некоторую тенденцию к увеличению. В 1999г. на фоне активного распространения ГВ в стране началась официальная регистрация хронических гепатитов. В период с 1999 по 2001гг. показатель заболеваемости ХГВ закономерно рос, поскольку отражал улучшение диагностики, выявление накопившихся на территории случаев ХГВ и объективный рост числа хронических случаев инфекции, который в свою очередь был следствием роста числа случаев ОГВ. В последующие годы (2000 - 2010гг.) уровень регистрации вновь выявленных случаев ХГВ находился примерно на одинаковом уровне и незначительно колебался в пределах 14-15 случаев на 100 000 человек (Рисунок 2).
Динамика заболеваемости ХГВ в РФ в 1999 - 2009 гг. (по материалам Государственного статистического наблюдения) [5].
Высокий уровень заболеваемости ХГВ, наблюдаемый в настоящее время в РФ, создает общую высокую нагрузку ВГВ на популяцию, неблагоприятный прогноз по заболеваемости циррозом и ГЦК, большое количество источников инфекции в популяции - все это определяет значимость оптимизации диагностики, внедрения программ терапии ХГВ и реализации программы массовой вакцинации для зашиты восприимчивых лиц. 1.1.2. Вирус гепатита В
Вирус гепатита В (ВГВ) относится к семейству Hepadnaviridae, представленному двумя родами: Avihepadnaviridae, включающему вирусы гепатита В птиц (уток, гусей, цапель, журавлей, аистов), и Ortlwhepadnaviridae, включающему вирусы гепатита В млекопитающих - североамериканских лесных сурков (woodchuck hepatitis В virus, WHV), наземных белок (ground squirrel hepatitis В vims, GSHV) и собственно вирус гепатита В человека. Для представителей семейства Hepadnaviridae характерен ограниченный спектр возможных хозяев. Так, вирус гепатита В уток (ВГВУ) способен инфицировать лишь несколько видов уток, а ВГВ — только человека и шимпанзе [151].
Геном ВГВ представлен неполной кольцевой ДНК (нпкДНК) длиной около 3200 нуклеотидов. Находящаяся в зрелой вирусной частице недостроенная плюс-цепь ДНК ВГВ имеет РНК-праймер на 5 -конце. Минус-цепь на 5 -конце ковалентно связана с N-концевым доменом вирусной полимеразы (Рисунок 3).
Взаимное расположение открытых рамок считывания ДНК ВГВ [151]. ORF -открытая рамка считывания ДНК ВГВ кодирует четыре частично перекрывающиеся открытые рамки считывания, названные в соответствии с транслируемыми с них белками: Р (вирусная полимераза), S (поверхностный белок), С (мономер вирусного капсида) и X (Х-белок). Участкам, кодирующим С- и S-белок, предшествуют участки ргеС и preS (разделенный на preSl и preS2), соответственно.
Транскрипция, инициированная с preC-участка, приводит к экспрессии секреторного белка НВе, по своей структуре и функции отличного от С-белка. Транскрипция preSl- и preS2/S-y4acTKOB приводит к экспрессии трех вариантов поверхностного белка: большого, среднего и малого (LHBsAg, MHBsAg и SHBsAg). Помимо упомянутых открытых рамок считывания, в геноме вируса присутствуют регуляторные элементы: два энхансера и четыре промотора (preC/C, preSl, S и X). Использование нескольких старт-кодонов и перекрывание открытых рамок считывания обуславливает экспрессию семи различных белков при небольшой протяженности (порядка 3200 нуклеотидов) вирусного генома [45].
Лица, относящиеся к группам повышенного риска инфицирования ВГВ
Во время антивирусной терапии обычно наблюдают ранний вирусологический ответ (РВО), определяемый как снижение на два или более десятичных логарифма (lg) уровней РНК ВГС через 12 недель терапии. Отсутствие РВО рассматривают как достоверный прогностический фактор недостижения УВО, в этом случае терапию пегилированным интерфероном и рибавирином рекомендуется прекращать [278]. Быстрый вирусологический ответ (БВО), то есть отсутствие выявляемых уровней РНК ВГС через 4 недели терапии, является определяющим прогностическим фактором достижения УВО [172]. Определение вирусной кинетики в последнее время стало применяться для выбора более персонализированной продолжительности терапии при использовании новых антивирусных препаратов прямого действия для лечения ХГС [169, 312].
Помимо определения вирусной нагрузки важнейшим клинически значимым фактором является генотип ВГС, поскольку генотипы вируса различаются по степени чувствительности к интерферону. Подтверждено, что независимо от типа терапии (комбинированная терапия пегилированным интерфероном и рибавирином или монотерапия интерфероном), пациенты лучше всего отвечают на лечение, если они инфицированы генотипом 2, несколько хуже, если - генотипом 3, и гораздо хуже - если присутствует инфекция 1 и 4 генотипов ВГС [380]. Поэтому для пациентов, инфицированных генотипами 2 и 3, рекомендуемая продолжительность терапии интерфероном составляет 24 недели, а для пациентов, инфицированных другими генотипами (в первую очередь, генотипом 1) - 48 недель [278].
В связи с этим принципиально важным моментом является точность генотипирования ВГС. «Золотым стандартом» определения генотипа ВГС является анализ нуклеотидной последовательности участка NS5B вирусного генома, однако в рутинной диагностике применять данный подход затруднительно. Многие коммерческие тесты, основанные на ПЦР с генотип-специфичными праймерами, а также на обратной гибридизации, в качестве матрицы используют 5 -нетранслируемую область генома ВГС. Однако оказалось, что тесты, основанные на анализе изменчивости этого участка, неправильно классифицируют новые генотипы 7, 8 и 9 как генотип 1, а также во многих случаях не способны правильно дифференцировать субтипы 1а и lb [135]. Последнее особенно неприемлемо, поскольку показано, что субтипы 1а и lb по-разному отвечают на новые антивирусные препараты прямого действия [135].
Таким образом, вопрос о наиболее адекватном методе генотипирования ВГС в рутинной клинической практике остается открытым. 1.3.4. Моделирование ВГС-ипфекции
Изучение многих аспектов ВГС-инфекции затрудняется отсутствием клеточных культур, поддерживающих репликацию ВГС, а также модели инфекции на мелких лабораторных животных. Единственным восприимчивым в инфицированию ВГС животным является шимпанзе, эксперименты на которых ограничиваются малой доступностью этих животных и этическими аспектами. Тупайи {Tupaia sp.) оказались восприимчивыми к заражению ВГС после курса иммуносупрессии, однако персистирующую инфекцию на этих близких приматам животных воспроизвести не удалось [424]. Определенный успех достигнут по воспроизведению ВГС-инфекции на трансгенных мышах uPA/RAG-2, которым подсаживали человеческие гепатоциты. В условиях жесткой иммуносупрессии гепатоциты человека замещали гепатоциты мыши, что делало возможным моделирование ВГС-ассоциированного цирроза и ГЦК [254].
Создание системы репликона ВГС стало ключевым моментом в изучении ВГС [39, 220]. В данной системе структурный участок генома ВГС был заменеу последовательностью, кодирующей ген неомицин фосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к селективному агенту G418. Экспрессия неструктурных белков ВГС направляется с IRES вируса энцефаломиокардита, встроенного ниже гена неомицин фосфотрансферазы. Трансфекция клеток Huh-7 приводит к появлению устойчивых к G418 колоний, в клетках которых реплицируется РНК ВГС. Для данной системы описаны адаптивные аминокислотные замены в геноме ВГС, связанные с повышенной эффективностью репликации [219]. Благодаря системе репликона впервые стало возможно изучение репликации ВГС in vitro, взаимодействие между клеткой и вирусом, а также оценка активности антивирусных препаратов [259].
Система репликона не позволяет изучать процессы инфицирования и проникновения вируса в клетку, а также выход вирионов из клетки. T.Wakita с соавторами создали репликон на основе полного генома ВГС генотипа 2а (штамм JFH-1), выделенного из сыворотки крови больного фульминнатным ГС [406]. Данная система продемонстрировала эффективную репликацию в разных типах клеток. Кроме того, трансфекции клеток полноразмерной последовательностью штамма JFH-1 приводит к продукции инфекционных вирусных частиц, что позволяет говорить о полученном в клеточной культуре ВГС, позволяющему проведение пассажей in vitro [437].
Для изучения иммунитета к ВГС и оценки свойств вакцин и противовирусных препаратов недостаточно модели инфекции in vitro. Альтернативой недоступной в настоящее время модели ВГС-инфекции на мелких животных является применение суррогатных моделей животных, например, инфекции игрунковых обезьян (тамаринов и мармозет), вызываемой вирусом GBV-B [43, 61]. GBV-B является наиболее филогенетически близким ВГС агентом, степень сходства аминокислотной последовательности этих двух вирусов достигает 25-30% [264]. Хотя GBV-B до настоящего времени не был выделен ни от одного дикого животного, по-видимому, этот агент является вирусом обезьян Нового Света, вызывающим у них острый самопрекращающийся гепатит [60]. Это единственный, кроме ВГС, известный в настоящее время представитель флавивирусов, способный вызывать гепатит, поэтому GBV-B и ВГС выделены, вместе с открытым в 2011 г. вирусом собак, генетически близким ВГС [181], в отдельный род Hepacivirus [361] (Рисунок 10).
Контроль чувствительности тест-систем для выявления HBsAg
Первое разрезание полипротеина происходит по границе 2А/2В, и, в отличие от других пикорнавирусов, осуществляется протезой ЗСрго [235]. Получившийся структурный предшественник Р1-2А далее разрезается вирусной протеазой на два предшественника капсидных белков: VPO (VP4-VP2) и VP1-2A, а также зрелый капсидный белок VP3 (Рисунок 4). VP1-2A является необходимым структурным промежуточным элементом при морфогенезе вириона [84]. Разрезание по границе VP1/2A происходит на поздних этапах морфогенеза вириона и осуществляется неустановленной в настоящее время клеточной протеазой [91]. Однако, зрелый белок 2А никогда не выявляется в инфицированных ВГА клетках. Кроме того, показано, что репликация вирусной РНК не снижается при удалении 60% С-терминальной последовательности 2А [84]. Таким образом, неструктурный белок 2А не является необходимым для синтеза РНК элементом. Это отличает биологию ВГА от других хорошо изученных пикорнавирусов, таких как полиовирус.
Большинство пикорнавирусов имеют четыре полипептида в составе своего капсида, в том числе небольшой белок VP4, расположенный на амино-конце полипротеина (Рисунок 14). Полипротеин ВГА содержит очень короткий полипептид VP4, и предполагаемый белок VP4 никогда не обнаруживается в очищенных препаратах вируса [237]. Кроме того, если у других пикорнавирусов N-терминальное миристилирование белка VP4 является необходимым условием для морфогенеза вирионов, в последовательности VP4 ВГА отсутствует сигнал миристилирования [378]. Причины отличия механизма сборки вирусных частиц ВГА от других пикорнавирусов не ясны, но, по-видимому, связаны с уникальным для ВГА жизненным циклом, проходящим в гепатоцитах [237].
Аналогично другим пикорнавирусам, а также другим вирусам гепатита, например, вирусу гепатита С, 5 -нетранслируемый участок геномной РНК ВГА содержит внутренний сайт посадки рибосом (IRES), который напрямую соединяет рибосому с вирусной РНК. Таким образом, трансляция ВГА является кэп-независимой [58].
Первые данные о генетическом разнообразии ВГА были основаны на анализе отдельных участков вирусного генома, таких как С-терминальный фрагмент VP3 [171], N-терминальный фрагмент VP1 [325] или участок на границе VP1-2A [324]. Поскольку ВГА и полиовирус имеют много сходных черт, разные штаммы ВГА группировали на основании анализа последовательности участка VP1-2A, используя метод Рико-Гесса с соавторами, применявшийся в то время критерий генетической классификации штаммов полиовируса [321]. В соответствии с данным подходом, в 1992 году на основании генетического анализа 152 штаммов ВГА из разных регионах мира, были выделены семь генотипов ВГА (I—VII). Данная работа Robertson с соавторами в значительной мере определила дальнейшее направление исследований в этой области [324]. Однако, большинство включенных в данное исследование штаммов ВГА происходили из США и Азии, тогда как многие гиперэндемичные по ВГА регионы, такие как Южная Америка, Северная и Центральная Африка, Индия, не были представлены [91].
Позднее, Costa-Mattioli с соавторами [88,89] провели филогенетический анализ, основанный на полных последовательностях VP1 (900 нуклеотидов). Авторами было показано существование пяти отдельных генетических групп, поддержанное высокими значениями генетического группирования [89]. Оказалось, что варианты ВГА, ранее выделявшиеся в самостоятельные генотипы II and VII, имеют большую степень сходства и представляют собой два субтипа в рамках генотипа II [223]. На основании этих данных была предложена новая классификация ВГА, включающая шесть генотипов ВГА -три генотипа ВГА человека (I-III) и три генотипа ВГА обезьян (IV-VI) [91].
Генотипы I и III являются наиболее распространенными генотипами ВГА человека. Три обезьяньих генотипа ВГА были идентифицированы на основании уникальных нуклеотидных последовательностей в участках Р1 генома ВГА, и все они были выделены от разных видов приматов Старого Света. Кроме того, все изоляты ВГА обезьян имеют особую последовательность в участке на границе VP3/VP1, отличающую их от ВГА человека [388]. Генотип IV был выделен от яванской макаки (Масаса fasicularis), импортированной с Филиппин [270]. Прототипный штамм генотипа V, АЗМ27 (AGM27), был выделен от африканской зеленой мартышки (Cercopithecus aethiops), импортированной из Кении [388]. Генотип VI также был выделен от яванской макаки (М. fasicularis), импортированной из Индонезии [324].
Многие приматы как Старого, так и Нового Света оказались восприимчивыми к инфицированию ВГА человека. Это позволило моделировать in vivo инфекцию ВГА наразных видах приматов, в том числе мелких (игрунковых обезьянах) для оценки иммуногенности и протективных свойств вакцин против ГА, антивирусной активности противовирусных препаратов и т.д. [10].
Ранее предполагалось, что гепатовирусы встречаются только у приматов, однако анализ геномной последовательности вируса гепатита уток 1 типа (DHV-1) позволил классифицировать его как единственного на данный момент представителя нового рода Avihepatovirus (гепатовирус птиц) семейства Picornaviridae. В результате данный вирус был переименован в вирус гепатита А уток (DHAV) [297].
Разные генотипы ВГА различаются по географическому распространению [271]. На Рисунке 15 представлено распределение генотипов ВГА в разных регионах мира. Субтип IA является самым распространенным в мире и встречается чаще по сравнению с субтипом IB. Оба субтипа, IA и IB, наиболее распространены в Северной и Южной Америках, Европе, Китае и в Японии [324, 89].
Разработка суррогатной модели ВГС-инфекции и оценка возможностей ее применения
Нуклеотидные последовательности участков вирусного генома, выделенных из сывороток крови пациентов, имевших HBsAg, филогенетически анализировались с целью определения генотипов и субтипов ВГВ, циркулирующих на территории Республики Тыва. Сопоставление с референсными последовательностями различных генотипов ВГВ позволило отнести их к генотипу D, серотипам ayw2 и ayw3 ВГВ.
Анализ данных, представленных в амбулаторых картах обследованных лиц, показал, что у 23 из 61 (37,7%) лиц с наличием HBsAg имелись данные о проведенной ранее вакцинации против ГВ. Анализ нуклеотидных последовательностей S-гена, выделенных от таких пациентов, показал отсутствие мутаций иммунного бегства, способных вызвать нарушение нейтрализации вируса поствакцинальными антителами.
Таким образом, после исключения из исследования 61 пациента, положительного по HBsAg, распространенность скрытой ВГВ-инфекции оценивали среди 481 HBsAg-негативных лиц, проживающих в Республики Тыва.
На втором этапе обследования данной группы проводился скрининг образцов сыворотки крови на анти-НВс. Этот маркер был выявлен в 81,1% (390/481) образцов.
На основании результатов анкетирования и скрининга анти-НВс был проведен анализ влияния возраста, пола, места проживания обследованных лиц и факторов риска инфицирования вирусами с парентеральной передачей на частоту выявления данного маркера встречи с ВГВ (Таблица 32).
Таким образом, единственным фактором, статистически достоверно связанным с наличием «изолированных» анти-НВс в сыворотках крови обследованных лиц, проживающих на территории Республики Тыва, является возраст, то есть длительность проживания на эндемичной по ГВ территории.
В соответствии с выбранным алгоритмом, третьим этапом исследования являлось определение ДНК ВГВ в образцах сыворотки крови, положительных по анти-НВс. Среди 390 HBsAg-негативных анти-НВс-позитивных лиц ДНК ВГВ была выявлена в двух случаях. Таким образом, частота выявления скрытой ВГВ-инфекции в гиперэндемичном по ГВ регионе составила 0,42 % (2/481).
Анализ факторов риска и признаков манифестации ВГВ-инфекции, проведенный на основании анкетных данных, показал, что у обоих пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией отсутствовали в анамнезе симптомы гепатита и вакцинация против ГВ. У одного пациента в анамнезе также отсутствовали такие факторы парентеральной передачи ВГВ, как гемотрансфузии, хирургические вмешательства и татуировки, тогда как у второй пациент подтвердил перенесенные хирургические операции и наличие татуировок.
В образцах сыворотки крови пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией определяли вирусную нагрузку ВГВ методом ПЦР с детекцией в реальном времени, а также наличие мутаций в нуклеотидных последовательностях S- и Р- генов ВГВ. Вирусная нагрузка в обоих образцах составила менее 1000 копий ДНК ВГВ/мл. Анализ нуклеотиднои последовательности амплифицированного фрагмента вирусной ДНК показал принадлежность образцов к разным генотипам ВГВ: D и А, и серотипам aywl и adwl соответственно (Таблица 33). Серотип вируса определялся по нуклеотидным последовательностям, кодирующим аминокислоты, находящиеся в 122, 127, 134, 159 и 160 позициях S-антигена согласно методам, предложенным Н. Norder [282].
В таблице 33 представлены аминокислотные замены (определены по нуклеотиднои последовательности) в HBsAg и вирусной полимеразе относительно референсных последовательностей. Единственная выявленная замена в а-детерминанте HBsAg, присутствующая в образце 600 (Y134F), согласно литературным данным встречается в популяции «дикого типа» вируса и не может являться причиной снижения эффективности детекции HBsAg в иммуноферментных тест-системах. Данная замена определяет принадлежность к серотипу ВГВ aywl, нехарактерному для РФ. Однако данный серотип включен, согласно паспорту тест-системы, в перечень мишеней применявшегося ИФА-теста для выявления HBsAg, и, следовательно, не может являться причиной «скрытой» формы ВГВ-инфекции. Таким образом, единственным объяснением отрицательного результата выявления HBsAg в данных образцах может быть низкая вирусная нагрузка ВГВ, и, как следствие, низкая концентрация HBsAg, находящаяся ниже порога чувствительности применявшейся тест-системы (то есть менее 0,01 нг/мл).
В исследование скрытой ВГВ-инфекции были также включены пациенты с ХГС, наблюдавшиеся в инфекционном отделении Поликлиники при управлении делами Президента РФ, г. Москва. Критериями включения в исследование были: В соответствии с описанными критериями в исследование были включены 200 пациентов, в возрасте от 20 до 92 лет (в среднем - 38 лет), половой состав группы: мужчин - 119 (59,5%), женщин — 81 (40,5%). Частота выявления «изолированных» анти-НВс в данной группе пациентов составила 48% (96/200). Поскольку в литературных данных появились сведения о возможности выявления скрытой ВГВ-инфекции у пациентов с ГС, не имеющих анти-НВс [68], в данной группе пациентов проводили тотальный скрининг ДНК ВГВ методом ПЦР вне зависимости от результатов определения анти-НВс.
Ни у одного из пациентов в данной группе ДНК ВГВ выявлена не была. Таким образом, случаи скрытой ВГВ-инфекции среди 200 пациентов с ХГС на неэндемичной по ГВ территории (г.Москва и Московская область) выявлены не были.
Третьей группой, включенной в исследование третьей фазы изучения скрытой ВГВ-инфекции, являлись 50 HBsAg-негативных пациента с хроническими заболеваниями печени (ХЗП), распространенными на территории РФ, наблюдавшихся в отделении гастроэнтерологии и гепатологии ГКБ №12 Департамента здравоохранения г. Москвы (клиническая база кафедры госпитальной терапии лечебного факультета №2 Российского Государственного медицинского университета им. Н.Н. Пирогова, зав. кафедрой - академик РАМН, проф. Г.И. Сторожаков). Возраст обследуемых составил от 19 до 77 лет (в среднем - 46,5, стандартное отклонение - 13,3). Для данных пациентов по показаниям, связанным с основным заболеванием, дополнительно проводилось исследование образцов биопсии печени. Распределение нозологических форм в данной группе представлено на рисунке 20.
